水杨酸途径基因及其在植物抗性诱导中的应用 【发明领域】
本发明涉及水杨酸生物合成途径中更具体地是通过异分支酸(isochorismic acid)的水杨酸途径中的基因，及其在植物中通过水杨酸的抗性诱导中的应用。更具体而言，本发明涉及异分支酸合酶(ICS)基因在产生水杨酸中的应用，尤其是通过一种新地植物异分支酸合酶基因，更具体的是除异分支酸合酶之外还涉及异分支酸丙酮酸裂合酶的应用。另外，本发明还涉及这种新植物异分支酸合酶基因的启动子作为一种病原体诱导型启动子的应用。
背景技术
病原体攻击后，植物能通过引发局部地及系统性作用的防御机制而起反应。在过敏反应(HR)中，局部反应尤其包括快速细胞坏死/凋亡，可见到病斑的形成，和抑制生长的酚物质(植物抗毒素)和病理相关(PR)蛋白质的积累。也能观察到细胞壁增强和细胞壁增厚。这种组合的、多因素的防御反应限制了导致病原体生长和扩散。
在此过敏反应之后发生具有强烈抗病原体作用的PR蛋白质的系统诱导，这可能是植物在HR之后表现的系统获得性抗性(SAR)状态的原因。这种SAR状态可持续数周，并且保护植物免受易感的病原体的侵害。
对参与HR和SAR形成的信号传导途径了解很少。早期的研究显示，水杨酸(SA)局部及系统性地积累到相当高的水平。同样，用SA对植物的处理提高了PR基因的表达水平，并且增强了植物对病原体的抗性，表明SA在SAR的建立中起重要作用(见，例如Ryals，植物细胞(Plant Cell)8，1809-1819，1996)。通过制备带有恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)nahG基因的转基因植物，甚至获得SA的重要作用的更有力证据。nahG基因的基因产物羟基化SA，并且使其失活。NahG转基因烟草和拟南芥植物在引起有效HR的能力方面减弱，因为病原体从最初感染部位生长并扩散(Gaffney等人，科学(Science)261，754-756，1993；Delaney等人，科学266，1247-1250，1994)。nahG转基因植物也在引起SAR反应方面有缺陷。
然而，显然存在过敏反应诱导的备择途径，并且番茄中nahG的过量表达不能减弱在分别用含有Avr9和Avr2的黄枝孢(Cladosporium fulvum)种攻击Cf9或Cf2植物之后发生的过敏反应。(Hammond-Kosack和Jones，植物细胞8，1773-1791，1996)。
SA在植物病害信号传导中的作用的综述可见Durner等人，植物科学趋势(Trends.Plant.Sci.)2，266-274，1997；Chasan，植物细胞7，1519-1521，1995；Klessig和Malamy，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)26，1439-1458，1994。
发明概述
本发明描述了一种诱导植物病原体抗性的方法，其特征在于这些植物用带有编码异分支酸合酶的基因的表达盒转化。更具体而言，该方法的特征在于编码异分支酸合酶的基因选自entC、orfA、pchA和ICS，其中最后一种基因优选地是长春花(Catharantus roseus)的ICS基因。能用于该方法的基因显示于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17中。
本发明的另一个实施方案是根据上述方法的一种方法，其特征在于这些植物另外用一种载体转化，该载体含有一种带有编码异分支酸丙酮酸裂合酶的基因的表达盒，该表达盒优选地与包含编码异分支酸合酶的基因的表达盒位于同一个载体上。编码异分支酸丙酮酸裂合酶的基因优选地选自orfD和pchB。
本发明的一个具体实施方案是如上所述的一种方法，其特征在于编码异分支酸合酶的基因是entC，编码异分支酸丙酮酸裂合酶的基因是orfD。
本发明的另一方面是一种自长春花分离的、具有异分支酸合酶活性的蛋白质。该蛋白质具有67kD的分子量。该蛋白质优选地包含SEQID NO：19的氨基酸序列。
本发明的一部分也包括编码该蛋白质的核苷酸序列，其优选地是包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的再另一方面是包含发现其能自然调节长春花中ICS基因表达的5’调节区的核苷酸序列。该调节区能用作病原体诱导型启动子，它能引导具有抗真菌、抗细菌或抗病毒性质的蛋白质的表达。这些蛋白质的实例是壳多糖酶、葡聚糖酶、渗透蛋白、防卫素、爪蟾抗菌肽、杀菌肽、核酶。此外，这种病原体诱导型启动子能用来表达在目的为诱导过敏反应的策略中使用的引发蛋白或抗性基因(见WO91/15585)。包含上述基因或用上述基因转化的载体、农杆菌、植物细胞和植物形成了本发明的另一部分。
附图描述
图1：载体pMOG22 GUS ICS的示意图。
图2：从含有指定构建体的转基因植物(每种构建体3个转基因系)和可与PR-1a探针杂交的对照植物中分离的RNA的Northern印迹。
图3：长春花异分支酸合酶基因的调节序列的限制位点示意图谱。
发明详述
植物中水杨酸的生物合成通常被认为是通过反式肉桂酸的合成和苯甲酸的转化及随后2-羟化而进行的。在感染的植物中，合成途径可能略微改变，其利用反式肉桂酸使其转化为邻香豆酸，然后后者转化为水杨酸。在微生物中，已知水杨酸的生物合成是从分支酸到异分支酸进行的(由酶异分支酸合酶ICS催化)。该转化所需的基因已从铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(编码ICS活性的pchA基因，Serino，L.等人，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)249，217-228，1995)和大肠杆菌(编码ICS活性的entC基因，Ozenberger B.A.等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171，775-783，1989)中克隆。
现在我们吃惊地发现，通过用带有编码异分支酸合酶的基因的表达盒转化植物，可将分支酸途径产生水杨酸的应用引入所述植物中。该基因可来源于细菌，如以上指出的PchA和entC基因，或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的orfA基因，或者由发现存在编码异分支酸合酶的基因产生的植物，如本申请书中提到的长春花的ICS基因。尚未鉴定但具有异分支酸合酶活性的其他基因也构思用于本发明中。这些基因能从细菌或植物中分离，方法是用来源于本发明中序列的简并探针与其杂交。
尽管已知(在本发明中也发现)水杨酸或许是由于其相对毒性而在植物中快速失活(通过降解或糖化)，但我们仍能够发现在用编码异分支酸合酶的基因转化植物后水杨酸浓度增高。而且，我们也观察到最可能是由水杨酸的过量产生引起的病理相关蛋白质的诱导，表明内源产生的水杨酸能导致赋予植物病原体抗性的诱导。
能用于本发明的基因显示于SEQ ID NO：13、15和18中。必须理解，编码这些酶的核苷酸序列可自由改变，只要得到的基因产物仍具有异分支酸合酶活性。明显的改变是密码子使用的改变，使其适于与转化基因的植物最类似的密码子使用。也可修饰用于转化的多核苷酸，因为可以去除mRNA不稳定性编码基序和/或不规则剪接区，使得这样修饰的多核苷酸的表达产生基本上相似的酶。
本发明的基因编码有酶活性的蛋白质。术语蛋白质是指通过肽键连接的氨基酸序列。多肽或肽也被认为是蛋白质。本发明的蛋白质的突变蛋白是通过替换、添加和/或缺失一个或多个氨基酸由列出的序列所示的蛋白质获得的蛋白质，但仍保留其酶活性。这些突变蛋白可通过体内蛋白质工程容易地制备，例如，通过改变能编码该酶的开放阅读框，使得氨基酸序列受到影响。只要氨基酸序列的改变不能完全消除酶活性，这些突变蛋白即包括于本发明中。此外，应当理解，突变应当来源于蛋白质或列出的序列所示的编码这些蛋白质的DNA序列，同时保留生物活性，即，突变蛋白质和列出的序列所示的蛋白质之间的所有或者大部分中间物应当具有酶活性。大部分是指30％或更多的中间物，优选地40％或更多，更优选地50％或更多，更优选地60％或更多，更优选地70％或更多，更优选地80％或更多，更优选地90％或更多，更优选地95％或更多，更优选地99％或更多。
本发明提供一种包含根据本发明的表达盒的嵌合DNA序列。术语嵌合DNA序列是指包括任何DNA序列，包括自然界中不能天然发现的DNA序列。例如，嵌合DNA是指，包括在植物基因组的非天然位置中包含编码该酶的开放阅读框的DNA，虽然事实是该植物基因组通常在其天然染色体位置处含有一个拷贝的该开放阅读框。类似地，该开放阅读框可以掺入未天然发现的植物基因组中，或者掺入未天然发现的复制子或载体中，如细菌质粒或病毒载体。嵌合DNA不限于可在宿主中复制的DNA分子，也是指包括能连接到复制子中的DNA，例如通过特异的连接体序列，与根据本发明的开放阅读框物理连接。该开放阅读框可以与或者可以不与其天然上游和下游调节元件连接。
开放阅读框可以来源于基因组文库。在后者中，它可含有一个或多个内含子，分隔组成编码根据本发明蛋白质的开放阅读框的外显子。开放阅读框也可由一种非间断外显子编码，或由编码根据本发明的蛋白质mRNA的cDNA编码。根据本发明的开放阅读框也包括人工去除或添加了一个或多个内含子的开放阅读框。本发明包括这些变体的每一种。
为了能够在宿主细胞中表达，根据本发明的嵌合DNA通常含有使其能够被宿主的生物化学机制识别，并且能使开放阅读框在宿主中转录和/或翻译的调节元件。通常包括转录起始区，它们可能适当地来源于能够在选择的宿主细胞中表达的任一基因，以及用于核糖体识别和附着的翻译起始区。在真核细胞中，表达盒通常另外包含位于该开放阅读框下游的转录终止区，其使得转录终止并发生初级转录物的聚腺苷酸化。另外，密码子使用可能适合所选宿主的公认的密码子使用。此外，常常可编码信号序列，其担负基因表达产物向亚细胞区室的导向。控制嵌合DNA构建体在所选宿主细胞中表达的原理通常为本领域的技术人员所了解，可表达的嵌合DNA构建体的构建现在对于任一种类的宿主细胞，无论原核的或真核的，都是常规技术。
开放阅读框为了能在宿主细胞中保留，通常为复制子的形式，其包含根据本发明的开放阅读框，与为所选宿主细胞识别并被复制的DNA连接。因此，复制子的选择主要取决于选择的宿主细胞。为选择的特定宿主选择适当复制子的原则处于本领域技术人员的理解范围之内。
特殊类型的复制子能够将其自身或其一部分转移到另一种宿主细胞(如植物细胞)中，由此将根据本发明的开放阅读框共转移到该植物细胞中。具有这种能力的复制子在此被称为载体。这种载体的一个实例是Ti质粒载体，当存在于适当的宿主如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中时，它能够将其部分，即所谓的T区，转移到植物细胞中。不同类型的Ti质粒载体(参见：EP 0 116 718B1)现在已常规用于向植物细胞或原生质体中转移嵌合DNA序列，由此可产生在基因组中稳定地掺入了该嵌合DNA的新植物。Ti质粒载体的一种特别优选的形式是(EP 0 120 516 B1和US 4，940，838)中要求保护的所谓二元载体。可用于向植物宿主中引入根据本发明的DNA的其他适当载体可选自病毒载体，例如非整合型植物病毒载体，如可来源于双链植物病毒(例如CaMV)和单链病毒、双生病毒等。这些载体的应用可能是有利的，特别是在难以稳定地转化植物宿主时。木本种特别是树和藤本植物时尤其如此。
表述“在其基因组中掺入根据本发明的嵌合DNA序列的宿主细胞”是指包括细胞，以及包含这些细胞或基本上由这些细胞组成的多细胞生物，它们在其基因组中稳定地掺入了所述嵌合DNA，由此保留该嵌合DNA，并且优选地通过有丝分裂或减数分裂将一个拷贝的这种嵌合DNA传递给子代细胞。根据本发明的一个优选实施方案，提供这样的植物，其基本上由在基因组中掺入了一个或多个拷贝的所述嵌合DNA的细胞组成，并且能够优选地以孟德尔方式将一个或多个拷贝传递给子代。由于根据本发明的嵌合DNA在某些或所有植物细胞中的转录和翻译，产生酶的那些细胞将显示对病原体感染增强的抗性。尽管控制植物细胞中DNA转录的上述原则尚未了解，但能够基本上以组成型方式表达，即在植物的大多数细胞型中表达而基本上无严重时间和/或发育限制的嵌合DNA的产生现在已是常规。常规用于该目的的转录起始区是可从花椰菜花叶病毒中获得的启动子，尤其是35S RNA和19S RNA转录启动子和根癌农杆菌的所谓的T-DNA启动子，要特别提及的是胭脂氨酸合酶启动子、章鱼氨酸合酶启动子(在EP 0 122 791B1中公开)和甘露氨酸合酶启动子。另外也可使用植物启动子，它们可能基本上是组成型的，如水稻肌动蛋白基因启动子，或者例如是器官特异的，如根特异性启动子RolD，或马铃薯块茎特异性patatin启动子。此外，也可使用诱导型启动子，其能够通过外部因素诱导病原体抗性，它们能在最合适的时间使用。因此它们防止了不希望的作用，例如由于相对毒性产生水杨酸。诱导型启动子包括在接触诱导物后能够提高特定基因产生的基因产物的量的任一启动子。在无诱导物时，DNA序列不被转录。一般而言，能与诱导型启动子特异结合而激活转录的因子以失活形式存在，然后被诱导物直接或间接地转化为活性形式。诱导物可以是化学试剂，如蛋白质、代谢物(糖、醇等)、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或者通过热、盐、创伤、有毒成分等直接施加的，或通过病原体或致病因素如病毒的作用间接施加的生理应力。含有诱导型启动子的植物细胞可通过对细胞外部施用诱导物如通过喷施、浇水、加热或类似方法接触诱导物。诱导型启动子为技术人员所知，并存在肯定能用来引导本发明的基因表达的几种启动子。按照本发明适用的诱导型启动子包括但不限于热休克启动子、哺乳动物类固醇受体系统和任何化学诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括果蝇(Drosophila melanogaster)的诱导型70kD热休克启动子(Freeling，M.等人，遗传学年述(Ann.Rev.Genet.)19，297-323)和乙醇诱导的醇脱氢酶启动子(Nagao，R.T.等人，于：Miflin，B.J.(编)《植物分子和细胞生物学牛津概论》(Oxford Surveys of PlantMolecular and Cell Biology)，第3卷，384-438页，牛津大学出版社，1986)。可由简单化学试剂诱导的启动子是特别有用的。这最后一类的实例是WO 90/08826、WO 93/21334、WO 93/031294和WO 96/37609中描述的启动子。也可提到可从马铃薯中获得的PRP1启动子(也称为gst1启动子)(Martini N.等人(1993)，分子普通遗传学263，179-186)、Fis1启动子(WO 96/34949)、Bet v 1启动子(Swoboda，I.等人，植物、细胞与环境(Plant，Cell and Env.)18，865-874，1995)、Vst1启动子(Fischer，R.，学位论文，Hohenheim大学，1994；Schubert，R.等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)34，417-426，1997)、倍半萜环化酶启动子(Yin，S.等人，植物生理学(Plant Physiol.)115，437-451，1997)和gstA1启动子(Mauch，F.和Dudler，R.，植物生理学102，1193-1201，1993)作为病原体诱导型启动子的实例。当然在此方面也可使用长春花的ICS基因的调节区，这形成了本发明的一部分。
启动子的选择不是必需的，虽然组成型高水平启动子和/或诱导型启动子是略微优选的。另外知道，某些元件即所谓的增强子的复制可大大增强DNA在其体制下的表达水平(参见，例如：Kay R.等人，科学236，1299-1302，1987：CaMV 35S启动子的-343与-90之间的序列的复制提高了该启动子的活性)。除了单独或成倍增强的35S启动子之外，高水平启动子的实例是光诱导型核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcSSU)启动子和叶绿素a/b结合蛋白(Cab)启动子。本发明也设想杂种启动子，其包含物理连接的不同启动子的元件。其众所周知的实例是所谓的CaMV增强的甘露氨酸合酶启动子(美国专利5，106，739)，其包含与CaMV增强子连接的甘露氨酸合酶启动子的元件。
如在说明本发明的实施例中证明，酶向植物细胞细胞器的导向能增强水杨酸的产生。这用本发明的酶底物富含于特殊细胞器中的事实可以解释。使用来源于烟草的信号肽向叶绿体的特定导向产生良好的结果。当然，也能使用从其他来源获得的信号肽。
关于转录终止区的必要性，通常认为这种区域增强了植物细胞中转录的可靠性和效率。因此其应用在本发明的说明书中是特别优选的。
