靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核酸， 含它们的药物组合及其用于治疗癌症的用途
本发明涉及靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核苷酸，含它们的药物组合物及其用于治疗癌症的用途。
癌症是目前全世界直接导致人类死亡的主要疾病之一。传统的基于细胞毒化学治疗方法具有选择性差、副作用强等缺点，因此，寻找特异性强、尤其是干扰与癌细胞行为密切相关蛋白表达的药物是人们所希望的。Nicholas Dean等人在“通过蛋白激酶C-α表达的反义寡核苷酸抑制剂抑制裸鼠中肿瘤细胞系生长，Cancer Res(癌症研究)，56，3499-3507，1996年8月1日”一文中披露了用于治疗人体癌症的靶向蛋白激酶C-α的反义寡核苷酸，其代表物为编号ISIS 3521的寡脱氧核苷酸，该核苷酸序列为：5′-TGTCT CGCTG GTGAG TTTCA-3′。但人们认为反义寡核苷酸的设计、开发有较大的随机性(W Roush Science1997；276：1192～1193)，因此反义药物的选择还缺乏理论指导。
本发明的目的是以靶点mRNA的二级结构及系统发育保守性为基础，寻找靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义核苷酸药物。
本发明者经广泛深入研究，通过固相合成法合成了一系列硫代寡核苷酸并进行了筛选。现已发现下面八个对PKC-α异常表达如肺腺癌A549细胞株有良好抑制作用的反义硫代寡核苷酸。
因此，本发明第一方面涉及的是具有下面序列1-8地靶向蛋白酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核苷酸：
序列1：5′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′，今后简称为BIRM-AP1224(20)，
序列2：5′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′，今后简称为BIRM-AP1240(20)。
序列3：5′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′，今后简称为BIRM-AP0155(20)，
序列4：5′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′，今后简称为BIRM-AP0186(20)，
序列5：5′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′，今后简称为BIRM-AP0478(20)，
序列6：5′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′，今后简称为BIRM-AP0973(20)，
序列7：5′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′，今后简称为BIRM-AP1261(20)，
序列8：5′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG～3′，今后简称为BIRM-AP1755(20)，
本发明再一方面涉及的是药物组合物，其包括具有下面序列的反义硫代寡核苷酸及药用载体和赋形剂：
序列1：5′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′，
序列2：5′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′，
序列3：5′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′，
序列4：5′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′，
序列5：5′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′，
序列6：5′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′，
序列7：5′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′，
序列8：5′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′。
本发明再一方面涉及的是上述序列1-8的反义硫代核苷酸用于治疗癌症的用途。
本发明再一方面涉及的是上述序列1-8的反义硫代梳苷酸用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
根据本发明，本发明的反义硫代寡核苷酸序列1-8是以PKC-αmRNA的蛋白编码区(5′-CTTGACGCAGCTGCACTCCT-3′，5′-TCCTGCTTCCAGACAGTGGA-3′，5′-TCTTCAAGCAGCCCACCTTC-3′，5′-CACCGACTTCATCTGGGGGT-3′，5′-TGCGGAATGGATCACACTGA-3′，5′-AAAGTCATCAGTCCCTCTGA-3′，5′-CGGCTGTACTTCGTCATGGA-3′，5′-CCCAGCCAAGCGGCTGGGCT-3′)为靶点设计合成与以上靶点反向互补的硫代脱氧寡核苷酸，其对肺腺癌A549和胃癌BGC细胞的增殖有良好的抑制作用。
因此本发明的靶向PKC-α的反义硫代寡核苷酸可用作抗癌药物。
在本发明的优选具体实施方案中，优选作用于肺腺癌A549细胞株的本发明序列1-8的反义硫代寡核苷酸。
根据本发明，本发明的药物组合物中还有含有作用于其它靶点的反义寡核苷酸。
下面的实施例是对本发明的进一步说明，但不意味着对本发明任何限制。
实施例一：
1．人肿瘤细胞系(A549等)的培养及反义寡核苷酸的处理：
接种细胞于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中(补充青、链霉素各100ku·L-1)，培养器皿置于37℃含有5％CO2的细胞培养箱中。培养细胞达到50～60％融合时，用无血清培养基冲洗2遍。按Gibco BRL公司脂质体转染说明书的要求，将反义寡核苷酸导入到肿瘤细胞内。将脂质体/无血清培养基=1/5的比例，配制成脂质体溶液，室温下静置30～40分钟。等体积混合用无血清培养基溶解的不同浓度的反义寡核苷酸，静置10～15分钟后，加入到培养器皿中，迅速补充4倍的无血清培养基。置于37℃含5％CO2的培养箱中6小时后，换正常培养基，培养48～72小时后MTT法测定细胞活度。对照组仅含等浓度的脂质体。
2．靶向PKC-αmRNA的反义硫代寡核苷酸对肿瘤细胞的抑制作用：
将对数生长期的肺腺癌A549细胞或其它的细胞接种于96孔培养板中，4000个细胞/孔。培养18～24小时，按上述方法，加入不同浓度的反义寡核苷酸，反应终体积均为200μl。换正常培养基继续培养48～72小时，弃上清。每孔加入200μl新鲜配制的含0.5mg/ml四氮唑盐(MTT)的无血清培养基，37℃培养4小时后弃上清。以200μl DMSO溶解甲_。轻度振荡后，用酶标仪在检测波长为570nm、参比波长为450nm下测定光吸收值。
