一种人肝癌细胞衍生生长因子编码序列、 其编码的多肽及制备方法 本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及一种人肝癌细胞衍生生长因子(HDGF3)的cDNA序列，该蛋白是小鼠HRP-2的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的应用以及所述多核苷酸和所述多肽的制备方法。
研究已表明，细胞生长的调节是通过各种细胞因子与其特异的膜表面受体作用后引发的一系列级联反应实现的。在肿瘤细胞中，某些级联反应的失控致使细胞持续增殖。在肝癌细胞中，人们已经发现一些自分泌和旁分泌细胞因子(Proc．Natl． Acad．Sci．83：2448-2452，1986；Proc．Natl．Acad．Sci．86：7432-7436，1989；Cell 61：1137-1146，1990)。肝癌细胞衍生生长因子(HDGF)是在无血清培养的人肝癌细胞株系HuH-7中找到的一个细胞因子，它具有肝素结合能力并能刺激Swiss 3T3细胞的DNA合成(J．Biol．Chem．269(40)：25143-25149，1994)。
1989年Nakamura等人首次从HuH-7细胞中部分纯化并鉴定了HDGF(Clin．Chim．Acta．183：273-284，1989)，1994年该实验组又完整克隆了HDGF的cDNA序列(J．Biol．Chem．269(40)：25143-25149，1994)，1997年该实验组在小鼠中找到了HDGF的同系物并发现了该基因家族的另两个成员HRP-1、HRP-2，它们都具有一个相当保守地98个氨基酸长的氨基端序列(Biochem．Biophys．Res．Commun．238：26-32，1997)，1999年该实验组又在人和小鼠中克隆到了HDGF基因家族的另一个成员HRP-3(Biochem．Biophys．Res．Commun．266(1)：81-87，1999)。在本发明被公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的人HDGF3。
本发明的目的在于提供一种新的人肝癌细胞衍生生长因子多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码小鼠HRP-2蛋白的同源蛋白，该多核苷酸序列被命名为人HDGF3。
本发明的另一个目的是提供一种新的人肝癌细胞衍生生长因子的蛋白，该蛋白被命名为人HDGF3。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人HDGF3蛋白的方法。
本发明还提供了这种人HDGF3基因序列和蛋白的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人HDGF3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No．5中从核苷酸6-2033位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID No．5中从核苷酸6-2033位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No．6所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No．5中从核苷酸6-2033位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的HDGF3蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID No．6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No．6序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有HDGF3蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：
(a)将编码具有HDGF3蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成HDGF3蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No．5中从核苷酸6-2033位的核苷酸序列有至少70％的同源性；
(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成HDGF3蛋白的重组细胞；
(c)在适合表达HDGF3蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；
(d)分离出具有HDGF3蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为2118个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO．5，其中开放读框位于6-2033位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“HDGF3蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有HDGF3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No．5中6-2033位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID No．5序列的编码框6-2033位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No．5中6-2033位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID No．6所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳地，在高度严谨条件下与SEQ ID No．5中从核苷酸6-2033位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID No．5中从核苷酸6-2033位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与人HDGF3相同功能的蛋白的SEQ ID No．