一种对玉米进行基因转化的方法 【技术领域】
本发明涉及生物工程领域中对植物进行基因转化的方法，特别是涉及对玉米进行基因转化的方法。背景技术
植物基因工程是在分子水平上定向重组遗传物质，改良植物性状，培育优质高产作物新品种的分子育种技术。70年代末，首次从分子水平上证实了土壤农杆菌(Agrobacterium tumefacieus)在侵染植物细胞以后，不但能将它的一段DNA插入到被侵染细胞的基因组中，并能够遗传给后代。之后，植物基因工程研究连续取得了一系列重大突破。从获得第一株转基因植株到现在不到二十年的时间内，转基因植物已扩展到包括经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、水果、树木以及牧草等在内的35个属，120多个物种。一些经基因工程改良的作物如番茄、油菜、烟草、西葫芦、亚麻、玉米、大豆和棉花，都已经实现了商品化。植物基因工程中的几个重要环节：目的基因的分离与鉴定、基因的修饰及表达载体的构建、目的基因向植物细胞的转化、转化细胞地筛选和鉴定等都取得了很大的进展，形成了成熟的实验流程，且新方法、新技术不断涌现。
在植物受体的研究方面，实验证实可作为受体的外植体有：叶片、叶柄、子叶、子叶柄、下胚轴、茎、茎尖分生组织、块茎、芽、根、花粉、合子胚、子房、胚珠、体细胞、胚性愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、成熟种子等。作为转化受体的细胞或组织应具备两个条件：(1)能够接受外源基因，并通过基因重组或其它途径使外源基因稳定地插入植物染色体组内；(2)具有再生能力，能够形成新的植物体。当然，对于不同植物所需求的外植体种类可能不同，同一物种上，不同的外植体会有不同的转化效果。双子叶植物最常用叶片、子叶、原生质体；单子叶植物多用未成熟胚、愈伤组织、原生质体。总的来说对于禾谷类作物获得离体再生植株比较难，建立高频率的植株再生体系，是实现高效遗传转化的基础。
植物的遗传转化(genetic transformation)是指利用生物及物理化学等手段，将外源基因导入植物细胞以获得转基因植物的技术。植物遗传转化研究不仅具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。一方面，通过将某一个外源基因导入植物可以作为分子生物学的研究工具，研究基因的表达、调控、结构和功能，并在分子水平上帮助解析植物生化过程。另一方面，遗传转化可以打破物种界限，有目的地实现物种之间或物种内部遗传物质的交流，是植物遗传改良的一条新途径。
植物遗传转化的研究始于70年代末，根癌农杆菌和Ti质粒的研究成果推动了它的进程，农杆菌转化的双子叶植物达120种。早期的一些实验表明农杆菌很难侵染禾谷类作物，因此禾谷类作物的转化研究相对较晚。直至禾谷类植物原生质体分离和培养体系建立后，采用PEG法、电击处理等手段，开始了禾谷类作物的遗传转化。
农杆菌介导的转化法是将外源DNA克隆至T-DNA区，农杆菌与植物细胞接触，利用农杆菌天然转移机制将外源基因导入受体细胞内。影响根癌农杆菌遗传转化的因素包括：1、不同的根癌农杆菌菌株具有不尽相同的宿主范围，对不同植物的转化效率存在差别。2、菌液浓度。3、同一物种的不同品种、同一品种的不同外植体对于根癌农杆菌介导的遗传转化反应不同，有不同的转化效率。4、对根癌农杆菌及其Ti质粒进行改造，可以扩展根癌农杆菌的宿主范围和提高转化率。5、诱导物质的应用及合适的pH值。
近十年来，由于基因枪轰击法、超声波处理等一系列新的转基因方法的出现，既克服了农杆菌介导转化的宿主限制，又绕开了繁锁复杂的原生质体培养，使许多原来难以转化的植物相继转化成功。