关于本发明在不同植物种中的适用性，必须提到只是用转基因烟草和拟南芥植物作为实例说明本发明的一个特殊实施方案，而实际适用性实际上不限于这些植物种。经受某种形式病原体攻击的任何植物种都可用根据本发明的基因转化，使酶在某些或所有植物细胞中产生。
尽管本发明的某些实施方案目前尚不可行，例如，因为某些植物种至今尚且不能进行基因转化，但本发明在这些植物种中的实施只是时间问题而不是原则问题，因为基因转化的适用性与本发明的下列实施方案无关。
植物种的转化现在对于大量植物种包括双子叶植物和单子叶植物而言都是常规。原则上任何转化方法都可用来向适当的祖细胞中引入根据本发明的嵌合DNA，只要这些细胞能够再生为完整的植物。方法可适当地选自原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等人，自然296，72-74，1982；Negrutiu I.等人，植物分子生物学8，363-373，1987)、原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等人，生物技术(Bio/Technol.)3，1099-1102，1985)、向植物物质中的显微注射(Crossway A.等人，分子普通遗传学202，179-185，1986)、对不同植物物质的DNA(或RNA包被的)颗粒轰击(Klein T.M.等人，自然327，70，1987)、(非整合型)病毒感染等。根据本发明的一种优选方法包括农杆菌介导的DNA转移。特别优选的是如EP A 120 516和美国专利4，940，838中公开的所谓的二元载体技术的应用。
番茄转化优选地基本如Van Roekel等人(植物细胞报道(PlantCell Rep.)12，644-647，1993)所述进行。马铃薯转化优选地基本如Hoekema等人(Hoekema A.等人，生物技术7，273-278，1989)所述进行。通常，转化后，针对一种或多种标记的存在筛选植物细胞或细胞组，该标记由与编码根据本发明的蛋白质的核苷酸序列共转移的植物表达基因编码，之后转化的植物材料再生为完整的植物。
尽管认为更不适于基因转化，但单子叶植物可进行转化，并且能从转化的细胞或胚或其他植物材料再生为可育性转基因植物。目前，单子叶植物转化的优选方法是对胚、外植体或悬浮细胞的微粒轰击，和直接DNA摄取或电穿孔(Shimamoto等人，自然338，274-276，1989)。已经获得转基因玉米植物，方法是通过微粒轰击(Gordon-Kamm，植物细胞，2，603-618，1990)将编码phosphinothricin乙酰转移酶(一种灭活除草剂phosphinothricin的酶)的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因引入玉米悬浮培养物的胚发生细胞中。曾经报道过遗传物质向其他单子叶作物如小麦和大麦的糊粉原生质体中的引入(Lee，植物分子生物学13，21-30，1989)。已由胚发生悬浮培养液再生为小麦植物，方法是只选择老龄、致密的和结状的胚发生愈伤组织用于胚发生悬浮培养液的形成(Vasil，生物技术8，429-434，1990)。与用于这些作物的转化系统的组合能使本发明应用于单子叶植物。
单子叶植物，包括重要的商业作物如稻和玉米，也适于用农杆菌株进行DNA转移(参见WO 94/00977；EP 0 159 418 B1；Gould J.等人，植物生理学95，426-434，1991)。
DNA转移并再生后，可评估推定转化的植物，例如应用Southern分析，评估根据本发明的嵌合DNA的存在，拷贝数和/或基因组组成。另外，用Northern和/或Western分析，本领域技术人员众所周知的技术，可以估计新引入的DNA的表达水平。任选的最初的分析后，可以对显示希望的拷贝数和根据本发明的新引入嵌合DNA表达水平的转化植物检测病原体抗性水平。此外，选择的植物可进行另一轮转化，例如引入其他基因，以增强抗性水平，或扩大抗性谱。
其他评价可能包括现场条件下病原体抗性的检测、核实生育力、产量和其他特征。这些检测现在可由本领域的技术人员常规进行。
在这些评价后，转化的植物可以直接生长，但通常它们可在新品种的培育中或杂种的建立等之中用作亲本系。
为了获得能组成型表达多于一种嵌合基因的转基因植物，多种选择是可利用的，包括下列方法：
A．DNA例如二元质粒上的T-DNA的应用，其含有与选择性标记基因物理偶联的多个修饰基因。该方法的优点是，嵌合基因物理偶联，因此作为单一的孟德尔基因座迁移。
B．用含有一种或多种与选择性标记结合的嵌合基因的转基因植物的花粉，对每一种均能表达一种或多种优选地与另一种选择性标记基因偶联的嵌合基因的转基因植物异花传粉。之后，可以根据两种选择性标记的存在或者根据嵌合基因本身的存在来筛选这种杂交获得的种子。由筛选的种子获得的植物随后能用于进一步的杂交。通常，嵌合基因不是位于一个基因座上，因此基因可以独立的基因座分离。
C．许多多重嵌合DNA分子(如质粒)的应用，其中每一个都含有一种或多种嵌合基因和选择性标记。如果共转化的频率高，则只根据一种标记的筛选就足够了。在其他情况中，根据多于一种标记的筛选是优选的。
D．含有第一种、第二种(等)嵌合基因和新嵌合DNA，任选地含有一种选择性标记基因的转基因植物的连续转化。如方法B所述，嵌合基因通常不是位于单一基因座上，因此嵌合基因可作为独立的基因座分离。
E．上述策略的组合。
实际策略可基于易于确定的几种考虑，如亲本系的目的(直接生长、在培育过程中的应用、产生杂种的应用)，但对于所述的本发明不是关键的。
在本说明书中，应当强调，已含有能编码异分支酸途径中一种酶的嵌合DNA的植物，可形成适当的遗传背景用于引入根据本发明的嵌合DNA，例如增强水杨酸的产量，由此增强诱导能力并增强抗性水平。对应于能与DNA一起适当使用的蛋白质之其他基因的克隆，及能相对过量表达该基因的转基因植物的获得，以及对植物病原体抗性的影响的评价，这些现在都处于本领域技术人员的范围之内。
相对过量表达根据本发明的水杨酸的植物或其部分(包括具有增强的病原体抗性的植物品种)，可以在田地、温室中或在室内或别处生长。植物或其可食用部分可用作动物饲料或用于人类摄食，或者可加工为食物、饲料或任何形式的农业或工业中的其他用途。农业是指包括园艺、树木栽培、花栽培等。可从根据本发明的植物材料中获益的工业包括但不限于制药工业、造纸纸浆工业、制糖工业、饲料与食品工业、酶制造等。
根据本发明的植物或其部分的优点是对杀生物剂处理的需求降低，从而降低了材料成本、劳动力和环境污染，或者延长了这些植物的产物(例如果实、种子等)的储存期限。用于本发明的植物是指能进行光合作用并且经受某种形式的病原体攻击的多细胞生物。它们至少包括被子植物以及裸子植物、单子叶植物以及双子叶植物。
短语“相对过量表达一种酶的植物”是指含有表达一种转基因编码酶的细胞的植物，该酶不天然存在于该植物中，或者如果由于编码相同酶的内源基因而存在，则不是以相同的量存在，或者不是存在于相同的植物细胞、细胞区室、组织或器官中。
本发明的另一方面是在长春花的ICS基因5’非翻译区中天然存在的调节序列。已经发现，病原体感染后ICS基因高度表达，表明病原体的诱导性。病原体诱导型启动子(如上述prp1启动子)在生物技术抗性工程中很有价值。
可与根据本发明的ICS调节区结合使用的蛋白质的实例包括但不限于，可从大麦(Swegle M.等人，植物分子生物学12，403-412，1989；Balance G.M.等人，加拿大植物科学杂志(Can.J.Plant Sci.)56，459-466，1976；Hoj P.B.等人，FEBS Lett.230，67-71，1988；Hoj P.B.等人，植物分子生物学13，31-42，1989)、菜豆(Boller T.等人，植物(Planta)157，22-31，1983；Broglie K.E.等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83，6820-6824，1986；Vogeli U.等人，植物174，364-372，1988；Mauch F.和Staehelin L.A.，植物细胞1，447-457，1989)、黄瓜(Metraux J.P.和Boller T.，生理学与分子植物病理学(Phsiol.Mol.Plant Pathol.)28，161-169，1986)、韭菜(Spanu P.等人，植物177，447-455，1989)、玉米(Nasser W.等人，植物分子生物学11，529-538，1988)、燕麦(Fink W.等人，植物生理学88，270-275，1988)、豌豆(Mauch F.等人，植物生理学76，607-611，1984；Mauch F.等人，植物生理学87，325-333，1988)、白杨(Parsons T.J.等人，美国国家科学院院报86，7895-7899，1989)、马铃薯(Gaynor J.J.，核酸研究(Nucl.Acids Res.)16，5210，1988；Kombrink E.等人，美国国家科学院院报85，782-786，1988；LaflammeD.和Roxby R.，植物分子生物学13，249-250，1989)、烟草(例如，Legrand M.等人，美国国家科学院院报84，6750-6754，1987；ShinshiH.等人，美国国家科学院院报84，89-93，1987)、番茄(Joosten M.H.A.和De Wit P.J.G.M.，植物生理学89，945-951，1989)、小麦(MolanoJ.等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)254，4901-4907，1979)中获得的β-1，3-葡聚糖酶和壳多糖酶、爪蟾抗菌肽、凝集素、从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中分离的毒素、从紫茉莉(Mirabilisjalapa)(EP 0 576 483)和苋属(Amaranthus)(EP 0 593 501和US5，514，779)中分离的抗真菌蛋白质、白蛋白型蛋白质(如硫堇、napin、大麦胰蛋白酶抑制剂、谷类麦醇溶蛋白和小麦α-淀粉酶，EP 0 602098)、从萝卜属(Raphanus)、芸苔属(Brassica)、芥属(Sinapis)、拟南芥属(Arabidopsis)、大丽花属(Dahlia)、Cnicus、山黧豆属(Lathyrus)和蝶豆属(Clitoria)中分离的蛋白质(EP 0 603 216)、草酸氧化酶(EP 0 636 181和EP 0 673 416)、糖氧化酶(PCT/EP97/04923)、从葱属(Allium)种子分离的抗微生物蛋白质和从葱木属(Aralia)和凤仙花属(Impatiens)分离的蛋白质(WO 95/24485)等等。
诱导型启动子的另一种用途是引导在基因-基因抗性相互作用中起作用的蛋白质(如WO 91/15585所述)。这些蛋白质是，例如，如Karrer，E.E.等人(植物分子生物学36，681-690，1998)所公开的植物蛋白质、ndr1和eds1、番茄的Cf蛋白和Pto蛋白、黄枝孢的avr引发蛋白和假单胞菌属(Pseudomonas)的avrPto蛋白。
一个克隆，其带有含有3kb插入序列的质粒pMOG 1431，其中含有根据本发明的ICS调节区，于1999年3月19日在荷兰Baarn的真菌菌种保藏中心以保藏号101670保藏。
从实施例中能看出，如SEQ ID NO：25中列出的大约2kb的启动子片段显示可诱导的特性。该2kb片段能如下获得，在XhoⅠ和NcoⅠ位点处剪接SEQ ID NO：25的序列，从而形成SEQ ID NO：25的核苷酸号1118-3275部分。设想该片段能被进一步截短而仍保留诱导性。
下列现有技术可加以考虑，特别是在说明本发明所用技术的普遍水平时。EP-A 392 225 A2；EP-A 440 304 A1；EP-A 460 753 A2；WO90/07001 A1；美国专利4，940，840。
转基因植物的评价
随后对转化植物评价希望特性的存在和/或希望性质表达的程度。第一种评价可能包括新引入的基因的表达水平、表达的水杨酸的水平、病原体相关蛋白质的诱导水平、转化植物的病原体抗性、希望特性的稳定遗传力、田间试验等。
其次，若希望时，转化植物能与其他品种杂交，如具有较高商业价值的品种或已引入其他希望特性的品种，或可用于杂种种子的产生，或可进行另一轮转化，等等。
实验部分
DNA的分离、操作和扩增的标准方法，以及用于重组DNA复制的合适载体、合适的细菌株、选择性标记、培养基等，例如，在Maniatis等人，《分子克隆：实验室手册》第2版(1989)冷泉港实验室出版社；《DNA克隆：第Ⅰ卷和第Ⅱ卷》(D.N.Glover编，1985)；和《从基因到克隆》(E.-L.Winnacker编，1987)中有述。
异分支酸合酶活性的测定
温育混合物(总体积250μl)含有0.1M Tris-HCl pH7.5、2mM分支酸(Chorismate)、10mM MgCl2和酶提取物(粗提物125μl，柱级分10-100μl)。通过加入分支酸开始温育。30℃温育60分钟后，通过加入62.5μl甲醇-异丁醇(1∶1 v/v)终止反应。离心样品，按照Poulsen，C.等人，植物化学(Phytochem.)30，2873-2878，1991所述通过HPLC分析。
实施例1
长春花的ICS的纯化
如前所述(Moreno，P.等人，植物细胞报道12，702-705，1993)在补加有30g/l蔗糖的MS培养基(Murashige和Skoog，1962)中培养长春花(L.)G.Don细胞培养物。如Moreno等人(1993)所述用瓜果腐霉(Pythium aphanisermatum)(CBS，Baarn，荷兰)滤液激发细胞培养物。激发24小时后通过抽吸收集细胞，用水洗一次，立即冷冻于液氮中，-80℃贮存。在装备有不锈钢桶的韦林氏搅切器(WaringBlender)中搅匀600克冷冻细胞。每克鲜重中加入1ml提取缓冲液(0.1M Tris-HCl pH7.5、10％甘油(v/v)、1mM DTT、0.2mM PMSF、10μM亮抑蛋白酶肽和1mM EDTA)和50mg聚乙烯吡咯烷酮。融解后，以10000g离心匀浆30分钟除去细胞碎片。上清液称为粗提物。下列操作在4℃下进行。通过200μm玻璃纤维滤器过滤使粗提物澄清。用配有30kD截断膜的切向流动超滤单元(Provario，PAL-Filtron，Breda，荷兰)浓缩该滤液并使之脱盐。向脱盐提取物加入固体硫酸铵至30％饱和度。搅拌20分钟后，以10000g离心30分钟去除沉淀的蛋白质。向上清液中再加入硫酸铵至60％的饱和度。以10000g离心30分钟收集沉淀的蛋白质。将沉淀溶解于50ml缓冲液A[20mM三乙醇胺-HCl pH7.5、10％(v/v)甘油、1mM DTT和0.2mM PMSF]中，加入固体KCl至2M的终浓度。硫酸铵沉淀导致良好的且可重复的分级分离，而基本上没有ICS活性的丧失。13000g离心15分钟后，将上清液加样于用缓冲液B(缓冲液A+2M KCl)平衡的苯基SepharoseCL-4B柱(72ml，2.6×13.5cm)上。用300ml缓冲液B洗涤该柱后，以1ml/分钟的流速，用700ml从缓冲液B到A的线性梯度，随后用150ml缓冲液A，洗脱ISC活性。收集以10ml为单位的级分。合并含有ICS活性的级分，并使用超滤单元浓缩。浓缩物通过时缓冲液A平衡的Sephadex G-25柱(PD-10柱，Pharmacia，Uppsala)的凝胶过滤脱盐，并加样于20ml BlueA柱上。加样后，停止流动一个半小时使之结合。该柱用40ml缓冲液A洗涤，用160ml从缓冲液A到50％缓冲液B的梯度洗脱ICS。在BlueA柱上的染料亲和层析证明是一个重要的纯化步骤，这导致比活提高15倍。合并含有ICS活性的级分，在用缓冲液C(20mM三乙醇胺-HCl pH8.0、5％(v/v/)甘油和1mMDTT)平衡的PD-10柱上浓缩并脱盐。将脱盐的样品加样于用缓冲液C平衡的MonoQ HR 5/5柱上。该柱用16ml缓冲液C洗涤，用80ml从缓冲液C到D(缓冲液C+0.5M KCl)的线性梯度洗脱ICS。流速为0.5ml/分钟，收集0.5ml的级分。在该柱上，ICS活性分离为两个峰(ICSⅠ和ICSⅡ)。对于ICSⅠ和ICSⅡ，比活分别比粗提物提高了532倍和754倍。ICSⅠ和Ⅱ具有1∶2的活性比，这是在几次独立纯化中发现的数字。任一种ICS的再注射导致在层析谱中只存在注射的ICS。MonoQ级分的天然PAGE显示，ICSⅠ仍含有某些杂质，而ICSⅡ以纯的形式获得。ICSⅡ的SDS-PAGE显示该蛋白质大约为67kD。生物化学性质
两种同种型显示相同的pH依赖性，最适pH宽度为7.0-9.0，在pH6.5和10时具有最大活性的50％。Mg2+的存在是产物形成所必需的。与二价离子Mg2+而不是10mM浓度的Mg2+的分别温育不能保留任一种同种型的酶活性。两种同种型的ICS活性都不受测定混合物中酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的存在抑制。