5中开放读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和／或取代，以及在5’和／或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的20％，较佳地50％，更佳地80％，最佳地90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“HDGF3蛋白多肽”指具有HDGF3蛋白活性的SEQ ID No．6序列的多肽。该术语还包括具有与人HDGF3相同功能的、SEQ ID No．6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和／或取代，以及在C末端和／或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时(最好按表1所示进行)，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和／或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括HDGF3蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与HDGF3 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗HDGF3多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含HDGF3多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了HDGF3多肽的可溶性片段。通常，该片段具有HDGF3多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供HDGF3蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然HDGF3多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括HDGF3多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内HDGF3的表达。
本发明还包括可用作探针和引物的核酸分子，该分子通常具有HDGF3多肽编码序列的约8-100个，较佳地约15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码HDGF3的核酸分子。
本发明还包括检测HDGF3核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于HDGF3多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
本发明还包括对HDGF3 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于HDGF3基因产物或片段。较佳地，指那些能与HDGF3基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制HDGF3蛋白的分子，也包括那些并不影响HDGF3蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的HDGF3基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No．4，946，778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的HDGF3基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达HDGF3或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6：511，1976；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N．Y．，1981)。本发明的抗体包括能阻断HDGF3功能的抗体以及不影响HDGF3功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用HDGF3基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与HDGF3基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E．coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明HDGF3与小鼠HRP-2的核苷酸序列的同源比较见表2。其中，相同的核苷酸用“︱”标出。
本发明HDGF3与小鼠HRP-2蛋白的氨基酸序列的同源比较见表3。其中，相同的氨基酸用“︱”标出，相似的氨基酸用“．”标出，小鼠HRP-2蛋白的核定位信号用标出。
本发明HDGF3与HDGF家族成员氨基酸序列氨基末端高度保守序列比较见表4。其中，相同的氨基酸用“*”标出；相似的氨基酸用“．”标出。
在本发明中，人HDGF3的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人睾丸λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用寡核苷酸A1：5’-TCAGCATGCCACACGCCTTCAAG-3’(SEQ ID No．1)和B1：5’-GACTCCGACTCCAAGGCCGATTC-3’(SEQ ID No．3)为正向引物，寡核苷酸A2：5’-CTTCACAGACACATCGGAGTCGG-3’(SEQ ID No．2)和B2：5’-TCTCTGCTCTGCTTTCCTGCGAG-3’(SEQ ID No．4)反向引物，进行PCR，PCR条件均为93℃4分钟，随之以93℃1分钟，68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片段，为约800和1400bp的目的片段。然后用限制性酶NocI对两者进行酶切、连接，得到目的cDNA序列及杂带。杂带可用电泳等方法去除，从而得到浓度较高的目的cDNA序列。
肝癌细胞衍生生长因子(HDGF)是从人的肝癌细胞株HuH-7中分离到的肝素结合蛋白，它具有刺激细胞生长的活性，能够促进成纤维细胞和一些肝癌细胞的生长。HDGF的C端的酸性氨基酸尾和．HMG-1／-2高度同源，而这段序列已知是组蛋白结合区域，因此HDGF很有可能作为转录因子发挥其刺激细胞生长的活性。HDGF的有丝分裂原活性使其在急性恶性肝炎和肝损伤的治疗上存在着极大的应用价值。