影响基因枪法转化频率的主要因素是轰击参数以及受体的生理因素。基因枪的轰击参数包括微弹的运动速度、微弹的射程、弹膛内的真空度、轰击次数、DNA的纯度与浓度、DNA沉淀剂的浓度等。微弹的运动速度是影响转化频率的一个重要因素，不同速度的微弹对组织和细胞的穿透力有差异。微弹的射程指基因枪的挡板与靶细胞间的距离，它也是影响转化频率的一个重要因素。在植物组织中只有某些特定的细胞具有再生能力，因此可以通过调节射程优先转化这些细胞。虽然转化频率与弹膛内的真空度呈正相关，但靶细胞对真空度有一定的耐受性，所以弹膛内的真空度也有一定的限制。轰击次数对转化频率也有影响，试验发现再次轰击cat和GUS的瞬时表达活性都有所增加，但是轰击次数再增加往往导致轰击细胞损伤严重，有时反而会降低转化频率。DNA的纯度和浓度均影响转化频率。DNA的纯度越高，转化效果越好；但是DNA的浓度越高，越容易使微弹粘连成大的凝结而使转化频率降低，目前普遍采用的DNA的浓度为1ug/ul。氯化钙与亚精胺常作DNA的沉淀剂，使DNA附着在金属颗粒表面，沉淀剂的浓度对转化频率有影响。Klein等人(1998)报道，氯化钙的最适浓度在1.9M-2.4M，亚精胺的最适浓度为7.69mM-76.9mM。
基因枪法的优点是无宿主限制，受体类型广泛，操作迅速、简单，能有效地转化质体。由于取材广泛，金属微粒的喷射面广，转化频率高，所以具有广泛的应用前景。缺点是转化的DNA片段太大时DNA片段容易断裂，外源基因容易以多拷贝插入基因组，易导致外源基因沉默。另外，基因枪法整个转化周期较长，随着长时间的继代培养，体细胞变异的可能性增多，愈伤组织的胚发生能力下降。同时，这种方法耗费的人力、物力也大。发明内容
本发明的目的是提供一种对玉米进行基因转化的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种对玉米进行基因转化的方法，包括以下步骤：
1)将玉米幼胚或愈伤组织浸入添加50-200μM乙酰丁香酮的携带外源基因的农杆菌D-inf溶液中，振荡30-60秒，并放置5-60分种，取出放到D-AS培养基上，在22-26℃黑暗条件下共培养2-7天；
2)把共培养2-7天后的幼胚或愈伤组织移入含有150-250mg/L噻孢霉素的无菌水中，洗涤1-3次，最后一次在含有150-250mg/L噻孢霉素的无菌水中浸泡15-60分钟；
3)取出幼胚或愈伤组织放至含150-250mg/L噻孢霉素的愈伤诱导培养基上2-7天；
4)低压选择，将转化受体移入加有低浓度筛选剂的筛选培养基上培养2周；
5)高压选择，将转化受体移入加有高浓度筛选剂的筛选培养基上培养3周，共进行2-3轮；
6)将选择到的抗性组织转到胚状体诱导培养基上，诱导形成胚状体；将形成胚状体的再转入到分化培养基上进行分化，得到转基因植物。
为了使转化的效果更好，在用农杆菌进行转化前，先用基因枪对外植体进行处理。
当外植体是幼胚时，用空的微弹载体轰击，这时样品室真空度25-27mmHg，可裂膜压力1100-1350psi，微弹飞行距离3-9cm。幼胚经基因枪轰击造成伤口，再用农杆菌侵染，产生的抗性愈伤率平均达40％，转化率明显得到提高。当外植体是愈伤组织时，用包被农杆菌的微弹轰击，这时样品室真空度25-27mmHg，可裂膜压力1100-1350psi，微弹飞行距离3-9cm。所述微弹的制备方法为：取金粉悬浮液50μl，放入1.5ml离心管中，加入1ml农杆菌溶液，振荡器上振荡5分钟，4000转/分离心1分钟，去掉上清液，重复3次；微弹载体用16μl含50-200μM乙酰丁香酮的无菌水重悬，每次射击用4μl。
利用本发明的方法，可以将外源基因成功地转入玉米组织中，对于玉米基因工程方面的理论研究以及遗传育种实践均具有重要意义。附图说明
图1为再生植株的hpt基因PCR分析电泳图。
图2为再生植株的bar基因PCR分析电泳图。
图3为再生植株的hpt基因Southern blotting分析结果图。
图4为再生植株的bar基因Southern blotting分析结果图。具体实施方式
材料和方法：
1、玉米材料
玉米自交系综3(Z3)、综31(Z31)、齐31(Q31)、莱1029(L1029)、P9-10、获白(H)、A188、B73，其中A188与B73的F2代记为F
2、菌株、质粒