两种同种型对分支酸都显示米-曼氏动力学。ICSⅠ和ICSⅡ对分支酸的Km值分别为558±5μm和319±41μm。对于为Mg2+浓度函数的两种同种型的酶活性，获得典型的饱和曲线。Mg2+的饱和曲线符合米-曼氏动力学，Km值为1.27±0.36mM(ICSⅠ)和1.63±0.12mM(ICSⅡ)。
实施例2
长春花的ICS基因的克隆
从天然PAGE凝胶中分离含有ICSⅡ的蛋白带，用胰蛋白酶消化，产生大约50种肽。分离并测序其中5种肽。这些肽之一与细菌异分支酸合酶序列显示高度同源性。因此，制备了针对该肽的简并引物。应用该引物和pBluescript的T7引物针对激发的长春花细胞培养物cDNA文库的PCR反应产生520bp的片段。克隆并测序该片段。用440bp的扩增DNA片段筛查激发的长春花细胞培养物的cDNA文库。450000个噬斑的筛查鉴定了52个独立的阳性噬斑。分离其中12个，并用相同的440bp探针进行第二次筛查。这导致7个独立阳性噬斑的鉴定。将它们在体内切开并部分测序。最长的克隆具有2.1kb的插入序列，并且含有ATG起始密码子。第一个ATG周围的区域(TCCAATGGC)非常类似于植物中的共有翻译起始序列(Lutcke等人，EMBO J.，6，43-48，1987)。具有2081bp全长的cDNA含有编码581个氨基酸的1743个核苷酸的开放阅读框。计算的分子量是64kD，等电点为7.88。该蛋白质与细菌的异分支酸合酶大体有30％相同(40％同源)，在C末端区域具有最大同源性。
含有异源启动子控制下的ICS的质粒的构建
在pBluescriptⅡSK(Strategene，CA美国)的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间克隆ICS cDNA。将含有完整cDNA的2kbp BamHⅠ-XhoⅠ片段连接于载体pIC-20H中，用BglⅡ和SalⅠ消化。进一步的部分HindⅢ消化释放2kbp片段，将其克隆到用HindⅢ消化的载体pMOG843中。这将ICS编码序列置于35S CaMV启动子的下游和马铃薯PⅠ-Ⅱ终止序列之前。该质粒被命名为pMOG843-ICS。含有ICS表达盒的二元载体的构建
首先，将35S CaMV启动子-GUS-nos终止盒引入二元载体pMOG22中。实现方法包括，用XbaⅠ和EcoRⅠ消化pMOG101，释放含有该表达盒的2.6kbp片段，将该片段连接到用XbaⅠ和EcoRⅠ消化的pMOG22中。得到的载体是pMOG22-GUS。随后将ICS表达盒克隆到pMOG22-GUS中。这通过用部分XbaⅠ消化pMOG843-ICS，并将3.2kbp片段连接到XbaⅠ消化的pMOG22-GUS中而完成。得到的质粒是pMOG22-GUS-ICS。
用三亲本杂交将二元载体pMOG22-GUS-ICS转移到根癌农杆菌株LBA4404中。烟草转化基本如述(Horsch等人，科学227，1229-1231，1985)用潮霉素作为选择性标记进行。
实施例3
EntC/orfD构建体
利用对大肠杆菌基因组DNA的PCR策略分离entC编码序列(Ozenberger等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171，775-783，1989)。为此，使用引物1(SEQ ID NO：1)和引物2(SEQ ID NO：2)。这将扩增entC的完整编码区，并向两端添加额外的BamHⅠ位点。将该片段克隆到载体pMOG843中，其中通过连接体序列将BamHⅠ位点引入HindⅢ位点中。得到的pMOG834B-entC含有与35S CaMV启动子结合的entC编码序列，随后是马铃薯PⅠ-Ⅱ3’非翻译序列。然后通过XbaⅠ消化及向pIC20H的XbaⅠ位点的克隆，将35S-entC-PⅠ盒转移到pIC20H中。应用pIC20H的部分XbaⅠ消化。因此，该盒位于XbaⅠ位点中，侧翼为EcoRV位点。得到的载体被命名为pIC20H-entC。
利用引物3(SEQ ID NO：3)和引物4(SEQ ID NO：4)从烟草基因组DNA中分离叶绿体转运肽(称为ss)(Mazur和Chui，核酸研究13，2373-2386，1985)。引物3含有一个KpnⅠ位点，其用来将转运肽引入到entC基因之前。载体pIC20H-entC用NcoⅠ消化，随后使粘性位点成为平端，然后用KpnⅠ消化。PCR产物用KpnⅠ消化，并克隆到该载体中。得到的载体pIC20H-entC+ss含有与entC编码序列符合读框的转运肽，缺少entC编码序列的前36个核苷酸。编码的截短entC仍具有是完全活性。
利用引物5(SEQ ID NO：5)和引物7(SEQ ID NO：7)扩增荧光假单胞菌的orfD序列。为了制备orfD编码序列与转运肽编码序列的融合体，使用引物6(SEQ ID NO：6)和引物7。使用引物3和引物8(SEQ ID NO：8)由烟草基因组DNA扩增核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体导向信号。
分别用引物组6/7和3/8获得的扩增片段用NdeⅠ消化，连接，并用引物组3和引物7再扩增。得到的PCR片段含有与转运肽符合读框地融合的orfD序列。这被命名为orfD+ss。orfD和orfD+ss PCR产物都用KpnⅠ和BamHⅠ消化，连接到用KpnⅠ和BamHⅠ消化的pMOG843B中。利用EcoRⅠ和XbaⅠ位点将得到的表达盒转移到二元载体pMOG800中。这产生被命名为pMOG800-orfD和pMOG800-orfD+ss的两种二元载体。
最后，添加entC序列。载体pIC20H-entC+ss用XbaⅠ和ScaⅠ消化，将含有entC+ss表达盒的XbaⅠ片段连接到XbaⅠ消化的pMOG800、pMOG800-orfD和pMOG800-orfD+ss中，制备下列构建体：
pMOG800-entC+ss
pMOG800-entC+ss+orfD
pMOG800-entC+ss+orfD+ss。
通过电转化将全部5种二元载体转化到根癌农杆菌株LBA 4404中。烟草(Samsun NN)中的转化如述利用卡那霉素筛选进行。
实施例4
转化子的分析，酶活性
转基因Samsun NN烟草植物在16小时光照方案下在23-25℃下生长。收集这些初级转化子的叶样品并保存于-80℃下直到进一步使用。
为了测定异分支酸合酶和异分支酸丙酮酸裂合酶的酶活性，从含有entC+orfD构建体和entC+orfD+ss构建体的植物提取。用2.5g叶物质和2.5ml提取缓冲液，基本如述制备蛋白质提取物(Moreno等人，植物细胞报道14，188-191，1994)。用含有100mM Tris-Cl(pH=7.5)补充有1mM DTT的缓冲液进行脱盐。
异分支酸合酶活性如述测定(Poulsen等人，植物化学30，2873-2876，1991)。荧光检测仪及积分仪与HPLC连接，以进行SA的定量(见下)。检测仪的发射波长设为407nm，激发波长为305nm。
两种提取物与Ba-分支酸的温育导致异分支酸和SA的形成，表明该酶以活性形式产生，与转运肽的存在无关。
转化子的分析，水杨酸积累
制备三个初级转化子，对每一个构建体分析结合与游离SA的积累。分别包括TMV-感染的(感染后2天)和未处理的Samsun NN烟草植物作为阳性和阴性对照。应用Meuwly和Metraux(分析生物化学(Anal.Biochem.)214，500-505，1993)所述方案的改良形式。将大约0.5g叶组织在液氮中研磨，通过在超声波水浴中温育5分钟用1ml 90％甲醇提取。然后用台式离心机以13000转每分离心混合液5分钟。弃去上清液，使用如上概述的方法，用0.5ml 100％甲醇再提取沉淀。然后合并上清液级分并完全干燥。将残余物重悬浮于250μl 5％TCA水溶液中，离心，收集上清液，用800μl乙酸乙酯∶环己烷(1∶1，v∶v)抽提两次，之后干燥有机相。然后将残余物溶解于400μl含有10％甲醇的0.1M乙酸钠缓冲液(pH=5.0)中。在注射到HPLC柱之前，短暂离心样品，将上清液转移到一个新试管中。为了测定SA-葡糖苷的量，通过加入等体积的8M HCl酸化乙酸乙酯∶环己烷抽提的水相。然后将混合物在80℃下温育1小时。酸解后，如上所述用为HPLC分析处理的乙酸乙酯∶环己烷抽提SA。
将20μl样品注射到柱上。使用反相Lichrospher 60 RP-Select B(5μm)125mm×4mm柱(Merck，Darmstadt，德国)。在第一次检测中，用Shimadzu荧光HPLC监测器RF-530和Chrompack K-001积分仪定量SA水平。在第二次检测中，使用Shimadzu荧光HPLC监测器RF-10Ax1和Chrompack K-001积分仪。
HPLC洗脱液是0.1M乙酸盐缓冲液(pH=5.0)、10％甲醇。使用的流速为0.9ml/分钟。
结果列于表1中。在含有entcss+orfD和entcss+orfdss的植物中观察到结合水杨酸(SA)的大量积累。在含有后一构建体的植物中，甚至能检测到游离的SA，虽然是低水平。在只用entcss转化的植物中看到结合SA的一定程度的增多。当单独转化orfd时，观察不到游离的SA。表1：初级转化子的1克叶物质的SA积累，游离SA和酸解后。被分析的植物微克游离SA/ 克叶物质 RF-10A×1微克游离SA/克叶物质 RF-530微克结合SA/克叶物质RF-10A×1微克结合SA/ 克叶物质 RF-530 entcss 15 entcss 5 entcss 14 orfd 18 orfd 4 orfd 9 orfdss 10 orfdss 22 orfdss 1 entcss+orfd 4 entcss+orfd 11 entcss+orfd 13 entcss+orfdss 4 entcss+orfdss 16 entess+orfdss 20 TMV1感染的TMV2感染的对照烟草1对照烟草2 P12 - - - - - - - - - - - - 0.25 0.93 0.37 1.01 - - - - - - - - - - - - - - - - - ±0.01 0.42 0.75 - - nt 0.09 - - 0.87 0.20 - - - 1.01 - 0.80 0.08 0.41 6.46 4.39 6.51 - 0.48 - 0.97 - 0.14 - - - - - - - ±0.01 0.84 0.43 0.18 7.36 6.10 8.32 6.22 - - nt
实施例5
用烟草花叶病毒(TMV)对转基因烟草植物的感染试验
对用细菌entC和/或orfD构建体转化的转基因烟草植物(实施例3和4所述)测试其抑制植物病原病毒扩散的能力。每种构建体三种植物，每系8个植物，每个植物3片叶，用含有1μg/ml TMV的悬液接种。该试验中包括烟草转基因P12植物作为对照。通过用金刚砂粉末和病毒悬液擦拭植物来进行接种。接种后用水漂洗叶，再次除去金刚砂粉末。在接种后的第2、4、7天测量病斑大小(每片叶8个病斑)。
用单向ANOVA检验分析并处理数据(α=0.05，SPSS)。植物的病斑大小表示为烟草P12对照植物中测量的病斑大小的百分数。表2：转基因烟草植物中测量的病斑直径相对于对P12对照植物测量的病斑直径的表示 植物系 T=2 T=4 T=7 P12 entc+orfdss 4 entc+orfdss 16 entc+orfdss 20 entc+orfd 4 entc+orfd 11 entc+orfd 13 entc 5 entc 8 entc13 orfd 5 orfd 18 orfd 1 orfdss 16 orfdss 22 orfdss 10 100 57.3 53.3 56.7 94.3 84.0 90.7 97.6 121.8 110.1 107.9 105.2 135.3 96.6 95.9 96.8 100 44.6 36.4 40.8 94.3 85.7 87.6 101.4 91.7 96.2 99.5 99.9 93.9 90.7 84.4 84.7 100 45.7 37.7 51.8 90.1 89.4 88.5 92.7 85.6 93.3 93.4 95.5 86.7 96.7 78.8 86.5用白粉菌番茄粉孢(Oidium lycopersicon)对转基因烟草植物的感染试验
根据测定的SA水平，选择烟草初级转化子用于分析对真菌感染的增强抗性。选择下列系：entc+orfdss4、entc+orfdss16和entc+orfdss20。除这些系之外，该试验中也包括非转基因对照系(wt/Nt/ssnn-1和-2)。采用6周龄的植物，每个系7或8个植物。由初级转化子entc+orfdss16产生的植物在大小上比非转基因对照植物和其他转基因系小。通过喷施3.5×104sp/ml的孢子悬液(总体积400ml)，对植物接种番茄真菌病原体番茄粉孢。在20℃的温度、80％的相对湿度(RH)和16小时光照/8小时暗方案下测试植物。通过测定白粉菌覆盖的叶区域的百分比来确定病害的严重程度。在接种后的第13天、18天和24天对病害的严重程度评分。表3：接种后第13、18、24天(dai)测定的病害严重程度，表示为entc+orfdss转基因烟草系的感染叶区域的百分比。 植物系病害严重程度(％) 13 dai病害严重程度(％) 18 dai病害严重程度(％) 24 dai entc+orfdss4 entc+orfdss 16 0* 5 0* 5 ＜5 5 5 0 5 5 10 5 0* 40 0* 10 0 10 20 0 30 30 50 35 0* 60 0* 20 0 40 20 ＜5 50 50 40 50 10 50 40
5 20 40
5 40 40
5 40 40entc+orfdss 20 ＜5 20 60
＜5 40 60
＜5 40 60
＜5 - -
5 50 50
5 ＜5 50
10 40 50 wt/Nt/ssnn-1 5 30 40
15 50 40
5 20 30
5 20 50
5 40 30
5 30 50
5 40 50
10 25 40 wt/Nt/ssnn-2 10 40 60
10 40 70
10 25 60
5 60 50
10 50 40
＜5 - -
5 50 40注意：-=植物在试验过程中死亡。
*=植物在叶上有坏死斑。
不针对目的基因的存在筛选转基因系的T1子代。因此所测试的群体可能具有分离的T-DNA基因座，因此也能观察到抗性的分离(如在ente+orfdss4系中)。
实施例6
PR基因表达的诱导
从0.5克叶物质中分离RNA。通过在液氮中研磨叶物质并用0.5ml含有0.35M甘氨酸、0.048M NaOH、0.34M NaCl、0.04M EDTA和4％SDS的缓冲液抽提，提取RNA。随后用酚/氯仿(1∶1，v∶v)的水饱和溶液、酚和酚/氯仿抽提该制品。向水相中加入一半体积的8MLiCl，将样品于4℃贮存过夜。离心后，用70％乙醇洗涤沉淀，并溶解于水中。
每种样品的10μg RNA在50℃下经乙醛酸化处理1小时，并以7V/cm条件在15mM磷酸钠缓冲液(pH=6.5)中在15mM磷酸钠1.5％琼脂糖凝胶中电泳。定时混合阳极和阴极缓冲液。
将凝胶印迹到Hybond-N+尼龙膜上，在80℃下交联并烘烤(见图2)。
用450 bp PstⅠ片段作为探针。用32p-dCTP标记的随机引物标记。印迹杂交过夜，随后用2×SSC、0.1％SDS在65℃下洗涤。用增感屏在-80℃下曝光3天。方法如Feinberg和Vogelstein，分析生物化学137，266-267，1984；Cornelissen，B.等人，核酸研究17，6799-6811，1987；Payne等人，植物分子生物学11，89-94，1988；Pfitzner等人，分子普通遗传学211，290-295，1988所述。表4：在体外及在转化及对照烟草Samsun NN植物中的SA定性合成和PR-1a表达
植物体外SA合成游离SA SA葡糖苷PR-1a表达entC+ss nd - + -orfD nd - - -orfD+ss nd - - -entC+ss+orfD + - + -entC+ss+orfD+ss + ++ ++ +对照烟草 nd - - -TMV感染的 nd ++ ++ +
结果显示于表4中。在TMV感染的植物中及含有entC+ss+orfD+ss的转化植物中，PR-1a转录物的积累是明显的。
实施例7
用恶疫霉(Phytophthora cactorum)对长春花的感染试验
通过将一小滴(15-20μl)恶疫霉菌丝悬液置于在叶上形成的0.5cm小切口上，接种大约50cm高的长春花植物，以使真菌能够进入。
真菌感染可在18℃和高相对湿度(±90％)下进行。接种48小时后和接种6天后收集具有感染部位的叶盘(直径=13mm)。接种48小时后在未感染叶组织中和接种叶的未感染区域中收集对照叶片。从感染的叶组织中对RNA的提取及cDNA合成
