一种药用络合物二黄芩苷锌及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种药物化合物，更具体地说，本发明涉及一种黄芩苷与锌的络合物，本发明还涉及所述络合物的制备方法及应用。背景技术
黄芩苷是中药黄芩的主要有效成分，具有较好的抑菌、抗炎、抗变态反应的药理活性。锌离子具有收敛作用，广泛存在于各种矿物药之中。同时，锌是人体中重要的微量元素之一。黄芩苷与锌的络合物具有较强的抗菌、消炎和镇痛作用(参见“时珍国医国药，1999，10(2)：152”)。同时黄芩苷锌络合物有较好的稳定性。
不同的反应条件获得的黄芩苷与锌的络合物在结构上可能存在差别。冯今明等人用黄芩苷加入索氏提取器中，将醋酸锌的甲醇溶液回流，蒸发的甲醇逐步将黄芩苷溶解使之与醋酸锌反应，用电导-配基/金属曲线测得所制备的黄芩苷与锌的络合物中黄芩苷与锌的比例为1比1；但没有确定配基中参与形成配位键的功能基团(参见“中草药1998，19(11)：9”)。中国专利申请(公开号：CN 1244533A)用黄芩苷的碱性水溶液与饱和醋酸锌水溶液反应制备了黄芩苷的6′位羧基与锌离子配位的络合物，锌离子与黄芩苷的摩尔比为1比1。房喻等人制备了黄芩苷与锌的摩尔比为2比1的络合物，但没有确定所制备的络合物地具体结构(参见“陕西师大学报(自然科学版)，1990，18(2)：40”)。上述制备工艺中存在两个较大的难题，其一，须将黄芩苷溶解。黄芩苷在中性、酸性条件下溶解性小，在碱性条件下易溶于水或一定比例的醇水溶液，但不稳定，不利于保证工业生产产品的质量稳定性。其二，上述工艺制备的黄芩苷锌，在清洗过量的锌离子时难于过滤，降低了工业生产的效率。发明内容
本发明的目的是针对黄芩苷在中性、酸性条件下溶解性小，在碱性条件下不稳定的特点；筛选一种制备工艺简便、结构清楚、活性稳定、质量稳定可控的二黄芩苷锌络合物及其制备方法。
本发明提供的一种药用络合物二黄芩苷锌，其化学结构式如(I)所示：
本发明所述的二黄芩苷锌可按如下步骤制备：
(1)将黄芩苷与水、有机溶剂或水与有机溶剂的混合液混合制备成黄芩苷悬浊液；
(2)将锌盐溶于水、甲醇、乙醇、丙酮，或上述溶剂的混合溶液中制备成锌盐溶液；
(3)在搅拌的条件下将锌溶液加入到黄芩苷悬浊液中；
(4)将反应混合物静置、过滤，获得沉淀物；
(5)反复用水与所述有机溶剂混合溶液洗涤沉淀物，干燥即获得二黄芩苷锌。
本发明的方法中，其步骤(1)中所述的有机溶剂采用甲醇、乙醇或丙酮。
本发明的方法中，其步骤(1)中所述的水与有机溶剂的混合溶液采用30～90％乙醇水溶液。
本发明的方法中，所述的锌盐采用醋酸锌、硫酸锌、硝酸锌或卤化锌的任一种。
本发明还提供了一种络合物二黄芩苷锌在制备抗菌、消炎、抗溃疡方面的药物中的应用。
本发明提供的制备二黄芩苷锌的生产工艺，在生产过程中无需控制pH值，制备工艺简便，保证了原材料在生产过程中的稳定性，为生产质量稳定的药品奠定了基础，提高了生产效率。产物的结构清楚、活性稳定、质量稳定可控。所制备的二黄芩苷锌聚集成疏松多孔块状，呈橙黄色至橙红色，经固体核磁共振碳谱、红外光谱、化学衍生物合成、液相质谱联用技术等方法鉴定其结构为二黄芩苷锌。药理实验表明，所述的二黄芩苷锌有较好的镇痛、抗菌、抗炎、抗溃疡活性。具体实施方式：
结构鉴定：
二黄芩苷锌络合物，橙黄色至橙红色无定型粉末，粉末X-衍射分析显示为非晶形态。不溶于水、甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，微溶于DMSO、吡啶、DMF、DMAC等溶剂并且分解。
1、络合位点的确定：
(1)、黄芩苷与黄芩苷锌络合物红外光谱的比较