HDGF家族的已知各成员的表达模式是不同的，但是它们在睾丸中都有很高程度的富集，而且它们的5’非翻译区均有高于70％的GC比，因而在雄性生殖细胞发育过程中有重要功能，并和DNA甲基化，染色质构象以及翻译调控相关。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
HDGF3的cDNA序列的克隆和测定
1．引物扩增
以人睾丸λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用寡核苷酸A1：5’-TCAGCATGCCACACGCCTTCAAG-3’(SEQ ID No．1)和B1：5’-GACTCCGACTCCAAGGCCGATTC-3’(SEQ ID No．3)为正向引物，寡核苷酸A2：5’-CTTCACAGACACATCGGAGTCGG-3’(SEQ ID No．2)和B2：5’-TCTCTGCTCTGCTTTCCTGCGAG-3’(SEQ ID No．4)反向引物，进行PCR，PCR条件均为93℃4分钟，随之以93℃1分钟，68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片段，为约800和1400bp的目的片段。然后用限制性酶NocI对两者进行酶切、连接，得到目的cDNA序列及杂带。杂带可用电泳等方法去除，从而得到浓度较高的目的cDNA序列。
2．PCR产物的测序
将如上获得的目的cDNA序列与pGEM-TTM载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTM DNA测序试剂盒(EpicentreTechnologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共2118bp，详细序列见SEQ ID No．5，其中开放读框位于6-2033位核苷酸。根据得到的全长cDNA序列推导出HDGF3的氨基酸序列，共676个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID No．6。
实施例2
同源比较
用人HDGF3的编码蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行蛋白同源检索。结果发现它与HDGF家族成员在蛋白水平上都有一定的同源性：与小鼠HRP-2蛋白(bdj︱BAA22896．1︱(D63850))有82．8％的同一性并有6％的相似性(见表2)，与小鼠HRP-3蛋白(dbj︱BAA90478．1︱(ABO29493))有52％的同一性并有11．9％的相似性，与人HDGF蛋白(dbj︱BAA03903．1︱(D16431))有44．6％的同一性并有11．3％的相似性，与小鼠HDGF蛋白(gb︱AAF65469．1︱AF251787_1(AF251787))有43％的同一性并有11％的相似性。HDGF家族成员氨基末端(hathregion，forhomologous to the amino terminus of the HDGF，)具有高度保守性，被认为是该家族成员的特征性序列，而本发明的人HDGF3其氨基末端与HDGF家族其他成员都有较高同源性(见表4)。鉴于本发明的上述特征认为其属于肝癌细胞衍生生长因子(HDGF)家族，具有与该家族成员相似的功能。
HDGF是从人的肝癌细胞株HuH-7中分离到的肝素结合蛋白，它具有刺激细胞生长的活性，能够促进成纤维细胞和一些肝癌细胞的生长(J．Biol．Chem．269(40)：25143-25149，1994)。荧光免疫实验显示HDGF蛋白主要存在于细胞质(J．Biol．Chem．269(40)：25143-25149，1994)，但是该家族成员的氨基酸序列中都含有一段碱性区域-一个潜在的核定位信号(NLS)。成纤维细胞生长因子(FGF)必须依靠这段信号区域，使之定位于核内而发挥其有丝分裂原的活性。HDGF的有丝分裂原活性使其在急恶性肝炎和肝损伤的治疗上存在着极大的应用价值(Clin．Chim．Acta．183：273-284，1989)。研究表明，免疫血清刺激8-24小时后，HDGF在快速增长的平滑肌细胞(SMCs)中有高表达，外生性和内生性的高表达HDGF都可刺激SMCs大量增殖及其DNA的大量合成，同时，在19日大鼠胎鼠(成鼠中无)大动脉的SMCs、成鼠腹主动脉收缩处SMCs均可检测到天然型的HDGF，这暗示HDGF在SMCs发育及血管受损时可促进其细胞生长，起到调理作用(J．Clin．Invest105(5)：567-575．，2000)。另外，HDGF的C端的酸性氨基酸尾和HMG家族的HMG-1／-2高度同源，而这段序列在HMG-1／-2中已知是组蛋白结合区域(Biochemistry 29：4419-4423，1990)。综合上述现象，认为HDGF可能在内化后作为转录因子发挥其刺激细胞生长的活性(Biochem．Biophys．Res．Commun．238：26-32，1997)。本发明的HDGF3也可能具有类似活性。
尽管HDGF最初在肝癌细胞中被发现，但Northern杂交分析显示它在人的心、脑、肺、肝等各个组织及各种癌细胞株中均有表达(J．Biol．Chem．269(40)：25143-25149，1994)。HDGF在睾丸中都有很高程度的富集，而且它们的5’非翻译区均有高于70％的GC比(Biochem．Biophys．Res．Commun．238：26-32，1997)，因而它可能在雄性生殖细胞发育中有重要功能(J．Cell．Biol．115：887-903，1990；Cell 62：503-514，1990)。原位杂交显示，肾发育阶段可以在肾单位形成处检测到含量极丰富的HDGF的mRNA，而在成人肾中含量很少，因而认为HDGF在肾发育过程中可能起有丝分裂原作用(J．ClinInvest 15：102(6)；1208-19，1998)。此外，小鼠支气管扎结后，HDGF表达量明显增加，暗示HDGF与肺的生长成熟有关(J．Pediatr Surg35(1)：113-8，2000)。本发明的HDGF3也可能具有类似功能。
在所有已知的HDGF家族成员中，本发明与小鼠HRP-2蛋白的同源度最高，除了HDGF家族的共性外，小鼠HRP-2蛋白还有其本身的特点。小鼠HRP-2蛋白富含丝氨酸(Ser)和脯氨酸(Pro)(分别为8．5％和12．4％)，这提示该蛋白可能具有磷酸激酶的作用。该蛋白的潜在核定位信号(氨基酸序列321-363位，见附表3)较长，其中酸性和碱性氨基酸含量都很高(．Lys+Arg：20．6％，Glu+Asp：19．7％)，可能具有核蛋白的作用。Northern杂交显示，小鼠HRP-2在心、肝、肺、脾、肾等组织中均有表达，在肝中中度表达，在睾丸中高表达，其5’-非翻译区有83％的GC比(Biochem．Biophys．Res．Commun．，238：26-32，1997)，这些特点和一些在精巢或胚胎发育中特异表达的基因相似，因而它可能在雄性生殖细胞发育中有重要功能。本发明的人HDGF3与小鼠HRP-2在核酸水平上有78．2％的同一性，在氨基酸水平上有82．8％的同一性并有6％的氨基酸相似，氨基末端的高度保守序列一致，核定位信号对应处氨基酸一致性为90．7％(见表3)，相似性为7％，Ser和Pro含量也较高(分别为12．7％和7．5％)，因而认为本发明具有与小鼠HRP-2蛋白相似的功能。