用Quickprep Micro mRNA纯化试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，瑞典)从100mg叶组织中收获Poly-A+RNA。通过在UV照明装置上用4μl 1μg/ml溴化乙锭显现10μl样品，由核酸显示测定mRNA的相对量。
如制造商所述，用200单位SuperscriptⅡRT RNAse H-反转录酶(Gibco BRL)和1μl oligo(dT)12-18引物(500μg/ml，Gibco BRL)，用等量Poly-A+RNA(±100ng)合成cDNA。PCR MIMIC的构建和用竞争性RT-PCR对样品的分析
为了构建在cRT-PCR实验中用作竞争剂的PCR MIMIC，制备下列引物：FR-pUC-257(SEQ ID NO：9)5’ATA GAA ACG AGG ACACTT CCA CGT TAA GGG ATT TTG G 3’、FR-pUC-258(SEQ IDNO：10)5’ATA AGC ACG GAT TAA TGG GCC GGA GCT GAA TGAAGC C 3’、FR-ICS-255(SEQ ID NO：11)5’ATA GAA ACG AGG ACACTT CC 3’和FR-ICS-256(SEQ ID NO：12)5’ATA AGC ACG GATTAA TGG GC 3’。引物FR-pUC-257和FR-pUC-258用来通过PCR由质粒pUC18扩增527bp片段(Yanisch-Perron，C.等人，基因33，103-119，1985)。用引物FR-ICS-255和FR-ICS-256通过PCR可由该PCR产物扩增1μl，产生大量的PCR MIMIC。
引物FR-ICS-255和FR-ICS-256将由ICS cDNA扩增一条443bp的带，因此在1.5％琼脂糖凝胶上分离时它能与527bp MIMIC带轻易地区分开来。
在含有0.2μg/μl糖原作为载体的H2O中以10ng/μl-0.1ag/μl的范围进行PCR MIMIC稀释。
用竞争性PCR分析cDNA样品。因此在0.5ml试管中将2μl cDNA样品与1μl稀释的MIMIC(量：0.1 pg、10fg、1fg和0.1fg)合并或不含MIMIC。用10μM引物FR-ICS-255和FR-ICS-256、0.5μl 20mMdNTP’s、1×PCR缓冲液、MgCl2和2.5单位重组Taq DNA聚合酶(GibcoBRL)进行cDNA和MIMIC的扩增，并进行1’95℃、1’55℃、2’72℃的35个循环。表5：恶疫霉感染长春叶后，ICS信使相对于对照的诱导水平。样品 诱导倍数对照接种后48小时接种后6天未感染的叶区域b 1 ＞100a 10a 1注：a：与对照相比的诱导倍数
b：未感染的叶区域是未被真菌感染的接种叶的区域
实施例8
用iPCR对长春花异分支酸合酶启动子的分离
根据ICS cDNA序列(SEQ ID NO：18)制备PCR引物。引物FR-ICS-259 5’TGG TGA TCC AAG AGC TCC GG 3’(SEQ ID NO：20)和FR-ICS-260 5’CCT GGT TGA AAG GTC TGT G 3’(SEQ IDNO：21)用于iPCR，引物FR-ICS-261 5’GCA ACA CAA TGC CCTGTG 3’(SEQ ID NO：22)用于巢式PCR。
用CTAB DNA提取方法分离长春花基因组DNA。基因组DNA用5种不同的酶DdeⅠ、KpnⅠ、MscⅠ、NcoⅠ和NlaⅣ进行限制酶消化。限制酶消化后，用酚/氯仿/异戊醇抽提DNA，并用乙醇沉淀。DNA沉淀溶解于50μl水中，用25μl进行iPCR。为此，用含有5单位T4 DNA连接酶(Gibco BRL)的1×连接酶缓冲液(Gibco BRL)将消化的DNA混合物的体积提高到300μl。该混合物在16℃下温育16小时。连接后再次用酚/氯仿/异戊醇抽提DNA，用乙醇沉淀，并溶解于50μl水中。
2μl该混合液用作PCR反应的模板，该反应使用150ng引物FR-ICS-259和FR-ICS-269、1×Klentaq PCR缓冲液、10μM dNTP和1.0μl 50×Advantage cDNA聚合酶混合物(Clontech，Palo Alto，CA，美国)。完全反应混合物进行94℃1’和30个循环的94℃30”、55℃1’、68℃3’。然后用1μl该反应液进行巢式PCR。因此使用类似的方法，但将引物FR-ICS-260替换为引物FR-ICS-261。 iPCR的结果列于表6中。表6：用5种不同酶iPCR后获得的带 限制酶 iPCR条带大小(bp) DdeⅠ KpnⅠ MscⅠ NcoⅠ NlaⅣ 100 900 - 3000 900将从KpnⅠ、NcoⅠ和NlaⅣ消化产生的PCR带克隆到T/A克隆载体pGEM-T(Promega)中。测定插入序列的DNA序列。
实施例9
用直接PCR对ICS启动子的分离
根据克隆的PCR片段的DNA序列制备新的PCR引物。这些引物位于启动子的远端上游部分和ICS开放阅读框的ATG翻译起始密码子处。引物FR-ICS-295 5’GCA AGC TTC ATG TAC CTT ATCTTG GCC 3’(SEQ ID NO：23)位于启动子的上游末端，并引入一个HindⅢ限制位点，引物FR-ICS-296 5’TAG ATG CCA TGG GATGGG AG 3’(SEQ ID NO：24)位于ICS开放阅读框的起始密码子处，引入一个与ATG翻译起始区重叠的NcoⅠ限制位点。
在对长春花基因组DNA的PCR反应中使用这些引物(150ng)，使用1×Klentaq PCR缓冲液、10μM dNTP和2.0μl 50×AdvantagecDNA聚合酶混合物(Clontech，Palo Alto，CA，USA)。完全反应混合物(100μl)进行94℃1’和30个循环的94℃30”、55℃1’、68℃4’反应。从琼脂糖凝胶中分离正确大小(3.0kb)的带，纯化，并用限制酶HindⅢ和NcoⅠ克隆到基于pUC18的高拷贝克隆载体中(Yanisch-Perron，C.，Vieira，J.和Messing，J.(1985)基因33，103-119)，形成质粒pMOG 1431。用自动DNA测序法测定完整启动子片段的DNA序列(SEQ ID NO：25)。用HindⅢ和NcoⅠ酶切切出该启动子，连接于HindⅢ、NcoⅠ消化的克隆载体中，该载体含有GUS内含子(Jefferson等人，(1987)EMBO J 6：3901-3907)，随后是马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的3’非翻译区(Thornburg等人，1987，美国国家科学院院报84，744-748)，该区含有聚腺苷酸化所需的序列(An等人，1989，植物细胞1，115-122)。然后用限制酶XhoⅠ将表达单元转移到二元载体pMOG800(于1993年8月12日在荷兰Baarn的真菌菌种保藏中心，保藏号为CBS 414.93)中。用XhoⅠ将实际3.0kb中的2.0Kb启动子转移到该二元载体中。筛选以正确方向含有完整表达单元的克隆，例如在T-DNA上与正确边缘重复序列相邻的启动子。得到的质粒命名为pMOG1433。
实施例10
ICS启动子-GUS二元载体向马铃薯的转化
基本如Hoekema等人(Hoekema等人，生物技术7，273-278，1989)所述向马铃薯中转化pMOG1433。简言之，马铃薯(马铃薯Solanum tuberosum cv.Kardal)用农杆菌株EHA 105 pMOG 1433转化。基本培养基是由MS盐(Murashige和Skoog(1962)植物生理学14，473)、R3维生素(Ooms等人(1987)理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)73，744)、30g/l蔗糖、0.5g/l MES组成的MS30R3培养基，终pH为5.8(用KOH调节)，必要时用8g/l Daichin琼脂凝固。将马铃薯cv.Kardal的块茎去皮，通过在96％乙醇中燃烧5秒种消毒表面。用无菌水熄灭火焰，并切下大约2mm厚的切片。将片从维管组织切开一个孔，并在含有含二元载体的1-5×108细菌/ml农杆菌EHA 105的MS30R3培养基中温育20分钟。块茎片用MS30R3培养基洗涤，并转移到凝固的后培养基(PM)中。PM由补充了3.5mg/l玉米素核糖核苷和0.03mg/l吲哚乙酸(IAA)的MS30R3培养基组成。两天后，将片转移到含有200mg/l头孢噻肟和100mg/l万古霉素的新鲜PM培养基中。三天后，将块茎片转移到含有250mg/l羧苄青霉素和100mg/l卡那霉素的PM培养基组成的幼苗诱导培养基(SIM)中。4-8周后，切下从片上长出的幼苗，置于生根培养基(含有100mg/l头孢噻肟、50mg/l万古霉素和50mg/l卡那霉素的MS30R3培养基)中。通过分生组织插条无菌繁殖幼苗。
实施例11
转基因马铃薯植物中启动子功能的检测
在试管中体外培养带有pMOG1433 ICS启动子-GUS构建体的转基因马铃薯植物，测定GUS基因的表达。为此，采用叶、茎和根样品(表7中的结果)并染色。按0-5的等级目测GUS表达水平，0是没有可检测的表达，5是在一种转基因植物的叶中观察到的最高水平的GUS，该植物是罕见的烟草35S-GUS-转基因植物(系96306)。在全部实验中包括该植物的叶样品作为内部参考。表7：ICS启动子引导的GUS基因在体外小植物的叶、茎和根中的表达 植物编号 叶 茎 根 1433-1 1433-2 1433-3 1433-4 1433-5 1433-6 1433-7 1433-8 1433-9 1433-10 1433-11 1433-12 1433-13 1433-14 1433-15 1433-16 1433-17 1433-18 1433-19 1433-20 1433-21 1433-22 1433-23 1433-24 1433-25 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1
相同年龄的体外小植物感染引起马铃薯晚期枯萎病的真菌致病疫霉(Phytophthora infestans)。将含有高浓度真菌孢子的小滴水施加于叶表面。使感染在室温下进行96小时。从小植物中去除表现病害特征的叶，并通过组织化学GUS分析对GUS基因的表达染色(Goddijn等人，植物杂志(The Plant Journal)(1993)4(5)：863-873)。结果列于表8中。在真菌感染引起的病斑处，在原发区(感染部位周围的区域)以及在叶的未感染部分(背景)，监测表达。表8：ICS启动子引导的US基因在致病疫霉感染的马铃薯体外小植物叶中的表达植物编号感染前病斑原发区 背景 1433-1 1433-2 1433-3 1433-4 1433-5 1433-6 1433-7 1433-8 1433-9 1433-10 1433-11 1433-12 1433-13 1433-14 1433-15 1433-16 1433-17 1433-18 1433-19 1433-20 1433-21 1433-22 1433-23 1433-24 1433-25 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0* 0 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0* 0 1 0 0 1 2 1 1 1 1 1 1 1 0* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0* 0注：*=未感染/没有可见病害特征的植物
也在致病疫霉感染之前及之后测定了启动子在完全生长的马铃薯植物叶中的表现。接种前，分离叶，并对GUS的表达染色。然后对植物喷施5×105孢子/ml的孢子悬液，感染进行4天(96小时)。再次分离叶，对GUS的表达染色。在病斑、原发区和叶的未感染部分(背景)对GUS表达水平评分。结果列于表9中。表9：致病疫霉感染之前及之后，ICS启动子引导的US基因在转基因马铃薯植物叶中的表达植物编号感染前 病斑 原发区 背景 1433-1 1433-2 1433-3 1433-4 1433-5 1433-6 1433-7 1433-8 1433-10 1433-11 1433-12 1433-13 1433-14 1433-15 1433-16 1433-17 1433-18 1433-19 1433-20 1433-21 1433-22 1433-23 1433-24 1433-25 1 1 1 1 1 1 1 3 1 0 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 3 3 4 0 4 0 2 0 0 0 4 0 4 0 0 0 4 0 4 0 2 4 2 0 2 0 3 2 2 0 2 2 2 2 3 0 4 0 0 2 4 4 4 4 3 4 2 4 3 4 1 0 1 0 0 1 0 2 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1
【序列表】
<110>MOGEN International nv
<120>水杨酸途径基因及其在诱导植物抗性中的应用
<130>46049 PCT
<140>
<141>
<150>US 60/080，625
<151>1998-04-03
<150>US 60/080，203
<151>1998-03-31
<160>25
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>1
gtcgaggatc catggatacg tcactggctg 30
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>2
gaatggaatg cggatcctcg ctccttaatg c 31
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
gcgggtacca caatggcttc ctcagttctt tcc 33
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>4
cattgcactc ttccgccg 18
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>5
gcgggtacca tgctgccgct aaaaccgcca 30
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
gcgcatatgc tgccgctaaa accgcca 27
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>7
cgcggatcct catgacttgg cctgcgccga gta 33
<210>8
<211>33
212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
cgccatatgg cattgcactc ttccgccgtt gct 33
<210>9
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>9
atagaaacga ggacacttcc acgttaaggg attttgg 37
<210>10
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>10
ataagcacgg attaatgggc cggagctgaa tgaagcc 37
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>11
atagaaacga ggacacttcc 20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>12
ataagcacgg attaatgggc 20
<210>13
<211>1659
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(380)..(1555)
<223>/功能=“异分支酸合酶”entC蛋白质
<400>13
gagtctcaca aatcagcttc ctgttattaa taaggttaag ggcgtaatga caaattcgac 60
aaagcgcaca atccgtcccc tcgcctttgg gagagggtta gggtgagggg aacagccagc 120