黄芩苷(I)的红外光谱显示波数1735(羧酸羰基伸缩震动)和1644(黄酮羰基的伸缩震动)等强吸收的特征峰。所制备的黄芩苷与锌的络合物(II)上述吸收峰消失，产生的1623-1500的宽钝峰，与黄芩苷3位羰基和5位羟基与锌离子络合以后产生的吸收相关。6′位羧基的吸收消失有两种可能：其一，羧基与锌离子形成络合物，其二，羧基电离成负离子。此时羰基的吸收红移至1600产生一个强而宽的吸收带。所以在II的红外光谱中的1623-1500处的吸收带与4位羰基与锌离子络合后产生的吸收以及羧基负离子的吸收相关。黄芩苷的1608，1572(含孤电子对的取代基的苯环C＝C伸缩震动)与上述吸收峰发生重叠。
(2)、黄芩苷的3位羰基与5位羟基络合作用的研究
将黄芩苷与吡啶、正丁醇共回流，蒸除溶剂，得胶状物，用石油醚沉淀，得黄芩苷6′丁酯(III)，III与I的红外光谱比较，羧基变为酯羰基，碳氧双键伸缩振动的波数由1725紫移至1735；酮羰基，苯环双键等吸收峰的波数变化不大，验证了先前对I红外光谱的归属。将3与醋酸锌反应，得橙红色沉淀(IV)。IV的红外光谱与III相比，黄酮羰基的吸收消失，酯羰基的吸收保留。IV的红外光谱与I相比，波数1742处有强吸收尖峰，为酯羰基吸收峰；4位羰基吸收消失，在1633处产生羰基与锌离子络合的吸收峰。IV的红外光谱与II相比，波数1742处有强吸收尖峰，为酯羰基吸收峰，其余吸收相近。由此可知黄芩苷的6′位羰基在形成所述的二黄芩苷锌的反应中未参加反应。将VI溶于EDTA甲醇溶液进行LC/MS/MS分析，可检测到EDTA(质荷比291)、EDTAZn(质荷比373)和III的信号。也说明在IV的产生过程中酯羰基没有参与络合反应。
将黄芩苷与醋酐-吡啶溶液反应制备C5、C6位乙酰化，以5，6，2′，4′-四羟基-5′，3′-内酯-黄芩苷为主的衍生物(V)。将V按IV所述的方法制备锌络合物，得橙红色沉淀(VI)。VI红外光谱与I相比，黄酮羰基的红外吸收消失，内酯的吸收保留。将VI溶于EDTA的甲醇溶液，用LC/MS/MS进行分析，结果表明，黄酮母核上5位的酯键在形成络合物的同时解离。说明黄芩苷的4位羰基与5位羟基对金属锌离子有较强的络合能力。
2、黄芩苷与锌的络合物中金属离子与配基比例测定：
在EDTA的甲醇或水溶液中加入所述的黄芩苷与锌的复合物，则发生黄芩苷与EDTA竞争锌离子的反应。当EDTA与锌离子等当量时，所述的黄芩苷与锌的络合物完全溶解。如果此时再加入锌离子，则重新生成橙红色沉淀。说明EDTA竞争锌的能力强于黄芩苷。
(1)、黄芩苷、EDTA、醋酸锌标准溶液的配制
分别准确称量一水醋酸锌1.0005克，EDTA 1.1250克，黄芩苷50毫克，分别放入小烧杯，醋酸锌、EDTA加适量水溶解，黄芩苷用甲醇溶解，分别转移至100毫升容量瓶，醋酸锌和黄芩苷用甲醇、EDTA用水定容，配制成母液备用。
准确量取醋酸锌母液1.000毫升，至10毫升容量瓶中，用水定容，得醋酸锌溶液A；取EDTA母液1.000毫升，定容至10毫升，配制成EDTA溶液B。上述溶液备用。
(2)、黄芩苷于EDTA对锌离子的竞争能力的比较
分别取醋酸锌母液140微升，EDTA母液300微升，黄芩苷母液20微升，①按醋酸锌-EDTA-黄芩苷的顺序混合；②按按醋酸锌-黄芩苷-EDTA的顺序混合。分别测定①和②中黄芩苷、锌-EDTA和游离EDTA的LC/MS响应强度。结果表明，在两种不同混合顺序条件下，三种信号的响应基本一致。说明在EDTA过量的条件下，黄芩苷完全不与锌离子络合。
(3)、锌离子工作曲线测定
锌离子浓度分别为10，20，50，100，200，500微克/毫升；线性方程为Y＝50864.4+10405.3X，R＝0.99552，说明在此范围内线性良好。
