一种利用超声波促进杂交反应的方法及装置 【技术领域】
本发明涉及一种促进杂交反应的方法及其装置，特别涉及快速及高特异性核酸或核酸结合蛋白检测的方法及装置。此方法及装置可应用于临床诊断、生命科学基础研究、农业及环境监测等技术领域。背景技术
杂交反应是分子生物学中的一个基本过程，同时也是生物和医学等领域中检测特定核酸和蛋白分子的有效手段。目前常规的杂交反应处理方法是让参与反应的靶标分子和探针分子自由混合(液液体系)或直接接触(液固体系)。这种方法是利用分子在液体介质中的自由扩散来实现不同组分之间的接触，从而完成反应的。由于自由扩散是一个较慢的动力学过程，所以这种方法虽然简便，但是反应耗时长，特异性差，均匀性不好。因而人们一直在寻求能够实现快速、高特异性杂交反应地方法。虽然目前也有一些手段用来加速杂交反应，但是都有很大的局限性。比如美国Nanogene公司设计的微电子基因芯片利用正向静电力将溶液中的靶标分子吸引到探针分子的周围从而加速杂交反应，杂交反应结束后再通过改变电极极性加载反向静电力将未杂交的核酸分子去掉，从而提高杂交反应的特异性(参见“Feng L.，Nerenberg M.Electronic Microarray for DNA Analysis.Gen Ther. Mol.Biol.，1999，4：183-191”)。但是此技术存在加工过程复杂，费用昂贵的缺点。英国Amersham Biosciences公司生产的Lucidea全自动基因芯片杂交系统则通过机械部件抽吸杂交反应液体促进混合来加速杂交反应。但是由于此技术所需装置存在运动部件，使得装置相对庞大，不易实现微型化和集成化。发明内容
本发明的目的是提供一种利用超声波促进杂交反应的方法，以达到缩短杂交反应时间、提高检测灵敏度和杂交反应的特异性以及杂交信号的一致性；并同时提供一种结构简单，成本低廉，操作简便，耗时少，易于实现自动化，并可用于微型反应系统的杂交反应装置。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种利用超声波促进杂交反应的方法，该方法利用超声波发生器产生一定强度的超声，将准备好的固液杂交反应体系或液液杂交反应体系置于超声波传播途径中，通过放置在超声波谐振元件与杂交反应体系之间的耦合介质，使超声波传导至杂交反应体系中；利用超声波的高频振动及辐射压力在杂交反应体系的液体介质中形成有效的搅动与流动，通过液体的流动带动其中的反应分子的运动；并在进行杂交反应的过程中，可根据不同的杂交反应体系，调节超声辐射功率或频率，改变液体介质扰动强度，从而实现促进杂交反应的进行。
本发明还提供了一种实施上述方法的装置，该装置包括固液杂交反应体系或含有两种或多种不同组分的液相组成的液液杂交反应体系以及装有杂交反应体系的容器，其特征在于：在反应体系的上方、底部或四周至少放置一个超声波谐振元件，在超声波谐振元件与杂交反应体系之间填充可使声波传导的耦合介质，所述超声波谐振元件与谐振电路相连。
对于不同的杂交反应体系(比如长短不同、碱基组成不同的核酸杂交反应体系)，由于存在反应动力学差异，可以通过调节超声辐射功率，改变液体扰动强度，使之达到最佳的反应效果。同理，利用靶标分子与不同探针分子杂交反应时的反应动力学差异，也可以在反应过程中通过调节超声辐射功率来提高杂交反应的特异性。比如对于基因芯片上的核酸杂交反应，由于对同一长度的核酸序列，有一定错配情况时的靶标分子与探针分子的结合力要小于完全配对情况。如果超声辐射强度增加的结果使得液体对杂交液中核酸分子的作用力大于有一定错配情况时的靶标分子与探针分子的结合力，但又小于完全配对情况时靶标分子与探针分子的结合力，那么超声辐射的结果可以保留完全配对而排斥错配，从而提高基因芯片杂交的特异性。