本发明的HDGF3还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明HDGF3还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白，如将本发明HDGF3的N端与人的其它HDGF及鼠HDGF的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明HDGF3的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
实施例3
HDGF3在大肠杆菌中的表达
在该实施例中，将编码HDGF3的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’-端的PCR寡核苷酸引物进行扩增。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：
E1：5’-CGCCGGATCCATGCCACACGCCTTCAAGC-3’(SEQ ID No．7)
该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的HDGF3编码序列的19个核苷酸；
3’端引物序列为：
E2：5’-TGCCAAGCTTTCAGCTCTCCTCGTCCAGG-3’(SEQ ID No．8)
该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和HDGF3的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶BamHI、HindIII的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc．，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子／操纵子(P／O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段混合物，随后进行连接。再用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15／rep4的E．coli菌株，M15／rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，用SalI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证HDGF3的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg／ml)和Kan(25μg／ml)的LB液体培养基中过夜培养(O／N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O／N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0．4-0．6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P／O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的HDGF3。用6M盐酸胍(pH5．0)从柱中洗脱HDGF3。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白，纯化后的蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5．0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质对含PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w／v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约75kDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No．6的序列一致。
实施例4
HDGF3在真核细胞(CHO细胞株)中的表达
在该实施例中，将编码HDGF3的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得HDGF3 cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：
C1：5’-CGGCAAGCTTATGCCACACGCCTTCAAGC-3’(SEQ ID No．9)
该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的HDGF3编码序列的19个核苷酸；
3’端引物序列为：
C2：5’-TGCCGGATCCTCAGCTCTCCTCGTCCAGG-3’(SEQ ID No．10)
该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和HDGF3的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII和BamHI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E．coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg／ml)的LB液体培养基中过夜培养(O／N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用SalI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证HDGF3的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0．05％Triton的50mMTris·HCl(pH7．6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8．0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8．0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7．4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为75kDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No．6的序列一致。