经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，实验证实，本发明反义硫代寡核苷酸对A549细胞内PKC-αmRNA有特异性的抑制作用。
本发明反义硫代寡核苷酸对肺腺癌A549细胞系有强抑制增殖作用。
表1～8显示本发明反义硫寡核苷酸对A549肺腺癌细胞体外增殖的抑制作用，并与对照核苷酸序列ISIS3521进行了比较。结果表明BIRM-AP1224(20)，BIRM-AP1240(20)，BIRM-AP0155(20)，BIRM-AP0186(20)，BIRM-AP0478(20)，BIRM-AP0973(20)，BIRM-AP1261(20)，BIRM-AP1755(20)在抑制肺腺癌A549细胞系增殖上强或近于阳性对照ISIS3521。(数据来自4次重复实验的平均值)
表1 BIRM-P1224-20浓度(nM)抑制率(％)BIRM-AP1224(20)ISIS352150091.1±5.890.7±4.520088.7±8.582.4±5.78058.5±22.649.7±11.53221.7±5.811.3±9.8
表2 BIRM-AP1240(20)浓度(nM)抑制率(％)BIRM-AP1240(20)ISIS352150090.2±1.890.7±4.520082.1±5.882.4±5.78036.9±3.949.7±11.53214.3±4.011.3±9.8
表3 BIRM-AP0155(20)浓度(nM)抑制率(％)BIRM-AP0155(20)ISIS352150092.4±5.490.7±4.520088.9±3.882.4±5.78049.2±13.849.7±11.53226.5±11.911.3±9.8
表4 BIRM-AP0186(20)浓度(nM)抑制率(％)BIRM-AP0186(20)ISIS352150096.2±0.990.7±4.520090.5±8.882.4±5.78048.3±19.449.7±11.53230.7±14.411.3±9.8
表5 BIRM-AP0478(20)浓度(nM)抑制率(％)BIRM-AP0478(20)ISIS352150090.2±3.990.7±4.520077.0±16.582.4±5.78041.5±20.949.7±11.53230.7±9.511.3±9.8
表6 BIRM-AP0973(20)浓度(nM)抑制率(％)BIRM-AP0973(20)ISIS352150093.2±1.090.7±4.52079.0±8.982.4±5.78036.1±9.849.7±11.53227.0±8.111.3±9.8
表7 BIRM-AP1261(20)浓度(nM)抑制率(％)BIRM-AP1261(20)ISIS352150091.5±0.790.7±4.520091.1±1.882.4±5.78055.2±16.949.7±11.53229.7±16.511.3±9.8
表8 BIRM-AP1755(20)浓度(nM)抑制率(％)BIRM-AP1755(20)ISIS352150089.0±8.490.7±4.520088.8±6.682.4±5.78055.2±6.649.7±11.53211.7±7.811.3±9.8
实施例二：反义硫代脱氧寡核苷酸的合成
合成方法：用寡核苷酸固相合成亚磷酰胺法，使用美国ABI公司生产的ABI 390Z核酸合成仪的250umol合成程序合成。主要原料为四乙基秋兰姆化二硫(TETD)、亚磷酰胺单体(phosphoramidite monomers)。制备时，将固相支持物连接保护的、通过固相合成的含本发明核苷酸序列的硫代寡核苷酸，用浓氨水在55℃条件下，作用15个小时脱保护，从固相支持物上切离，用HPLC法进行纯化。
【序列表】
(1)一般资料：
Ⅰ．序列数量：8
(2)序列BIRM-AP1224(20)的资料：
Ⅱ．序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
Ⅲ．是否反义：反义
Ⅳ．序列描述：BIRM-AP1224(20)
AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG 20
(3)序列BIRM-AP1240(20)的资料：
Ⅱ．序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
Ⅲ．是否反义：反义
Ⅳ．序列描述：BIRM-AP1240(20)
T CCAC TGTCT GGAAG CAGGA 20
(4)序列BIRM-AP0155(20)的资料：
Ⅱ．序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
Ⅲ．是否反义：反义
Ⅳ．序列描述：BIRM-AP0155(20)
5′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′(20)
(5)序列BIRM-AP0186(20)的资料：
Ⅱ．序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
Ⅲ．是否反义：反义
Ⅳ．序列描述：BIRM-AP0186(20)
5′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′(20)
(6)序列BIRM-AP0478(20)的资料：
Ⅱ．序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
Ⅲ．是否反义：反义
Ⅳ．序列描述：BIRM-AP0478(20)
5′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′(20)
(7)序列BIRM-AP0973(20)的资料：
Ⅱ．序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
Ⅲ．是否反义：反义
Ⅳ．序列描述：BIRM-AP0973(20)
5′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′(20)
(8)序列BIRM-AP1261(20)的资料：
Ⅱ．序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
Ⅲ．是否反义：反义
Ⅳ．序列描述：BIRM-AP1261(20)
5′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′(20)
(9)序列BIRM-AP1755(20)的资料：
Ⅱ．序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
Ⅲ．是否反义：反义
Ⅳ．序列描述：BIRM-AP1755(20)
5′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′(20)