(4)、黄芩苷工作曲线测定
黄芩苷的浓度为0.020，0.040，0.100，0.200，0.500毫克/毫升；线性方程为Y＝8.56254E6+3.16701E7，R＝0.98007，说明在此范围内线性良好
(5)、所述黄芩苷与锌的络合物所含锌离子与黄芩苷的测定
分别准确称量黄芩苷与锌的络合物1.001毫克和2.497毫克，加EDTA母液0.3毫升，水5毫升，超声处理使其完全溶解，再加甲醇定容至20毫升分别测得锌离子浓度分别为0.565和1.045uM/ml；黄芩苷的浓度分别为0.919和1.933uM/ml。所述的络合物中黄芩苷与锌离子的比例为2比1。
3、黄芩苷与二黄芩苷锌络合物NMR分析
黄芩苷13C-NMR归属：黄芩苷的13C-NMR共显示21个碳信号，其中，1个羧基信号，1个黄酮羰基信号，14个芳香碳原子信号(黄酮母核)，4个连氧饱和碳原子信号和1个糖端基碳原子信号(葡萄糖酸)。
黄芩苷锌络合物I的固体13C-NMR与黄芩苷的13C-NMR相比，羧基向高场位移2ppm，说明羧基离子化变为相应的负离子。黄酮4位酮羰基本来为分子内氢键，化学位移值为107.0ppm，形成络合物以后，向高场位移5ppm，说明该位置参与了络合。所述的络合物的13C-NMR谱中另外还可见207ppm和48ppm的一对信号，通过改变旋转频率，确定二者属于128ppm处碳信号的旋转边锋。22ppm处显示的信号为71ppm处碳信号的旋转边锋。所述的络合物13C-NMR与黄芩苷一致，无其它成分的信号。
综合上述分析：所述的黄芩苷与锌的络合物的组成中除了黄芩苷物其它有机成分；黄芩苷与锌离子的摩尔比为2比1；黄芩苷的4位羰基和5位羟基参与形成配位键，5′位羧基以离子的形式存在。所述的黄芩苷与锌的络合物命名为二黄芩苷锌。
药理实验1：二黄芩苷锌镇痛作用实验
所用材料：
药物：二黄芩苷锌，自制；阿司匹林片(同德堂)，市售；0.6％醋酸，自配。
动物：昆明小鼠
方法与结果：
药物用0.9％生理盐水悬浮，灌胃前摇匀。小鼠分四组，每组6只。1组为空白，2、3组为药物组，4组为阿司匹林阳性对照组。灌胃给药500微克/千克体重，空白组灌胃0.9的氯化钠水溶液，30分钟后腹腔注射0.6％醋酸溶液0.02毫升/只，观察20分钟内小鼠的扭体数。结果：空白组小鼠扭体次数为20±5；药物组分别为8±4，4±4；抑制率分别为60％和80％。阳性对照组为14±2，抑制率为30％。上述结果表明，二黄芩苷锌有较好的镇痛效果。
药理实验2：二黄芩苷锌抗炎作用实验
所用材料：
药物：二黄芩苷锌，自制；皮康霜软膏，市售；二甲苯，分析纯，北京化工厂。
动物：昆明小鼠
方法与结果：
小鼠分3组，每组6只。1组为空白，2组为药物组，3组为皮康霜阳性对照组。
第一组小鼠用棉签在左耳的内外两面涂抹二甲苯，作为阴性对照；先将5毫克二黄芩苷锌加入10毫升二甲苯中，第二组动物在左耳内外两面涂抹加有二黄芩苷锌的二甲苯；分别于1、2、3小时后在涂抹二甲苯处涂抹二黄芩苷锌粉末。第三组动物先用棉签在左耳的内外两面涂抹二甲苯，在半小时后在涂抹二甲苯处涂抹皮康霜。致炎4小时后将动物处死，用打孔法测定小鼠左右耳相应部位的重量。左右耳重量之差为肿胀度。结果：空白组肿胀度为18.6±0.8；药物组为11.6±2.1；阳性对照组为11.7±1.3。上述结果表明，二黄芩苷锌有较好的抗炎作用。
实施例1
黄芩苷(纯度95％)市售；分析纯七水硫酸锌为北京双燕化工厂生产；分析纯甲醇为北京化工厂生产。