actggtgcga acattaaccc tcaccccagc cctcaccctg gaaggagagg gggcagaacg 180
gcgcaggaca tcacattgcg cttatgcgaa tccatcaata atgcttctca ttttcattgt 240
aaccacaacc agatgcaacc ccgagttgca gattgcgtta cctcaagagt tgacatagtg 300
cgcgtttgct tttaggttag cgaccgaaaa tataaatgat aatcattatt aaagccttta 360
tcattttgtg gaggatgat atg gat acg tca ctg gct gag gaa gta cag cag 412
Met Asp Thr Ser Leu Ala Glu Glu Val Gln Gln
1 5 10
acc atg gca aca crt gcg ccc aat cgc ttt ttc ttt atg tcg ccg tac 460
Thr Met Ala Thr Leu Ala Pro Asn Arg Phe Phe Phe Met Ser Pro Tyr
15 20 25
cgc agt ttt acg acg tca gga tgt ttc gcc cgc ttc gat gaa ccg gct 508
Arg Ser Phe Thr Thr Ser Gly Cys Phe Ala Arg Phe Asp Glu Pro Ala
30 35 40
gtg aac ggg gat tcg ccc gac agt ccc ttc cag caa aaa ctc gcc gcg 556
Val Asn Gly Asp Ser Pro Asp Ser Pro Phe Gln Gln Lys Leu Ala Ala
45 50 55
ctg ttt gcc gat gcc aaa gcg cag ggc atc aaa aat ccg gtg agt gtc 604
Leu Phe Ala Asp Ala Lys Ala Gln Gly Ile Lys Asn Pro Val Met Val
60 65 70 75
ggg gcg att ccc ttc gat cca cgt cag cct tcg tcg ctg tat att cct 652
Gly Ala Ile Pro Phe Asp Pro Arg Gln Pro Ser Ser Leu Tyr Ile Pro
80 85 90
gaa tcc tgg cag tcg ttc tcc cgt cag gaa aaa caa gct tcc gca cgc 700
Glu Ser Trp Gln Ser Phe Ser Arg Gln Glu Lys Gln Ala Ser Ala Arg
95 100 105
cgt ttc acc cgc agc cag tcg ctg aat gtg gtg gaa cgc cag gca att 748
Arg Phe Thr Arg Ser Gln Ser Leu Asn Val Val Glu Arg Gln Ala Ile
110 115 120
ccg gag caa acc acg ttt gaa cag atg gtt gcc cgc gcc gcc gca ctt 796
Pro Glu Gln Thr Thr Phe Glu Gln Met Val Ala Arg Ala Ala Ala Leu
125 130 135
acc gcc acg ccg cag gtc gac aaa gtg gtg ttg tca cgg ttg att gat 844
Thr Ala Thr Pro Gln Val Asp Lys Val Val Leu Ser Arg Leu Ile Asp
140 145 150 155
atc acc act gac gcc gcc att gat agt ggc gta ttg ctg gaa cgg ttg 892
Ile Thr Thr Asp Ala Ala Ile Asp Ser Gly Val Leu Leu Glu Arg Leu
160 165 170
att gcg caa aac ccg gtt agt tac aac ttc cat gtt ccg ctg gct gat 940
Ile Ala Gln Asn Pro Val Ser Tyr Asn Phe His Val Pro Leu Ala Asp
175 180 185
ggt ggc gtc ctg ctg ggg gcc agc ccg gaa ctg ctg cta cgt aaa gac 988
Gly Gly Val Leu Leu Gly Ala Ser Pro Glu Leu Leu Leu Arg Lys Asp
190 195 200
ggc gag cgt ttt agc tcc att ccg tta gcc ggt tcc gcg cgt cgt cag 1036
Gly Glu Arg Phe Ser Ser Ile Pro Leu Ala Gly Ser Ala Arg Arg Gln
205 210 215
ccg gat gaa gtg ctc gat cgc gaa gca ggt aat cgt ctg ctg gcg tca 1084
Pro Asp Glu Val Leu Asp Arg Glu Ala Gly Asn Arg Leu Leu Ala Ser
220 225 230 235
gaa aaa gat cgc cat gaa cat gaa ctg gtg act cag gcg atg aaa gag 1132
Glu Lys Asp Arg His Glu His Glu Leu Val Thr Gln Ala Met Lys Glu
240 245 250
gta ctg cgc gaa cgc agt agt gag tta cac gtt cct tct tct cca cag 1180
Val Leu Arg Glu Arg Ser Ser Glu Leu His Val Pro Ser Ser Pro Gln
255 260 265
ctg atc acc acg ccg acg ctg tgg cat ctc gca act ccc ttt gaa ggt 1228
Leu Ile Thr Thr Pro Thr Leu Trp His Leu Ala Thr Pro Phe Glu Gly
270 275 280
aaa gcg aat tcg caa gaa aac gca ctg act ctg gcc tgt ctg ctg cat 1276
Lys Ala Asn Ser Gln Glu Asn Ala Leu Thr Leu Ala Cys Leu Leu His
285 290 295
ccg acc ccc gcg ctg agc ggt ttc ccg cat cag gcc gcg acc cag gtt 1324
Pro Thr Pro Ala Leu Ser Gly Phe Pro His Gln Ala Ala Thr Gln Val
300 305 310 315
att gct gaa ctg gaa ccg ttc gac cgc gaa ctg ttt ggc ggc att gtg 1372
Ile Ala Glu Leu Glu Pro Phe Asp Arg Glu Leu Phe Gly Gly Ile Val
320 325 330
ggt tgg tgt gac agc gaa ggt aac ggc gaa tgg gtg gtg acc atc cgc 1420
Gly Trp Cys Asp Ser Glu Gly Asn Gly Glu Trp Val Val Thr Ile Arg
335 340 345
tgc gcg aag ctg cgg gaa aat cag gtg cgt ctg ttt gcc gga gcg ggg 1468
Cys Ala Lys Leu Arg Glu Asn Gln Val Arg Leu Phe Ala Gly Ala Gly
350 355 360
att gtg cct gcg tcg tca ccg ttg ggt gag tgg cgc gaa aca ggc gtc 1516
Ile Val Pro Ala Ser Ser Pro Leu Gly Glu Trp Arg Glu Thr Gly Val
365 370 375
aaa ctt tct acc atg ttg aac gtt ttt gga ttg cat taa ggagcgagga 1565
Lys Leu Ser Thr Met Leu Asn Val Phe Gly Leu His
380 385 390
tgagcattcc attcacccgc tggccgaaga gtttgcccgt cgctatcgga aaaaggatac 1625
tgcagatttc gctgaccgac attctgacgc aact 1659
<210>14
<211>272
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>14
Gln Ala Ile Pro Glu Gln Thr Thr Phe Glu Gln Met Val Ala Arg Ala
1 5 10 15
Ala Ala Leu Thr Ala Thr Pro Gln Val Asp Lys Val Val Leu Ser Arg
20 25 30
Leu Ile Asp Ile Thr Thr Asp Ala Ala Ile Asp Ser Gly Val Leu Leu
35 40 45
Glu Arg Leu Ile Ala Gln Asn Pro Val Ser Tyr Asn Phe His Val Pro
50 55 60
Leu Ala Asp Gly Gly Val Leu Leu Gly Ala Ser Pro Glu Leu Leu Leu
65 70 75 80
Arg Lys Asp Gly Glu Arg Phe Ser Ser Ile Pro Leu Ala Gly Ser Ala
85 90 95
Arg Arg Gln Pro Asp Glu Val Leu Asp Arg Glu Ala Gly Asn Arg Leu
100 105 110
Leu Ala Ser Glu Lys Asp Arg His Glu His Glu Leu Val Thr Gln Ala
115 120 125
Met Lys Glu Val Leu Arg Glu Arg Ser Ser Glu Leu His Val Pro Ser
130 135 140
Ser Pro Gln Leu Ile Thr Thr Pro Thr Leu Trp His Leu Ala Thr Pro
145 150 155 160
Phe Glu Gly Lys Ala Asn Ser Gln Glu Asn Ala Leu Thr Leu Ala Cys
165 170 175
Leu Leu His Pro Thr Pro Ala Leu Ser Gly Phe Pro His Gln Ala Ala
180 185 190
Thr Gln Val Ile Ala Glu Leu Glu Pro Phe Asp Arg Glu Leu Phe Gly
195 200 205
Gly Ile Val Gly Trp Cys Asp Ser Glu Gly Asn Gly Glu Trp Val Val
210 215 220
Thr Ile Arg Cys Ala Lys Leu Arg Glu Asn Gln Val Arg Leu Phe Ala
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ile Val Pro Ala Ser Ser Pro Leu Gly Glu Trp Arg Glu
245 250 255
Thr Gly Val Lys Leu Ser Thr Met Leu Asn Val Phe Gly Leu His
260 265 270
<210>15
<211>5057
<212>DNA
<213>荧光假单胞菌
<220>
<221>CDS
<222>(207)..(1382)
<223>/功能=“异分支酸合酶”orfA蛋白质
<220>
<22l>CDS
<222>(4516)..(4851)
<223>/功能=“异分支酸丙酮酸裂合酶”orfD蛋白质
<400>15
gaattcggca tacagatgag ctgaaacttt ccctaaaaac gcatgagcag tccgcccgat 60
ccaacaggcg gcttgcattg aagttaactc tctcatggct cactcatgtg attgacaaat 120
cgtaatgatt agcatcacat attagaaacg ataatgattc tatttcaagt ttctttttat 180
ccctaggcca cggaggcttc ccccaa atg aga acg ggc acc cta aga acg acc 233
Met Arg Thr Gly Thr Leu Arg Thr Thr
1 5
gag atg gaa gag gtg caa ctc gca gag gta caa cgt agt ttt tcg ttc 281
Glu Met Glu Glu Val Gln Leu Ala Glu Val Gln Arg Ser Phe Ser Phe
10 15 20 25
aca tcc ggc gat cgc gag tta gcg gtc acc ggg atg ctg cag aga att 329
Thr Ser Gly Asp Arg Glu Leu Ala Val Thr Gly Met Leu Gln Arg Ile
30 35 40
gaa aca cct gcc att ggc ggc gat gac gcc aat agc ctg ttc cag cag 377
Glu Thr Pro Ala Ile Gly Gly Asp Asp Ala Asn Ser Leu Phe Gln Gln
45 50 55
aca att gcg caa gcg ctt gat cgg gcg cgc gaa gct ggc cag agc aac 425
Thr Ile Ala Gln Ala Leu Asp Arg Ala Arg Glu Ala Gly Gln Ser Asn
60 65 70
cca atc atc gtt ggc gcc atc cct ttc gac cct gct gaa cct tcc tgc 473
Pro Ile Ile Val Gly Ala Ile Pro Phe Asp Pro Ala Glu Pro Ser Cys
75 80 85
ctc tac att ccc gaa cac gcg caa tgg cgg acc cga gac atc cac gcg 521
Leu Tyr Ile Pro Glu His Ala Gln Trp Arg Thr Arg Asp Ile His Ala
90 95 100 105
aaa acg ggt atg tcg acg ctg cct gag ttg atc gaa cag aaa aac att 569
Lys Thr Gly Met Ser Thr Leu Pro Glu Leu Ile Glu Gln Lys Asn Ile
110 115 120
ccg gac gaa cag gcc ttc aaa cgg gcg gtg gaa cac gcc gtc gtc aac 617
Pro Asp Glu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Val Glu His Ala Val Val Asn
125 130 135
ttc cgc cac agc gac gta cgc aag gct gtg ctc tcg gtt caa cgc gag 665
Phe Arg His Ser Asp Val Arg Lys Ala Val Leu Ser Val Gln Arg Glu
140 145 150
ctg ata ttt gca aac gat gtg gat gtg agt gcc ctg cag cac aac ctg 713
Leu Ile Phe Ala Asn Asp Val Asp Val Ser Ala Leu Gln His Asn Leu
155 160 165
aaa gcc cag aac ccg agc ggc tac cac ttc cgt gtg cca atg cct gat 761
