小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点及其分子标记 一、技术领域
本发明提供了小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点及其分子标记，属于分子遗传学领域，专用于小麦赤霉病抗病品种的选育与种质资源的利用。二、技术背景
小麦是我国的重要粮食作物。由赤霉菌引起的小麦赤霉病，不仅造成小麦严重减产，降低籽粒品质，而且该病菌产生的毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇还影响人、畜健康，给小麦生产造成了极大损失。在我国，有超过四分之一的小麦产区遭受赤霉病的危害，且每隔3~5年就有一次大流行，仅2002年赤霉病发生面积即达3000万亩次。因此，研究防治小麦赤霉病也就成了当前小麦育种上的一个迫切任务。培育抗病品种是防治小麦赤霉病危害的最安全、有效而且节约成本的措施之一。但传统育种方法费时费力，而且由于赤霉病表型鉴定非常困难，使小麦抗赤霉病育种进程异常缓慢。通过定位鉴定抗病主效基因位点来辅助育种可以有效解决这一问题。
遗传研究表明，小麦赤霉病主要受少数几个主效基因位点控制，不同的抗性材料其抗病主效基因位点在染色体上的位置不一致，而且分为抗侵染和抗扩展两种类型。但通过不同抗病主效基因位点的聚合或者引入新的抗源可以选育出抗性很好的品种。
目前在赤霉病抗性遗传基础的研究及抗病育种的利用上多集中在苏麦3号及其衍生系，而对其它抗源的利用研究很少。望水白是我国江苏特有的地方品种，具有高且稳定的赤霉病抗性。到目前为止尚未发现比它的抗性更强的小麦品种，而且它携有不同于苏麦3号的抗性基因(廖玉才1985)。三、发明内容技术问题本发明的目的是：提供小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点及其分子标记，定位这些抗侵染主效基因位点。通过检测与这些抗侵染主效基因位点连锁的分子标记，可以确定有无抗赤霉病侵染主效基因位点并预测小麦植株地赤霉病抗性，加快抗赤霉病小麦的选择进度。技术方案小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点，其特征在于：主效基因位点QFhs.nau-2d，由标记Xgwm539定位，
左端引物序列 CTGCTCTAAGATTCATGCAACC
右端引物序列 GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG
扩增片段157bp，该主效基因位点位于小麦望水白2D染色体，利用Data deskv.5.0软件测得与赤霉病抗性不相关的概率P值为0.005，对赤霉病抗性的贡献率11.4％；主效基因位点QFhs.nau-4a，由标记Xbarc184定位，
左端引物序列 TTCGGTGATATCTTTTCCCCTTGA
右端引物序列 CCGAGTTGACTGTGTGGGCTTGCTG
扩增片段210bp，该主效基因位点位于小麦望水白4A染色体，利用Datadesk v.5.0软件测得与赤霉病抗性不相关的概率P值为0.0042，对赤霉病抗性的贡献率11.7％；主效基因位点QFhs.nau-5a，由标记Xbarc056定位，
左端引物序列 GCGGGAATTTACGGGAAGTCAAGAA
右端引物序列 GCGAGTGGTTCAAATTTATGTCTGT
扩增片段120bp，该主效基因位点位于小麦望水白5A染色体，利用Data deskv.5.0软件测得与赤霉病抗性不相关的概率P值小于0.0001，对赤霉病抗性的贡献率22.3％；主效基因位点QFhs.nau-5b，由标记Xgwm408定位，
左端引物序列 TCGATTTATTTGGGCCACTG
右端引物序列 GTATAATTCGTTCACAGCACGC
扩增片段188bp，该主效基因位点位于小麦望水白5B染色体，利用Datadesk v.5.0软件测得与赤霉病抗性不相关的概率P值为0.0014，对赤霉病抗性的贡献率13.5％；主效基因位点QFhs.nau-7b2，由标记Xgwm537定位，
左端引物序列 ACATAATGCTTCCTGTGCACC
右端引物序列 GCCACTTTTGTGTCGTTCCT
扩增片段235bp，该主效基因位点位于小麦望水白7B染色体，利用Datadesk v.5.0软件测得与赤霉病抗性不相关的概率P值为0.0014，对赤霉病抗性的贡献率14.2％。
上述小麦望水白中位于2D、4A、5A、5B和7B上的抗赤霉病侵染主效基因位点QFhs.nau-2d、QFhs.nau-4a、QFhs.nau-5a、QFhs.nau-5b和QFhs.nau-7b2的分子标记分别为Xgwm539、Xbarc184、Xbarc056、Xgwm408和Xgwm537。