实施例5
制备抗体
将实施例3和4获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μ g／0．2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg／0．2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀HDGF3基因翻译产物的能力加以评估。本发明涉及的代号说明如下：
1．SEQ ID No．1的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度：23碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：寡核苷酸
(ⅲ)序列描述：SEQ ID No．1
TCAGCATGCC ACACGCCTTC AAG 23
2．SEQ ID No．2的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度：23碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：寡核苷酸
(ⅲ)序列描述：SEQ ID No．2
CTTCACAGAC ACATCGGAGT CGG 23
3．SEQ ID No．3的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度：23碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：寡核苷酸
(ⅲ)序列描述：SEQ ID No．3
GACTCCGACT CCAAGGCCGA TTC 23
4．SEQ ID No．4的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度：23碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：寡核苷酸
(ⅲ)序列描述：SEQ ID No．4
TCTCTGCTCT GCTTTCCTGC GAG 23
5．SEQ ID No．5的信息：
(ⅰ)序列特征
(A)长度：2118bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅲ)序列描述：SEQ ID No．51 TCAGCATGCC ACACGCCTTC AAGCCCGGGG ACTTGGTGTT CGCTAAGATG AAGGGCTACC61 CTCACTGGCC TGCCAGGATC GACGACATCG CGGATGGCGC CGTGAAGCCC CCACCCAACA121 AGTACCCCAT CTTTTTCTTT GGCACACACG AAACAGCCTT CCTGGGACCC AAGGACCTGT181 TCCCCTACGA CAAATGTAAA GACAAGTACG GGAAGCCCAA CAAGAGGAAA GGCTTCAATG241 AAGGGCTGTG GGAGATCCAG AACAACCCCC ACGCCAGCTA CAGCGCCCCT CCGCCAGTGA301 GCTCCTCCGA CAGCGAGGCC CCCGAGGCCA ACCCCGCCGA CGGCAGTGAC GCTGACGAGG361 ACGATGAGGA CCGGGGGGTC ATGGCCGTCA CAGCGGTAAC CGCCACAGCT GCCAGCGACA421 GGATGGAGAG CGACTCAGAC TCAGACAAGA GTAGCGACAA CAGTGGCCTG AAGAGGAAGA481 CGCCTGCGCT AAAGATGTCG GTCTCGAAAC GAGCCCGAAA GGCCTCCAGC GACCTGGATC541 AGGCCAGCGT GTCCCCATCC GAAGAGGAGA ACTCGGAAAG CTCATCTGAG TCGGAGAAGA601 CCAGCGACCA GGACTTCACA CCTGAGAAGA AAGCAGCGGT CCGGGCGCCA CGGAGGGGCC661 CTCTGGGGGG ACGGAAAAAA AAGAAGGCGC CATCAGCCTC CGACTCCGAC TCCAAGGCCG721 ATTCGGACGG GGCCAAGCCT GAGCCGGTGG CCATGGCGCG GTCGGCGTCC TCCTCCTCCT781 CTTCCTCCTC CTCCTCCGAC TCCGATGTGT CTGTGAAGAA GCCTCCGAGG GGCAGGAAGC841 CAGCGGAGAA GCCTCTCCCG AAGCCGCGAG GGCGGAAACC GAAGCCTGAA CGGCCTCCGT901 CCAGCTCCAG CAGTGACAGT GACAGCGACG AGGTGGACCG CATCAGTGAG TGGAAGCGGC961 GGGACGAGGC GCGGAGGCGC GAGCTGGAGG CCCGGCGGCG GCGAGAGCAG GAGGAGGAGC1021 TGCGGCGCCT GCGGGAGCAG GAGAAGGAGG AGAAGGAGCG GAGGCGCGAG CGGGCCGACC1081 GCGGGGAGGC TGAGCGGGGC AGCGGCGGCA GCAGCGGGGA CGAGCTCAGG GAGGACGATG1141 AGCCCGTCAA GAAGCGGGGA CGCAAGGGCC GGGGCCGGGG TCCCCCGTCC TCCTCTGACT1201 CCGAGCCCGA GGCCGAGCTG GAGAGAGAGG CCAAGAAATC AGCGAAGAAG CCGCAGTCCT1261 CAAGCACAGA GCCCGCCAGG AAACCTGGCC AGAAGGAGAA GAGAGTGCGG CCCGAGGAGA1321 AGCAACAAGC CAAGCCCGTG AAGGTGGAGC GGACCCGGAA GCGGTCCGAG GGCTTCTCGA1381 TGGACAGGAA GGTAGAGAAG AAGAAAGAGC CCTCCGTGGA GGAGAAGCTG CAGAAGCTGC1441 