Lys Ala Gln Asn Pro Ser Gly Tyr His Phe Arg Val Pro Met Pro Asp
170 175 180 185
ggc acc acg ctg atc ggt gtc agt ccc gaa ctt ctg gtc cgc aag gaa 809
Gly Thr Thr Leu Ile Gly Val Ser Pro Glu Leu Leu Val Arg Lys Glu
190 195 200
ggc ctg agc tct ctg tcc aac ccg ctg gca ggg tca gcc aag cgc atg 857
Gly Leu Ser Ser Leu Ser Asn Pro Leu Ala Gly Ser Ala Lys Arg Met
205 210 215
gcc gat cca gaa gcc gac cgg cgc aat gca gac tgg ttg ctg aca tcg 905
Ala Asp Pro Glu Ala Asp Arg Arg Asn Ala Asp Trp Leu Leu Thr Ser
220 225 230
gaa aaa gat cac tac gaa cac ggg ttc gtg acc cag gac atc gtc agc 953
Glu Lys Asp His Tyr Glu His Gly Phe Val Thr Gln Asp Ile Val Ser
235 240 245
caa ctg ggg aaa ctg tgc acg cag ctg aat gtg ccg caa cgc ccc tcc 1001
Gln Leu Gly Lys Leu Cys Thr Gln Leu Asn Val Pro Gln Arg Pro Ser
250 255 260 265
ctc atc agc acg ccc gcg ctc tgg cac ctc tcg acc cgc atc gaa ggt 1049
Leu Ile Ser Thr Pro Ala Leu Trp His Leu Ser Thr Arg Ile Glu Gly
270 275 280
acg ctg gca gac ccg gct gta tcg gcc ttg cag ctt gcc tgc cgc ttg 1097
Thr Leu Ala Asp Pro Ala Val Ser Ala Leu Gln Leu Ala Cys Arg Leu
285 290 295
cac ccc aca ccg gct gtg tgc ggc ttc ccc acc gag cgc gcc cgg cgc 1145
His Pro Thr Pro Ala Val Cys Gly Phe Pro Thr Glu Arg Ala Arg Arg
300 305 310
ctg att cgc ttc gtc gaa ccc ttc gag cgc ggc ctg ttc acc ggc atg 1193
Leu Ile Arg Phe Val Glu Pro Phe Glu Arg Gly Leu Phe Thr Gly Met
315 320 325
gtg ggt tgg tgc gat gcc cag ggc aat ggc gaa tgg gtc gta acg att 1241
Val Gly Trp Cys Asp Ala Gln Gly Asn Gly Glu Trp Val Val Thr Ile
330 335 340 345
cgt tgc ggc acg gtc agg cga aac aag gtc cgc ctg ttc gcc ggc gca 1289
Arg Cys Gly Thr Val Arg Arg Asn Lys Val Arg Leu Phe Ala Gly Ala
350 355 360
ggc atc gtt gaa gcc tca agc ccc gac tcc gaa tgg gca gaa gtc cag 1337
Gly Ile Val Glu Ala Ser Ser Pro Asp Ser Glu Trp Ala Glu Val Gln
365 370 375
acc aaa ctt ggc acc atc gtg cgc gcc tgc gga ttg gcc cac taa 1382
Thr Lys Leu Gly Thr Ile Val Arg Ala Cys Gly Leu Ala His
380 385 390
ctcgaatttt ttcacacgtg aatactatga ctattgaatt taaccactgg cctctggaaa 1442
gcgcacagcg ttatcgggac aaaggctatt ggctcgacaa accgctcacc cacctccttc 1502
aggaacgcag ccagtcgcaa cccgacgccc ccgcgattat ttgcggcgat cgccacttca 1562
gctatgccga gttggaccaa ttgtcttcca acctggcctc gcgactggcc gccagcgggc 1622
ttggcaacgg tgacactgca ctggtgcagt tgcccaatat cgcggagttt tacattgtcc 1682
tttttgccct gctcaagtca ggaatcgcac ccctcaacgc gctctacagc catcgcaaac 1742
ttgaactcaa gagttacgcc aaacaaatcg cgccaacgtt gttgattgcc tcccgcgaac 1802
atgaagtctt ccgtgacgac agctatatcg ccgacttcaa ggaggtgggt tcaagtccag 1862
acatcatctt gctgttgggc gagcaacgtc acgaaaacaa cctcgccgac tggatcaata 1922
cgccgagcga gagcaacgtg aacgtctccc cctcggggcc cggcgaggtc gcattgttcc 1982
aactgtcagg cggcagcacg ggcaccccca aactcatccc ccgcactcac aacgactatt 2042
actacaacgc cagggcaagc gcgcaagtat gcgaacttac gccacgcacg cgctttctat 2102
gcgcgctacc tgccgcccat aacttcttgc tcagctcccc cggcgccctc ggtgttctac 2162
atgctggcgg ctgcatcatc atggcgccca gcccggagcc cttgacctgt ttttcgatca 2222
tccagcgcca agaagtcaat actgtggcct tggtgccaag tgcagtcgcc ttgtggctgc 2282
aggcagcgcc ggagcataaa gaacaactgc aatcgcttga gttcctccag gtcggtggcg 2342
cctgttttgc cgactcgctg gcacgccagg tgcccggcgt gctcggttgt aagctgcaac 2402
aggtattcgg gatggccgaa ggcctgatca actacacccg gctaaatgac tccgacgaac 2462
agatttttac tacccagggc cgtccgatca gccccgacga tgaaatcaaa atcgttgacg 2522
aacaaggcct ccccgtcccg gacggagaac ctggcatgct cgccacacgt ggcccttaca 2582
ctttttgcgg gtactaccaa agccccgaac aaaatgccca ggcgttcgat aacgaggggt 2642
actactactc cggcgacctc gtccaactca tgcccagcgg cgatttgcgc gtggtcggca 2702
gggtcaagga ccagatcaac cgtggcggtg aaaaagtcgc ctcggaggaa atcgaaaacc 2762
tcatcgtcct ccatcctgat gtgactcacg cgggcttggt ggccatgccc gatgacaggc 2822
tgggagaaaa aagctgcgcg ttcgtcgtct cacgcaaccc gagcctgaag ccgcccgcgc 2882
tcagacgtca cctgatggaa ctcggcatcg ccgaatacaa actgcccgac cgcatccggt 2942
taatcgaaac catgccgctg acccccgtgg gcaagattga caagaagcat ctgcgtcagc 3002
ttctggcagc ggaaaccaca cgcgcctggt tgcagactcg cgtgcggcaa ctcgtcgagg 3062
actgtgaaga cctggacccc gaggaaaacc tgattttcta tggcctcgac tccttgcaag 3122
tgatgagact cgctgccgaa ctcaaggagc gtggcattgc cgtcagcttc gaagaactgg 3182
cggattcgcc cacgctcagc agctggtggt cattggtaga cgcgaggcag atagccgcct 3242
gaccgggcgg cgtcacccag tcgttttaaa aggagttaga catgacttta tcccctgccg 3302
accaaagcaa gcttgaaggc ttctggcagc actgcgtgac acatcagtat ttcaacattg 3362
ggtatcccga atcagccgat tttgattact cccagctgca ccgtttcttg cagttttcaa 3422
ttaacaactt gctggggact gggaatgagt acagcaacta cctgttgaac tcgttcgact 3482
ttgaaaaaga cgtcatgacg tatttcgccg agctgttcaa cattgccctt gaagacagtt 3542
ggggttacgt caccaatggc gggacggaag gcaatatgtt tggctgctac ctgggacgcg 3602
aactgtttcc ggacggcacc ctgtactact cgaaagacac ccactactcc gtggcaaaga 3662
tcgtcaaatt attgcggatc aaatgccgtg cggtcgaatc gctgcccaat ggcgaaatcg 3722
actacgacga cctgatggca aaaataaccg ccgaccagga gcgtcacccc atcatcttcg 3782
ccaacatcgg caccacgatg cgtggagccc tggataatat cgtgaccatc cagcaacgcc 3842
tgcaacaggc aggcattgcc cgccacgact actacctgca cgctgatgcg gccttgagcg 3902
ggatgatcct gcccttcgtc gatcacccac aacccttctc gtttgccgac ggcatcgact 3962
cgatctgcgt ctccggccac aagatgatcg gctcgcccat tccttgcgga attgtcgtgg 4022
ccaaacgcaa caacgtcgcg cgcatttcag tggaagtgga ctatatccgc gcccatgaca 4082
agaccatcag cggctcgcgc aacggccaca cacccctgat gatgtgggcg gcactgcgca 4142
gctactcatg ggctgaatgg cgccatcgaa tcaaacacag cctggacacg gcacagtacg 4202
ccgtcgaccg cttccaggcc tcgggcattg atgcctggcg caacgaaaac tccatcaccg 4262
tcgtgttccc ttgcccatca gaaagaattg cgacgaaata ctgcctggcc acctccggta 4322
attcggcaca cctgatcacc acacctcatc atcacgactg cagcatgatc gacgccttga 4382
tcgacgaagt ggttgccgaa gctcaactga atacccttcg atccaagcga gcattcactg 4442
aacaaacggt cgtcgagcga ttgcccgcgg cgtcattcaa cttgcgtacc cattattgaa 4502
agagaccagc ctc atg ctg ccg cta aaa ccg cca caa gcc tgc gag aac 4551
Met Leu Pro Leu Lys Pro Pro Gln Ala Cys Glu Asn
395 400
ctc aat gac att cga gcg ggc atc gac ttt ttt gac cgc cag atc ctt 4599
eu Asn Asp Ile Arg Ala Gly Ile Asp Phe Phe Asp Arg Gln Ile Leu
405 410 415 420
gac tcg cta caa aaa cgc ctg cgt tac gta aag gct gcg gcg cag ttc 4647
Asp Ser Leu Gln Lys Arg Leu Arg Tyr Val Lys Ala Ala Ala Gln Phe
425 430 435
aaa gcc aac gag cag gac att cca gca cct gaa cgc gtc gcg gcc atg 4695
Lys Ala Asn Glu Gln Asp Ile Pro Ala Pro Glu Arg Val Ala Ala Met
440 445 450
ctt gag gag cgg cga cta tgg gcg gta gaa gcc gaa ctt gat gtc gct 4743
Leu Glu Glu Arg Arg Leu Trp Ala Val Glu Ala Glu Leu Asp Val Ala
455 460 465
ttc gtc gag aag ctc tac gag cag att att cac tgg aat att caa cag 4791
Phe Val Glu Lys Leu Tyr Glu Gln Ile Ile His Trp Asn Ile Gln Gln
470 475 480
caa atc ctg cat tgg cgg gcc acc cga caa cca acg tac tcg gcg cag 4839
Gln Ile Leu His Trp Arg Ala Thr Arg Gln Pro Thr Tyr Ser Ala Gln
485 490 495 500
gcc aag tca tga cgatggcggg tggatgcctg acgacttgag gtctgcgatt 4891
Ala Lys Ser
cacgcgggct gtccttgttc gagtggtgtg tgttcacaac tatcaccgta gaccaagggc 4951
ggccttttct tcattttttt gtaatcagat cagcctgtta gctgttaatt aagtgccatt 5011
caaatctgtc cccttttttt ttcgccataa tgctgatatc gaattc 5057
<210>16
<211>332
<212>PRT
<213>荧光假单胞菌
<400>16
Gln Ala Leu Asp Arg Ala Arg Glu Ala Gly Gln Ser Asn Pro Ile Ile
1 5 10 15
Val Gly Ala Ile Pro Phe Asp Pro Ala Glu Pro Ser Cys Leu Tyr Ile
20 25 30
Pro Glu His Ala Gln Trp Arg Thr Arg Asp Ile His Ala Lys Thr Gly
35 40 45
Met Ser Thr Leu Pro Glu Leu Ile Glu Gln Lys Asn Ile Pro Asp Glu
50 55 60