上述小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点，是通过以下方法获得标记定位的：(1)小麦品种望水白(♀)与南大2419(♂)进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2，然后采用单粒传方法(SSD)获得F6代的重组自交系；(2)用SDS法提取重组自交系群体各株系的DNA，采用简单重复序列标记SSR对两亲本进行多态性筛选，PCR在PE9600扩增仪上进行，扩增产物在8％(g/ml)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在重组自交系群体中进行分析，PCR扩增程序同上，获取群体基因型资料；(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建小麦的遗传图谱，所用软件为Mapmaker 2.0，最小LOD值设为3，获得连锁图谱；(4)扬花期接种赤霉病病原菌，对重组自交系每个家系进行赤霉病抗性鉴定，获得重组自交系每个家系的病穗率；(5)利用Data desk v.5.0软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个家系的赤霉病抗性鉴定的病穗率进行连锁分析，单向方差分析测得与赤霉病抗性不相关的概率P值，P＜0.05的分子标记即与一个主效基因位点连锁，抗赤霉病侵染主效基因位点的位置由分子标记的染体位置确定：在望水白中发现P＝0.005的标记Xgwm539、P＝0.0042的标记Xbarc184、P≤0.0001的标记Xbarc056、P＝0.0014的标记Xgwm408及P＝0.0014的标记Xgwm537与抗侵染主效基因位点紧密连锁，即获得小麦望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-2d，QFhs.nau-4a，QFhs.nau-5a，QFhs.nau-5b，QFhs.nau-7b2的标记定位。或者对有主效基因位点的连锁群用Map Manager QTX软件进行区间作图分析，曲线峰值位置即为一个主效基因位点，由标记Xbarc056定位可获得望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-5a。有益效果本发明所提供的小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点及其分子标记，具有以下优点：(1)本发明在国际上首次获得定位了小麦品种望水白中的5个抗赤霉病侵染的主效基因位点，它们共同可解释79.8％的赤霉病抗性。小麦基因组巨大，是水稻基因组大小的40倍，对小麦抗赤霉病主效基因位点的精确定位工作居于同领域前列；(2)主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与这些抗侵染主效基因位点连锁的分子标记，可以确定有无抗赤霉病侵染主效基因位点并预测小麦植株的赤霉病抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于小麦育种。主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响；(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗病基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对赤霉病抗性进行单株选择。对小麦赤霉病进行表型鉴定要等到扬花期，受到较大的环境影响，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗赤霉病主效基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗赤霉病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗赤霉病小麦的选择效率。四、附图说明图1为望水白染色体连锁图及主效基因位点区间分布图左边为染色体遗传连锁图，标记间的图距已用数据标出；右边的曲线图为主效基因位点的区间图，两条直线分别为存在主效基因位点的期望值与显著值，超出第二条直线即表明存在一个主效基因位点。五、具体实施方式
研究表明，小麦赤霉病抗性主要受少数主效基因位点控制。美国Anderson实验室发现四个主效基因位点与苏麦3号/Stoa群体的赤霉病抗性呈显著相关，分别位于2AL、3BS、4BS和6BS上(Anderson，1998；Waldron，1999；Anderson，2000，2001)。美国Bai等人获得与RAPD标记相关的两个赤霉病抗性位点，2002年Zhou综合运用SSR、AFLP和非整倍体技术将该主效基因位点定位在缺失系3BS-8未端上一个长度约为8cM的染色体区域。日本Ban推测苏麦3的抗性主效基因位点可能位于5AL上。奥地利的Buerstmayr(2000，2001)发现有三个基因组区域与赤霉病抗扩展性显著相关，并定位于3BS、5A、1B上。本发明发现，在望水白的2D、4A、5A、5B及7B染色体上分别存在5个抗侵染主效基因位点。这些主效基因位点可用来指导抗赤霉病品种的选育工作，用与之连锁的分子标记可对抗病品种进行筛选，使不同抗病主效基因位点快速聚合在同一个植株中，从而大大提高育种效率。材料与方法：(一)望水白重组自交系的构建与表型鉴定：(1)对我国江苏地方品种望水白(♀)与意大利小麦品种Mentana的选系南大2419(♂)进行杂交获得F1，F1自交产生F2，136个F2单株任选一粒种子种植，采用单粒传的方法繁殖到F6代，获得重组自交系，包括136个家系；(2)重组自交系种植在江苏省农科院，让其自然发病，开花后20天鉴定其病穗率。病穗率＝病穗数/总穗数×100％(二)重组自交系群体的分子标记分析(1)用SDS法提取重组自交系群体各株系DNA。