ACAGTGAGAT CAAGTTTGCC CTAAAGGTCG ACAGCCCGGA CGTGAAGAGG TGCCTGAATG1501 CCCTAGAGGA GCTGGGAACC CTGCAGGTGA CCTCTCAGAT CCTCCAGAAG AACACAGACG1561 TGGTGGCCAC CTTGAAGAAG ATTCGCCGTT ACAAAGCGAA CAAGGACGTA ATGGAGAAGG1621 CAGCAGAAGT CTATACCCGG CTCAAGTCGC GGGTCCTCGG CCCAAAGATC GAGGCGGTGC1681 AGAAAGTGAA CAAGGCTGGG ATGGAGAAGG AGAAGGCCGA GGAGAAGCTG GCCGGGGAGG1741 AGCTGGCCGG GGAGGAGCTG GCCGGGGAGG AGGCCCCCCA GGAGAAGGCG GAGGACAAGC1801 CCAGCACCGA TCTCTCAGCC CCAGTGAATG GCGAGGCCAC ATCACAGAAG GGGGAGAGCG1861 CAGAGGACAA GGAGCACGAG GAGGGTCGGG ACTCGGAGGA GGGGCCAAGG TGTGGCTCCT1921 CTGAAGACCT GCACGACAGC GTACGGGAGG GTCCCGACCT GGACAGGCCT GGGAGCGACC1981 GGCAGGAGCG CGAGAGGGCA CGGGGGGACT CGGAGGCCCT GGACGAGGAG AGCTGAGCCG2041 CGGGCAGCCA GGCCCAGCCC CCGCCCGAGC TCAGGCTGCC CCTCTCCTTC CCCGGCTCGC2101 AGGAGAGCAG AGCAGAGA6．SEQ ID No．6的信息： (ⅰ)序列特征
(A)长度：676个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：多肽 (ⅲ)序列描述：SEQ ID No．61 Met Pro His Ala Phe Lys Pro Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Met16 Lys Gly Tyr Pro His Trp Pro Ala Arg Ile Asp Asp Ile Ala Asp31 Gly Ala Val Lys Pro Pro Pro Asn Lys Tyr Pro Ile Phe Phe Phe46 Gly Thr His Glu Thr Ala Phe Leu Gly Pro Lys Asp Leu Phe Pro61 Tyr Asp Lys Cys Lys Asp Lys Tyr Gly Lys Pro Asn Lys Arg Lys76 Gly Phe Asn Glu Gly Leu Trp Glu Ile Gln Ash Asn Pro His Ala91 Ser Tyr Ser Ala Pro Pro Pro Val Ser Ser Ser Asp Ser Glu Ala106 Pro Glu Ala Asn Pro Ala Asp Gly Ser Asp Ala Asp Glu Asp Asp121 Glu Asp Arg Gly Val Met Ala Val Thr Ala Val Thr Ala Thr Ala136 Ala Ser Asp Arg Met Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Lys Ser Ser151 Asp Asn Ser Gly Leu Lys Arg Lys Thr Pro Ala Leu Lys Met Ser166 Val Ser Lys Arg Ala Arg Lys Ala Ser Ser Asp Leu Asp Gln Ala181 Ser Val Ser Pro Ser Glu Glu Glu Ash Ser Glu Ser Ser Ser Glu196 Ser Glu Lys Thr Ser Asp Gln Asp Phe Thr Pro G1u Lys Lys Ala211 Ala Val Arg Ala Pro Arg Arg Gly Pro Leu Gly Gly Arg Lys Lys226 Lys Lys Ala Pro Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Lys Ala Asp Ser241 Asp Gly Ala Lys Pro Glu Pro Val Ala Met Ala Arg Ser Ala Ser256 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp Val Ser Val271 Lys Lys Pro Pro Arg Gly Arg Lys Pro Ala Glu Lys Pro Leu Pro286 Lys Pro Arg Gly Arg Lys Pro Lys Pro Glu Arg Pro Pro Ser Ser301 Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Asp Glu Val Asp Arg Ile Ser Glu316 Trp Lys Arg Arg Asp Glu Ala Arg Arg Arg Glu Leu Glu Ala Arg331 Arg Arg Arg Glu Gln Glu Glu Glu Leu Arg Arg Leu Arg Glu Gln346 Glu Lys Glu Glu Lys Glu Arg Arg Arg Glu Arg Ala Asp Arg Gly361 Glu Ala Glu Arg Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Asp Glu Leu Arg376 Glu Asp Asp Glu Pro Val Lys Lys Arg Gly Arg Lys Gly Arg Gly391 Arg Gly Pro Pro Ser Ser Ser Asp Ser Glu Pro Glu Ala Glu Leu406 Glu Arg Glu Ala Lys Lys Ser Ala Lys Lys Pro Gln Ser Ser Ser421 Thr Glu Pro Ala Arg Lys Pro Gly Gln Lys Glu Lys Arg Val Arg436 Pro Glu Glu Lys Gln Gln Ala Lys Pro Val Lys Val Glu Arg Thr451 Arg Lys Arg Ser Glu Gly