Gln Ala Phe Lys Arg Ala Val Glu His Ala Val Val Asn Phe Arg His
65 70 75 80
Ser Asp Val Arg Lys Ala Val Leu Ser Val Gln Arg Glu Leu Ile Phe
85 90 95
Ala Asn Asp Val Asp Val Ser Ala Leu Gln His Asn Leu Lys Ala Gln
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Tyr His Phe Arg Val Pro Met Pro Asp Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Ile Gly Val Ser Pro Glu Leu Leu Val Arg Lys Glu Gly Leu Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Asn Pro Leu Ala Gly Ser Ala Lys Arg Met Ala Asp Pro
145 150 155 160
Glu Ala Asp Arg Arg Asn Ala Asp Trp Leu Leu Thr Ser Glu Lys Asp
165 170 175
His Tyr Glu His Gly Phe Val Thr Gln Asp Ile Val Ser Gln Leu Gly
180 185 190
Lys Leu Cys Thr Gln Leu Asn Val Pro Gln Arg Pro Ser Leu Ile Ser
195 200 205
Thr Pro Ala Leu Trp His Leu Ser Thr Arg Ile Glu Gly Thr Leu Ala
210 215 220
Asp Pro Ala Val Ser Ala Leu Gln Leu Ala Cys Arg Leu His Pro Thr
225 230 235 240
Pro Ala Val Cys Gly Phe Pro Thr Glu Arg Ala Arg Arg Leu Ile Arg
245 250 255
Phe Val Glu Pro Phe Glu Arg Gly Leu Phe Thr Gly Met Val Gly Trp
260 265 270
Cys Asp Ala Gln Gly Asn Gly Glu Trp Val Val Thr Ile Arg Cys Gly
275 280 285
Thr Val Arg Arg Asn Lys Val Arg Leu Phe Ala Gly Ala Gly Ile Val
290 295 300
Glu Ala Ser Ser Pro Asp Ser Glu Trp Ala Glu Val Gln Thr Lys Leu
305 310 315 320
Gly Thr Ile Val Arg Ala Cys Gly Leu Ala His
325 330
<210>17
<211>52
<212>PRT
<213>荧光假单胞菌
<400>17
Leu Glu Glu Arg Arg Leu Trp Ala Val Glu Ala Glu Leu Asp Val Ala
1 5 10 15
Phe Val Glu Lys Leu Tyr Glu Gln Ile Ile His Trp Asn Ile Gln Gln
20 25 30
Gln Ile Leu His Trp Arg Ala Thr Arg Gln Pro Thr Tyr Ser Ala Gln
35 40 45
Ala Lys Ser
50
<210>18
<211>2078
<212>DNA
<213>长春花
<220>
<221>CDS
<222>(31)..(1773)
<223>/功能=“异分支酸合酶”ICS
<400>18
ttctctctct ctctctctct ctcccatcca atg gca tct atc aca ggg cat tgt 54
Met Ala Ser Ile Thr Gly His Cys
1 5
gtt gct cat ttc aca gac ctt tca acc agg aaa tct tct ttt ttc tct 102
Val Ala His Phe Thr Asp Leu Ser Thr Arg Lys Ser Ser Phe Phe Ser
10 15 20
aat tct aat aat aac tct tcc ctt ttt aga aga aag tct aca aat ata 150
Asn Ser Asn Asn Asn Ser Ser Leu Phe Arg Arg Lys Ser Thr Asn Ile
25 30 35 40
gtc acc aga aaa aaa tat ata ttt tgt tct aca tca ttg tcc atg aat 198
Val Thr Arg Lys Lys Tyr Ile Phe Cys Ser Thr Ser Leu Ser Met Asn
45 50 55
ggt tgc aat ggt gat cca aga gct ccg gtt gga act ata gaa acg agg 246
Gly Cys Asn Gly Asp Pro Arg Ala Pro Val Gly Thr Ile Glu Thr Arg
60 65 70
aca ctt ccg gcg gtt tcg acg ccg gca ttg gcc atg gaa cgt ctt agc 294
Thr Leu Pro Ala Val Ser Thr Pro Ala Leu Ala Met Glu Arg Leu Ser
75 80 85
tcc gcc gtg gct aac ttg aaa tca act cta cct tct gct caa tca ggg 342
Ser Ala Val Ala Asn Leu Lys Ser Thr Leu Pro Ser Ala Gln Ser Gly
90 95 100
atc atc cgt ctt gag gta cca att gaa gaa cat ata gaa gca cta gac 390
Ile Ile Arg Leu Glu Val Pro Ile Glu Glu His Ile Glu Ala Leu Asp
105 110 115 120
tgg ctt cat tcg caa gac caa aaa aac ctt ctt ccc cgt tgc tat ttc 438
Trp Leu His Ser Gln Asp Gln Lys Asn Leu Leu Pro Arg Cys Tyr Phe
125 130 135
tct ggt aga agt caa gtt acc ttc tct gat ttc aca tct aac gac ctt 486
Ser Gly Arg Ser Gln Val Thr Phe Ser Asp Phe Thr Ser Asn Asp Leu
140 145 150
aca aat aga aat ggg agt gcc gcc aat gga cat ctt caa cga att tct 534
Thr Asn Arg Asn Gly Ser Ala Ala Asn Gly His Leu Gln Arg Ile Ser
155 160 165
act tca tct gat gat aag aat ctg gtc agt gtt gct ggt gtc ggt tct 582
Thr Ser Ser Asp Asp Lys Asn Leu Val Ser Val Ala Gly Val Gly Ser
170 175 180
gca gtc ctc ttc cgg agc cca aat cca ttt tct ttt gat gat tgg ctc 630
Ala Val Leu Phe Arg Ser Pro Asn Pro Phe Ser Phe Asp Asp Trp Leu
185 190 195 200
tca att aag agg ttt ttg tcc aag aac tgc cca tta atc cgt gct tat 678
Ser Ile Lys Arg Phe Leu Ser Lys Asn Cys Pro Leu Ile Arg Ala Tyr
205 210 215
gga gca att cgc ttt gat gca agg cct cat ata gca cca gag tgg aag 726
Gly Ala Ile Arg Phe Asp Ala Arg Pro His Ile Ala Pro Glu Trp Lys
220 225 230
gct ttt ggc tca ttt tac ttc atg gtt cct cag gtt gag ttt gat gag 774
Ala Phe Gly Ser Phe Tyr Phe Met Val Pro Gln Val Glu Phe Asp Glu
235 240 245
cta cat gga agt tcc atg att gct gca aca gtt gca tgg gat aat gct 822
Leu His Gly Ser Ser Met Ile Ala Ala Thr Val Ala Trp Asp Asn Ala
250 255 260
ctc tct ttg aca tat caa caa gca ata gtt cga ctt caa aca aca atg 870
Leu Ser Leu Thr Tyr Gln Gln Ala Ile Val Arg Leu Gln Thr Thr Met
265 270 275 280
gag cag gtt tcc tct acc gtc tcc aaa cta aga caa gat gtc tct cat 918
Glu Gln Val Ser Ser Thr Val Ser Lys Leu Arg Gln Asp Val Ser His
285 290 295
act tct ttg gtg agc aag gct aat att cct gat aga aca tcc tgg gat 966
Thr Set Leu Val Set Lys Ala Asn Ile Pro Asp Arg Thr Ser Trp Asp
300 305 310
ctt act ctt aac cga gtt ttg gaa gaa ata ggc aac aaa tat tcg cca 1014
Leu Thr Leu Asn Arg Val Leu Glu Glu Ile Gly Asn Lys Tyr Ser Pro
315 320 325
ttg aca aag gtt gta ctt gca cgt cgt agt caa gtt atc aca aca tca 1062
Leu Thr Lys Val Val Leu Ala Arg Arg Ser Gln Val Ile Thr Thr Ser
330 335 340
gat att gat cct ttg gct tgg ctg agt agt ttc aag gct gat ggg aaa 1110
Asp Ile Asp Pro Leu Ala Trp Leu Ser Ser Phe Lys Ala Asp Gly Lys
345 350 355 360
gat gct tac caa ttt tgc ctt cag cct cat gaa gca cca gca ttc att 1158
Asp Ala Tyr Gln Phe Cys Leu Gln Pro His Glu Ala Pro Ala Phe Ile
365 370 375
gga aac act cca gag caa cta ttt ggc cgg gac cag cta acc gtt ttt 1206
Glv Asn Thr Pro Glu Gln Leu Phe Gly Arg Asp Gln Leu Thr Val Phe
380 385 390
agt gag gct ttg gct gca acc cga gcc agg ggt gaa tca gat tcg tta 1254
Ser Glu Ala Leu Ala Ala Thr Arg Ala Arg Gly Glu Ser Asp Ser Leu
395 400 405
gat ctt cag atg gca cat gat ctc ttt tcc agt ccc aag gat aac cac 1302
Asp Leu Gln Met Ala His Asp Leu Phe Ser Ser Pro Lys Asp Asn His
410 415 420
gag ttt gcc ata gta cga gag aac atc aga cag aaa cta gat gcc att 1350
Glu Phe Ala Ile Val Arg Glu Asn Ile Arg Gln Lys Leu Asp Ala Ile
425 430 435 440
tgt act agt gta gaa act gaa cca atg aag tca gta aga aag ctt aag 1398
Cys Thr Ser Val Glu Thr Glu Pro Met Lys Ser Val Arg Lys Leu Lys
445 450 455
aga att caa cat ctt tat gct cga ttt gca ggc aga tta cgc tct gaa 1446
Arg Ile Gln His Leu Tyr Ala Arg Phe Ala Gly Arg Leu Arg Ser Glu
460 465 470
gat gat gag ttc aag att ttg tct tcc ctt cat cct act cca gct gtt 1494
Asp Asp Glu Phe Lys Ile Leu Ser Ser Leu His Pro Thr Pro Ala Val
475 480 485
tgt ggg ttt cct atg gaa gat gca cgg aaa ttt att gcg gaa aat gaa 1542
Cys Gly Phe Pro Met Glu Asp Ala Arg Lys Phe Ile Ala Glu Asn Glu
490 495 500
atg ttt gac cga gga tta tac gct ggc cct gtt ggt ttc ttt gga gga 1590
Met Phe Asp Arg Gly Leu Tyr Ala Gly Pro Val Gly Phe Phe Gly Gly
505 510 515 520
gct cag agt gat ttt tct gtt gga ata aga tct gcc ttg att gga aag 1638
Ala Gln Ser Asp Phe Ser Val Gly Ile Arg Ser Ala Leu Ile Gly Lys
525 530 535
gat gcc ggt gca tta ata tat gcg ggg ctt ggg gtt gta gaa gga agt 1686
Asp Ala Gly Ala Leu Ile Tyr Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Gly Ser
540 545 550
gat cca gct cta gaa tgg cag gaa cta gag ctc aag gca tcg cag ttt 1734
Asp Pro Ala Leu Glu Trp Gln Glu Leu Glu Leu Lys Ala Ser Gln Phe
555 560 565
atg aag ttg atg aaa tta gag gca cct gct ttg aag tga aaattaggac 1783
Met Lys Leu Met Lys Leu Glu Ala Pro Ala Leu Lys
570 575 580
tgaaaaatca ataaaaagat tgcgatagaa atttcagata attcgttagc cagaagatct 1843
tgttgagccg ttattaaatg tgtcctctac agtttaactg ataaccagat gaagaaaacc 1903
tatatctagt atatatatat ctaccatata taaatatatt gtacattttt gttttttctc 1963
ccacaaattt tatttgtatc tttttgaaca ttgtgccagc tggtttattg tattccatta 2023