黄芩苷5.00克加入250毫升圆底烧瓶，加水100毫升，放置于磁力搅拌器上，固定。硫酸锌5.91克，用150毫升甲醇溶解，装入250毫升分液漏斗备用，分液漏斗架于圆底烧瓶上方。调节搅拌速度，使固体充分分散，继续搅拌20分钟。逐滴加入锌溶液，此时溶液中立即有橙红色沉淀生成。继续滴加锌溶液至完全加入。停止搅拌，放置1小时。顷出上清液，将剩余物用玻璃棒搅拌使其悬浮，顷入放有滤纸的三角漏斗，常压过滤。待液体滤完，加入约30毫升60％甲醇水溶液，并用玻璃棒搅拌使固体悬浮，静置。重复上述过程3次，放置、自然干燥，获得橙黄色固体5.04克。经鉴定为二黄芩苷锌。
实施例2
黄芩苷(纯度95％)为市售，分析纯一水醋酸锌为北京双燕化工厂生产；食用酒精(95％)，北京化工厂。
黄芩苷(纯度95％)4.46克加入250毫升圆底烧瓶，加水30％乙醇溶液100毫升，放置于磁力搅拌器上，固定。醋酸锌1.11克，用100毫升30％乙醇溶液溶解，装入250毫升分液漏斗备用，分液漏斗架于圆底烧瓶上方。调节搅拌速度，使固体充分分散，继续搅拌20分钟。逐滴加入醋酸锌溶液，此时溶液中立即有橙红色沉淀生成。继续滴加醋酸锌至完全加入。停止搅拌，放置1小时。顷出上清液，将剩余物用玻璃棒搅拌使其悬浮，顷入放有滤纸的三角漏斗，常压过滤。待液体滤完，加入约30毫升60％乙醇水溶液，并用玻璃棒搅拌使固体悬浮，静置。重复上述过程3次，放置、自然干燥，获得橙黄色固体4.07克。经鉴定为二黄芩苷锌。
实施例3
试剂与材料：
黄芩苷(纯度95％)，市售；氯化锌，丙酮为分析纯，北京化工厂生产；食用酒精(95％)
黄芩苷(纯度95％)5.12克加入250毫升圆底烧瓶，加60％乙醇溶液100毫升，放置于磁力搅拌器上，固定。氯化锌3.01克，用150毫升30％丙酮水溶液溶解，装入250毫升分液漏斗备用，分液漏斗架于圆底烧瓶上方。调节搅拌速度，使固体充分分散，继续搅拌20分钟。逐滴加入醋酸锌溶液，此时溶液中立即有橙红色沉淀生成。继续滴加氯化锌至完全加入。停止搅拌，放置1小时。顷出上清液，将剩余物用玻璃棒搅拌使其悬浮，顷入放有滤纸的三角漏斗，常压过滤。待液体滤完，加入约30毫升60％乙醇，并用玻璃棒搅拌使固体悬浮，静置。重复上述过程3次，放置、自然干燥，获得橙黄色固体4.92克。经鉴定为二黄芩苷锌。
实施例4
试剂与材料：
黄芩苷(纯度95％)，市售，氯化锌，丙酮为分析纯，北京化工厂生产。
黄芩苷(纯度95％)5.03克加入250毫升圆底烧瓶，加60％丙酮水溶液100毫升，放置于磁力搅拌器上，固定。氯化锌2.10克，用150毫升30％丙酮水溶液溶解，装入250毫升分液漏斗备用，分液漏斗架于圆底烧瓶上方。调节搅拌速度，使固体充分分散，继续搅拌20分钟。逐滴加入醋酸锌溶液，此时溶液中立即有橙红色沉淀生成。继续滴加氯化锌至完全加入。停止搅拌，放置1小时。顷出上清液，将剩余物用玻璃棒搅拌使其悬浮，顷入放有滤纸的三角漏斗，常压过滤。待液体滤完，加入约30毫升60％丙酮水溶液，并用玻璃棒搅拌使固体悬浮，静置。重复上述过程3次，放置、自然干燥，获得橙黄色固体4.72克。经鉴定为二黄芩苷锌。
实施例5
黄芩苷(纯度95％)为市售，分析纯硝酸锌为北京双燕化工厂生产；食用酒精(95％)，北京化工厂。
黄芩苷(纯度95％)4.46克加入250毫升圆底烧瓶，加水90％乙醇溶液100毫升，放置于磁力搅拌器上，固定。硝酸锌3.30克，用100毫升30％乙醇溶液溶解，装入250毫升分液漏斗备用，分液漏斗架于圆底烧瓶上方。调节搅拌速度，使固体充分分散，继续搅拌20分钟。逐滴加入醋酸锌溶液，此时溶液中立即有橙红色沉淀生成。继续滴加硝酸锌至完全加入。停止搅拌，放置1小时。顷出上清液，将剩余物用玻璃棒搅拌使其悬浮，顷入放有滤纸的三角漏斗，常压过滤。待液体滤完，加入约30毫升60％乙醇水溶液，并用玻璃棒搅拌使固体悬浮，静置。重复上述过程3次，放置、自然干燥，获得橙黄色固体3.92克。经鉴定为二黄芩苷锌。