Phe Ser Met Asp Arg Lys Val Glu Lys466 Lys Lys Glu Pro Ser Val Glu Glu Lys Leu Gln Lys Leu His Ser481 Glu Ile Lys Phe Ala Leu Lys Val Asp Ser Pro Asp Val Lys Arg496 Cys Leu Asn Ala Leu Glu Glu Leu Gly Thr Leu Gln Val Thr Ser511 Gln Ile Leu Gln Lys Asn Thr Asp Val Val Ala Thr Leu Lys Lys526 Ile Arg Arg Tyr Lys Ala Asn Lys Asp Val Met Glu Lys Ala Ala541 Glu Val Tyr Thr Arg Leu Lys Ser Arg Val Leu Gly Pro Lys Ile556 Glu Ala Val Gln Lys Val Asn Lys Ala Gly Met Glu Lys Glu Lys571 Ala Glu Glu Lys Leu Ala Gly Glu Glu Leu Ala Gly Glu Glu Leu586 Ala Gly Glu Glu Ala Pro Gln Glu Lys Ala Glu Asp Lys Pro Ser601 Thr Asp Leu Ser Ala Pro Val Asn Gly Glu Ala Thr Ser Gln Lys616 Gly Glu Ser Ala Glu Asp Lys Glu His Glu Glu Gly Arg Asp Ser631 Glu Glu Gly Pro Arg Cys Gly Ser Ser Glu Asp Leu His Asp Ser646 Val Arg Glu Gly Pro Asp Leu Asp Arg Pro Gly Ser Asp Arg Gln661 Glu Arg Glu Arg Ala Arg Gly Asp Ser Glu Ala Leu Asp Glu Glu676 Ser7．SEQ ID No．7的信息 (ⅰ)序列特征
(A)长度：29碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：寡核苷酸 (ⅲ)序列描述：SEQ ID No．7
CGCCGGATCC ATGCCACACG CCTTCAAGC 298．SEQ ID No．8的信息 (ⅰ)序列特征
(A)长度：29碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：寡核苷酸 (ⅲ)序列描述：SEQ ID No．8
TGCCAAGCTT TCAGCTCTCC TCGTCCAGG 299．SEQ ID No．9的信息 (ⅰ)序列特征
(A)长度：29碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：寡核苷酸 (ⅲ)序列描述：SEQ ID No．9 CGGCAAGCTT ATGCCACACG CCTTCAAGC 2910．SEQ ID No．10的信息 (ⅰ)序列特征
(A)长度：29碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：寡核苷酸 (ⅲ)序列描述：SEQ ID No．10
TGCCGGATCC TCAGCTCTCC TCGTCCAGG 29本发明涉及表格如下：
表1.保守性变异多肽氨基酸的取代最初的残基代表性的取代优选的取代 Ala(A)Val；Leu；Ile Val Arg(R)Lys；Gln；Asn Lys Asn(N)Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D)Glu Glu Cys(C)Ser Ser Gln(Q)Asn Asn Glu(E)Asp Asp Gly(G)Pro；Ala Ala His(H)Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I)Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L)Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K)Arg；Gln；Asn Arg Met(M)Leu；Phe；Ile Leu Phe(F)Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P)Ala Ala Ser(S)Thr Thr Thr(T)Ser Ser Trp(W)Tyr；Phe Tyr Tyr(Y)Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V)Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
表2．人HDGF3与小鼠HRP-2核酸同源性比较注：人HDGF3与小鼠HRP-2核酸同一性为78．2％。
表3．人HDGF3与小鼠HRP-2氨基酸同源性比较注：人HDGF3与小鼠HRP-2氨基酸同一性为82．8％。
表4．人HDGF3与HDGF家族成员氨基末端特征性序列比较人HDGF3蛋白 mpha-----fkpgdlvfakmkgyphwpariddiadgavkpppnkypifff 45小鼠HRP-2蛋白 mpha-----fkpgdlvfakmkgyphwpariddiadgavkpppnkypifff 45人HDGF蛋白 msrsnrqkeykcgdlvfakmkgyphwparidempeaavkstankyqvfff 50小鼠HDGF蛋白 msrsnrqkeykcgdlvfakmkgyphwparidempeaavkstankyqvfff 50
*．．* *******．***．*******．．．．．*** *．*．．***人HDGF3蛋白 gthetaflgpkdlfpydkckdkygkpnkrkgfneglweiqnnphasysap 95小鼠HRP-2蛋白 gthetaflgpkdlfpydkckdkygkpnkrkgfneglweiqnnphasysap 95人HDGF蛋白 gthetaflgpkdlfpyeeskekfgkpnkrkgfseglweiennp------- 93小鼠HDGF蛋白 gthetaflgpkdlfpyeeskekfgkpnkrkgfseglwiennp-------- 93
***************．．*．*．*********．******．***注：人HDGF3与HDGF家族成员氨基酸序列氨基末端特征性序列比较同一性为62．4％。