tcttaattca ttattcaata agatgtgtca attcattcaa aaaaaaaaaa aaaaa 2078
<210>19
<211>581
<212>PRT
<213>长春花
<400>19
Met Ala Ser Ile Thr Gly His Cys Val Ala His Phe Thr Asp Leu Ser
1 5 10 15
Thr Arg Lys Ser Ser Phe Phe Ser Asn Ser Asn Asn Asn Ser Ser Leu
20 25 30
Phe Arg Arg Lys Ser Thr Asn Ile Val Thr Arg Lys Lys Tyr Ile Phe
35 40 45
Cys Ser Thr Ser Leu Ser Met Asn Gly Cys Asn Gly Asp Pro Arg Ala
50 55 60
Pro Val Gly Thr Ile Glu Thr Arg Thr Leu Pro Ala Val Ser Thr Pro
65 70 75 80
Ala Leu Ala Met Glu Arg Leu Ser Ser Ala Val Ala Asn Leu Lys Ser
85 90 95
Thr Leu Pro Ser Ala Gln Ser Gly Ile Ile Arg Leu Glu Val Pro Ile
100 105 110
Glu Glu His Ile Glu Ala Leu Asp Trp Leu His Ser Gln Asp Gln Lys
115 120 125
Asn Leu Leu Pro Arg Cys Tyr Phe Ser Gly Arg Ser Gln Val Thr Phe
130 135 140
Ser Asp Phe Thr Ser Asn Asp Leu Thr Asn Arg Asn Gly Ser Ala Ala
145 150 155 160
Asn Gly His Leu Gln Arg Ile Ser Thr Ser Ser Asp Asp Lys Asn Leu
165 170 175
Val Ser Val Ala Gly Val Gly Ser Ala Val Leu Phe Arg Ser Pro Asn
180 185 190
Pro Phe Ser Phe Asp Asp Trp Leu Ser Ile Lys Arg Phe Leu Ser Lys
195 200 205
Asn Cys Pro Leu Ile Arg Ala Tyr Gly Ala Ile Arg Phe Asp Ala Arg
210 215 220
Pro His Ile Ala Pro Glu Trp Lys Ala Phe Gly Ser Phe Tyr Phe Met
225 230 235 240
Val Pro Gln Val Glu Phe Asp Glu Leu His Gly Ser Ser Met Ile Ala
245 250 255
Ala Thr Val Ala Trp Asp Asn Ala Leu Ser Leu Thr Tyr Gln Gln Ala
260 265 270
Ile Val Arg Leu Gln Thr Thr Met Glu Gln Val Ser Ser Thr Val Ser
275 280 285
Lys Leu Arg Gln Asp Val Ser His Thr Ser Leu Val Ser Lys Ala Asn
290 295 300
Ile Pro Asp Arg Thr Ser Trp Asp Leu Thr Leu Asn Arg Val Leu Glu
305 310 315 320
Glu Ile Gly Asn Lys Tyr Ser Pro Leu Thr Lys Val Val Leu Ala Arg
325 330 335
Arg Ser Gln Val Ile Thr Thr Ser Asp Ile Asp Pro Leu Ala Trp Leu
340 345 350
Ser Ser Phe Lys Ala Asp Gly Lys Asp Ala Tyr Gln Phe Cys Leu Gln
355 360 365
Pro His Glu Ala Pro Ala Phe Ile Gly Asn Thr Pro Glu Gln Leu Phe
370 375 380
Gly Arg Asp Gln Leu Thr Val Phe Ser Glu Ala Leu Ala Ala Thr Arg
385 390 395 400
Ala Arg Gly Glu Ser Asp Ser Leu Asp Leu Gln Me Ala His Asp Leu
405 410 415
Phe Ser Ser Pro Lys Asp Asn His Glu Phe Ala Ile Val Arg Glu Asn
420 425 430
Ile Arg Gln Lys Leu Asp Ala Ile Cys Thr Ser Val Glu Thr Glu Pro
435 440 445
Met Lys Ser Val Arg Lys Leu Lys Arg Ile Gln His Leu Tyr Ala Arg
450 455 460
Phe Ala Gly Arg Leu Arg Ser Glu Asp Asp Glu Phe Lys Ile Leu Ser
465 470 475 480
Ser Leu His Pro Thr Pro Ala Val Cys Gly Phe Pro Met Glu Asp Ala
485 490 495
Arg Lys Phe Ile Ala Glu Asn Glu Met Phe Asp Arg Gly Leu Tyr Ala
500 505 510
Gly Pro Val Gly Phe Phe Gly Gly Ala Gln Ser Asp Phe Ser Val Gly
515 520 525
Ile Arg Ser Ala Leu Ile Gly Lys Asp Ala Gly Ala Leu Ile Tyr Ala
530 535 540
Gly Leu Gly Val Val Glu Gly Ser Asp Pro Ala Leu Glu Trp Gln Glu
545 550 555 560
Leu Glu Leu Lys Ala Ser Gln Phe Met Lys Leu Met Lys Leu Glu Ala
565 570 575
Pro Ala Leu Lys
580
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>20
tggtgatcca agagctccgg 20
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>21
cctggttgaa aggtctgtg 19
<210>22
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>22
gcaacacaat gccctgtg 18
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>23
gcaagcttca tgtaccttat cttggcc 27
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>24
tagatgccat gggatgggag 20
<210>25
<211>3279
<212>DNA
<213>长春花
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(3275)
<220>
<221>启动子
<222>(1118)..(3275)
<400>25
aagcttcatg taccttatct tggccttact gataattaaa ctaaaatatt caatttattt 60
atcacatgac catatttttc ctgttccata ttatggtgaa ttaaaaatat attaactgaa 120
aattattcag atcatacact aataaatggt tagatatgtg atttatttgt taatttaaat 180
taacttttaa aattaattaa ttaaaaattt attaaattaa gtatatttga taacttattc 240
agtcttatat ttaataatga tttttacaaa tcacttaatt atttaatata cataattata 300
aattttaagt gaaattattt tactaaactt atgtcaaatt aaaatacttt tttgcatata 360
attactactt tcgattataa atataaaggg ttttagcact atatatatta agggtcttga 420
aaataaaata attttttaac atagtatctt ttttatcctt tataagtgag aaaagaaaga 480
gatagtagaa gaaaaataaa tgaataaaaa ttatgggtaa atatgaaaag agttcaataa 540
atgctcattg tgagttgcaa aacgcttttt agtttttacc atcgttgatg tctaaaattc 600
cttatacttt tgactggaga tagtatcact tattaattaa tttagtattt aatttcagat 660
taagggtcag acttaagatc aaaattcata aatctaaaca attcaaattt gctactttag 720
tttcaatttt atcaaataga gctataattt aaataagttc atattctcat atataattta 780
ttcaacactc aattaaaaca atctagtaag taatcttttt taatgattat gatgtcctag 840
ggtgacaaat atatattaaa acgttacagt tcttattcag cgacatagaa gtcgattaac 900
aactaaaaca tcgacaatat acctaggcca ttcaatgggt tggtttaaca tatattccag 960
aactgattaa tttggacaat ttatatagtt taaataatca aaatattata taaaatttaa 1020
aattttatat gaaattatta aatctaaact aatttaggaa aatttacggt gcacaaaatt 1080
actgcagcat gcgattgaaa tacaacataa aatcactctc gagataaaag gagctattca 1140
tagtggtgat ttctaggagg attgaatgaa tgcattgaca gttcgatccg atatcgaatt 1200
caaaactttt tacttgataa aattggtgga ggtacttaat agaggagtgc tttactatta 1260
gactatacgt tcgttgctct acaaagcact attttgattg gtatttttag taaagtgtaa 1320
ttcttttaga agttcataaa aaaattaaaa ttttgattaa aaaataagtt gaactcaaaa 1380
gaatattgag taaatattga aaaaacaaca aaccaaggaa agttctcgtt tcttttcata 1440
tcttcaagag tgcttcgatg ttcaaacttc aaacacagac catccatatt tagaattata 1500
tttaaatcat ctaatgataa attttttttc cttttttggg aaacctaaaa tatatttttc 1560
gaagatcaaa taaaatagta gggactacat caaaactaat ttgtctaatc tgttccaaaa 1620
ttacatcacg cttacattag ataagttatt ggtcacatgt tcaatcaaat ttatatatac 1680
tataaacaaa aaagttttat tattcttgct tacataaaga actattctag attgttggaa 1740
cttttaaagt tataaaaaat acttttaaat aagttgtttt gcaaaaaaat aatataaaca 1800
atttcatttt taatcccaca aataaatagt tttaaaaaac acctttaaaa taaattttca 1860
ataaattttc tttaaagtta aaactaattt attttagagt caacaaataa attaagaagt 1920
aaacattttt tttgaataaa aatttgtttt aagacaacag gaaataaatt acactaatga 1980
gtaggaaata ggactcctgc aactcacggt aataataaac acaagtctaa tagttttaac 2040
tggatataat acaataaaca aatgtatcgt aactctcttt tagcacttct aaccctaact 2100
caacactatc agtaattagt atagaacaaa ctcagtttga acaactcgac cgtaaaaatc 2160
gaccatctaa aagaatctga acgaattaga ttttttgaag atagtttagg acagagatga 2220
acagttgaag aggggttcaa atttgctcaa ggttgaaaga gaccttctca aaagagaaga 2280
accaaactcc gatttaaaga aatcgaagag aaactatgcc aatagatttt agacctagta 2340
aaaaaaaact ctaaagagaa gaactaaaat gatttgtaaa caaaataaga cttggagaaa 2400
taaaagaaat agaagataga ttttcagatc aagataaaca ctctagtgta aatcaaggat 2460
ccattttggt cgaaaggacg gacagagaaa gaggagaggt ggtttggcac aagtaaggga 2520
ggaagaagag aagaaggata aaattcaacg aacatttaat tcatacataa tgaatattat 2580
ttatcaaaag aaaaataata gtaagaacaa agatgatgga ataagtgaga aagtaataat 2640
ttattaataa aaatatcttt tattatgtca gatatttcat ttatatcaca tcctctctct 2700
aataataatg aaacaaaaga atatcatgaa aatattaaga aaaagaaaaa aaatcatgaa 2760
atactctttc cagaagttga tgcattagat tagatggatg actattttat tcatatgaac 2820
ttgaattaat aaaagtaaac tttgacaaaa aaattatcaa agtttttgac aatactttcc 2880
attcacacgc tcattttctc cctttcttgc ctccttgttt gttgggtcaa aattgtaatc 2940
gcactacaca aaatggcctt aaggtaccat tcatttccaa gaaccaagca atcgtggaat 3000
tctatattag taccactttg actgacggat attataaaat ttccacgcat ttcataaaag 3060
tcctctggaa aataaataaa tatatataac tcctcctcct cctattttca ctattattat 3120
aaataaacct tcaaataata tattatatat aagaaaattc ctcttagtct gtgtacatgt 3180
ataaataaac ctagagactt ccccttcatg tttgcatcgc ttacaaagtt caccaatcag 3240
tctcattctc tctctctctc tctctctccc atcccatgg 3279