本发明与传统杂交技术相比，具有以下优点及有益效果：可以显著提高杂交信号的强度(实施例显示经超声作用辅助的杂交结果信号强度比常规技术杂交结果信号强度提高4到5倍)，使杂交反应更快地达到完全反应状态，缩短反应时间；可以使固体基质表面不同位置的杂交反应更趋一致，提高杂交信号的均匀性；可以降低假阳性信号强度，提高杂交反应的特异性。另外，本发明提供的装置结构简单，成本低廉，核心元件仅有超声谐振元件和相应谐振电路以及有效的耦合介质，操作简便，易于实现自动化。附图说明
图1为本发明提出的实施例装置结构示意图。
图2为本发明提出的实施例中将基因芯片放置在谐振元件上进行杂交反应时的结构示意图。
图3为本发明提出的实施例中采用压电陶瓷片作为超声谐振元件的正面视图。
图4为本发明提出的实施例中采用压电陶瓷片作为超声谐振元件的背面视图。
图5为基因芯片采用常规技术杂交结果扫描荧光信号伪彩色图。
图6为基因芯片采用本发明所进行的杂交结果扫描荧光信号伪彩色图。
图7为本发明提出的实施例杂交结果扫描与常规杂交结果扫描的荧光信号强度值对比分析图。具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明的具体实施：本发明利用超声波促进杂交反应的装置包括两部分：一部分即所谓超声波发生器，另一部分即杂交反应体系。实际应用时，杂交反应体系可以是液液反应体系，也可以是液固反应体系，即一种组分被固定于固体基质表面或内部，另一种组分在液相中。超声波谐振元件的材料可不限于陶瓷材料，可采用石英等材料；超声波谐振元件的形状可以是圆柱形、锥形、圆筒形、立方形等任何有利于产生超声波谐振的元件的形状；超声波谐振元件的体积可以在10立方微米到1000立方厘米之间变化；超声波谐振元件所产生的超声波频率可以在20kHz到100MHz之间变化；超声波发生器的功率可以在0.1W到200W之间变化。由于不同的杂交反应体系存在反应动力学差异， 因此在进行具体操作时，应根据杂交反应体系的不同，调节超声辐射功率或频率，改变液体介质扰动强度，从而实现促进杂交反应的进行。在超声波谐振元件与杂交反应体系之间填充的耦合介质可以采用任何可使声波传导的液体或固体介质，液体介质可以是水、甘油、植物油等；固体介质可以是塑料、硅橡胶、固化的环氧树脂等。
图1为本发明的一个具体实施例，该实施例利用超声波促进基因芯片的杂交反应。
(1)将一直径为2.5厘米、频率为1.7MHz的圆形压电陶瓷片2贴附于一尺寸为8.5cm×5cm×2cm的塑料盒1中，压电陶瓷片2通过塑料盒1侧壁所钻小孔引出导线3与超声波谐振电路5相接。超声波谐振电路5的输出功率为10W。然后将导线引出孔用环氧树脂胶密封。压电陶瓷片2边缘套有环形橡皮密封圈4，其作用是为了形成凹槽盛装耦合介质，以使压电陶瓷片2与置于其上的基因芯片6之间保持良好接触，保证超声在不同介质之间界面处有较高的透射率。7指示基因芯片上固定有核酸探针点阵的区域。
(2)将混合好的杂交液放到加热器上，98℃下加热4分钟使双链结构解链，在4℃下冷却8分钟使单链结构得到保持，52℃下预杂交15分钟，4℃下冷却5分钟以上，然后取出立即放入冰盒。