(2)首先用976对SSR引物对望水白和南大2419亲本的DNA多态性进行初步分析。PCR反应体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl2 1.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5单位/微升)0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。SSR反应体系为DNA 94℃预变性3min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸展2min，循环35次，最后72℃延伸10min。在PE 9600扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果，亲本间有多态的引物在重组自交系群体中进行分析，获取群体基因型资料；(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建小麦的遗传图谱，所用软件为Mapmaker 2.0，最小LOD值设为3，获得连锁图谱；(4)利用Data desk v.5.0软件和Map Manager QTX软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个家系的赤霉病抗性鉴定的病穗率进行连锁分析，定位基因。(三)结果与分析：
分子标记筛选结果表明，有383对SSR引物在双亲间有差异。利用Data deskv.5.0软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个家系的赤霉病抗性鉴定的病穗率进行连锁分析，单向方差分析测得与赤霉病抗性不相关的概率P值和位点对赤霉病抗性的贡献率R2(表2)，P＜0.05的分子标记即与一个主效基因位点连锁。所得分子标记在群体中的基因型按亲本望水白和南大2419的基因型分类，如果基因型与望水白相同的株系表型为抗，则该标记定位的抗病基因来自望水白：在望水白中发现P＝0.005的标记Xgwm539、P＝0.0042的标记Xbarc184、P≤0.0001的标记Xbarc056、P＝0.0014的标记Xgwm408及P＝0.0014的标记Xgwm537与抗侵染主效基因位点紧密连锁，由标记Xgwm539定位望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-2d，该主效基因位点位于2D染色体，R2＝11.4％，由标记Xbarc184定位望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-4a，该主效基因位点位于4A染色体，R2＝11.7％，由标记Xbarc056定位望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-5a，该主效基因位点位于5A染色体，R2＝22.3％，由标记Xgwm408定位望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-5b，该主效基因位点位于5B染色体，R2＝13.5％，由标记Xgwm537定位望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-7b2，该主效基因位点位于7B染色体，R2＝14.2％。或者对有主效基因位点的连锁群用MapManager QTX软件进行区间作图分析，曲线峰值位置即为一个主效基因位点。同样表明由标记Xbarc056定位望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-5a。
通过鉴定上述主效基因位点来预测小麦植株抗性，预计可迅速提高我国小麦抗病品种的育种进程。
表1.标记引物的序列及扩增片段大小
片段大
标记 左端引物序列 右端引物序列
小(bp)
Xgwm539 CTGCTCTAAGATTCATGCAACC GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG 157
Xbarc184TTCGGTGATATCTTTTCCCCTTGA CCGAGTTGACTGTGTGGGCTTGCTG 210
Xbarc056GCGGGAATTTACGGGAAGTCAAGAA GCGAGTGGTTCAAATTTATGTCTGT 120
Xgwm408 TCGATTTATTTGGGCCACTG GTATAATTCGTTCACAGCACGC 188
Xgwm537 ACATAATGCTTCCTGTGCACC GCCACTTTTGTGTCGTTCCT 235
表2.望水白抗侵染主效基因位点的单向方差分析
病穗率
主效基因位点 标记
P R2(％)
QFhs.nau-2d Xgwm539 0.005 11.4
QFhs.nau-4a Xbarc184 0.0042 11.7
QFhs.nau-5a Xbarc056 ≤0.0001 22.3
QFhs.nau-5b Xgwm408 0.0014 13.5
QFhs.nau-7b2 Xgwm537 0.0014 14.2P：表示与赤霉病抗性不相关的概率，P＜0.05表明该标记与赤霉病抗性紧密连锁R2：位点对赤霉病抗性的贡献率，值越大表明与赤霉病抗性越相关