(3)在压电陶瓷片2上面环形橡皮密封圈4形成的圆形凹槽内充满水或甘油，以利于超声波的传导，然后将进行杂交反应的基因芯片6(以载玻片为载体)置于其上(固定有探针的一面背对压电陶瓷片，并使芯片6上的杂交点阵区域7正好位于压电陶瓷片2的正上方)。
(4)用移液枪在芯片6的每个方阵上滴加8μl杂交液，并迅速将装有待杂交基因芯片的塑料盒1上盖并以封口膜密封，以防止水份的挥发丧失。然后将塑料盒置于已调节恒温为30℃的杂交炉中，同时打开超声波发生器电源。此超声波发生器周期性地开通和关闭，每一循环的开通和关闭时间分别为2秒和10秒。在不同的杂交反应中，超声波发生器可以采用连续发生的方式或间断发生方式。
(5)杂交反应进行2小时后，取出杂交盒，快速取出芯片，放到装有清洗液(0.2％SDS)的盒内，然后置于摇床上振荡清洗15分钟(室温)，以去离子水冲洗干净，离心2分钟(1500转/分钟)甩干。
利用Scanarray 4000扫描仪扫描杂交芯片，检测杂交结果。仪器为一基于激光诱导荧光检测的光学检测仪，利用该仪器可获得本实例中基因芯片上每个点的荧光强度信号，进而获得对应的杂交样品浓度信息。扫描仪的参数激光光源功率设为仪器最大值的80％，检测器光电倍增管(PMT)的灵敏度设为仪器最大值的65％，扫描精度设为5微米。
图3和图4为实施例中的超声波谐振元件所采用的压电陶瓷片的电极排布图。图3为压电陶瓷片正面视图，图4为压电陶瓷片背面视图：8指示超声压电陶瓷片表面所镀金属电极，9指示超声压电陶瓷片背面裸露的压电材料。
图5和图6为杂交荧光信号伪彩色图。此二图比较了常规杂交结果扫描图与超声辅助杂交结果扫描图，显示了超声作用对基因芯片杂交反应的促进效果。
本实例中涉及的杂交体系如下：在芯片(醛基修饰的玻片)上先固定一系列捕获子(capturer)探针，它们为末端氨基修饰的寡核苷酸，靶分子为比探针长一些的核苷酸，其中一段与探针互补，它的另一段与反应体系中加入的带有荧光标记的报告分子互补。杂交液中分别含有靶分子与报告分子，为提高芯片上的捕获子探针与靶分子的杂交效率，先在52℃下使靶分子与报告分子预杂交，然后再与芯片上的探针杂交。由此靶分子的量可以通过报告分子所带的荧光标记分子的荧光强度值间接测得。
从图中可以看出，在施加超声的情况下，杂交荧光信号可以得到明显增强。
生物材料：
(1)固定到芯片表面的捕获子(capturer)探针：
固定到点阵行1上的探针为5’-NH2-T12-TCACAGACTGACCGAGG；
固定到点阵行2上的探针为5’-NH2-T12-TCACAGACTGACCGAGT；
固定到点阵行3上的探针为5’-NH2-T12-TCACAGACTGACCGAGA；
(2)与靶分子杂交的报告分子(reporter)：
5’-GAACC TGGGG ACCCT GCGCG GCTAC TACTA CTAGTG-3’
(3)靶分子：
HLA A区2601型荧光不对称PCR产物，长度为1kb。
试剂：
(1)杂交液组成：
3.6μl靶(target)DNA
1.0μl报告分子(reporter)(40ng/ul)
2.7μl 20×SSC
0.8μl 1％SDS
(2)洗涤液组成：
2×SSC
0.1％SDS
图7为本发明提出的实施例杂交结果扫描与常规杂交结果扫描的荧光信号强度值对比分析图。从图7可以看出，在其他条件相同的情况下，施加超声会使杂交反应的荧光信号强度增加4-5倍，从而增加检测的灵敏度。说明超声对杂交反应是有确定的促进作用的。本实验已重复4-5次，均得到相同的实验结果。