如表1所示，质粒pTOK233、pAt5均为超双元载体，其上克隆有VirB、VirC、VirD基因。质粒p1301、p3301、pMG8为普通双元载体。质粒pTOK233、pAt5、p3301、p1301的T-DNA上含有intron的gus基因，它只在植物细胞表达，而不在细菌内表达，可以检测转化的植物细胞。质粒pMG225上有GFMcryIA基因；质粒pMH上有hpt基因；质粒pDM302上有bar基因。
表1、本发明所用农杆菌菌种及其质粒
菌株菌种 质粒 携带基因 抗生素(mg/l)
LBA4404 pTOK233 GUS HPT NPT II Hpt：50
LBA4404 pAt5 GUS CryIB Bar NPT II Kan：100
EHA105 p1301 GUS HPT NPT II Kan：50
LBA4404 p3301 GUS Bar NPT II Kan：100
EHA105 pMG8 Bar NPT II Kan：100 Str：25
3、生化试剂
潮霉素购自BOEHRINGER MANNHEIM公司，噻孢霉素购自Sigma公司，除草剂购自日本明治公司，限制性内切酶、随机引物试剂盒购自promega公司，乙酰丁香酮(AS)购自Fluka公司，同位素购自亚辉生物医学工程公司，X-Gluc等其它试剂和药品购自国内外相关厂家和公司。
选择剂的配制：
潮霉素(50mg/L)经0.22μm微孔过滤后，存于4℃；
噻孢霉素(250mg/L)经0.22μm微孔过滤后，存于-20℃；
除草剂用重蒸水配成PPT有效成分浓度为10mg/L，0.22μm微孔过滤后，存于室温。
4、仪器
PCR扩增仪(GeneAmp PCR System 9700)；PDS-1000/He型基因枪
5、培养基
(1)选择培养基的配制
D培养基经高压灭菌后，冷却至50℃左右，加入潮霉素和噻孢霉素或除草剂和噻孢霉素配成一定浓度的选择培养基。
(2)其它培养基的配制如表2-表4所示：
表2、农杆菌YEB培养基及YEP培养基
成分 YEB 成分 YEP
牛肉膏 5g/L NaCl 5g/L
胰蛋白胨 5g/L 胰蛋白胨 10g/L
蔗糖 5g/L 酵母提取物 10g/L
酵母提取物 5g/L pH 7.0
硫酸镁 0.5g/L 固体培养基加琼脂 15g/L
表3、农杆菌AB培养基：pH7.2
成分 浓度 成分 浓度
KH2PO4 3g/L Cacl2·H2O 0.012g/L
NaHP4·2H2O 1g/L FeSO4·7H2O 0.0025g/L
NH4Cl 1g/L 葡萄糖 5g/L
MgSO4·7H2O 0.3g/L KCl 0.15g/L
固体培养基加琼脂 15g/L
表4、玉米幼胚、愈伤组织培养、转化、诱导胚状体及
植株分化培养基 用途 培养基 植物激素 抗生素(mg/L)高渗预培养 D+0.4M甘露醇 Dicamba：15-30μM侵染 D-inf Dicamba：15-30μM共培养 D-AS Dicamba：15-30μM愈伤诱导 D Dicamba：15-30μM Hpt：15(PPT：5)cef：250
N6 2，4-D：2mg/L
选择 D1.5 Dicamba：15-30μM Hpt：20(PPT：10)cef：250
胚状体诱导 D1.5；DM 6-BA：5mg/L cef：100
分化 RM cef：100
D-inf溶液：N6大量元素、B5微量元素、RTV有机物、铁盐、蔗糖68克/升、葡萄糖36克/升、脯氨酸0.7克/升、水解酪蛋白0.5克/升、Dicamba：15-30μM，pH5.2。
D培养基：N6大量元素、B5微量元素、RTV有机物、蔗糖30克/升、L-脯氨酸0.7克/升、水解酪蛋白0.5克/升，琼脂8克/升、Dicamba：15-30μM，硝酸银100μM，pH5.8。
6、PCR扩增引物
1)hpt基因PCR扩增引物可扩增0.48kb片段，其序列是：
5’引物：5’GGC GAA GAA TCT CGT GCT TTC A 3’
3’引物：5’CAG GAC ATT GTT GGA GCC GAA A 3’
2)bar基因PCR扩增引物可扩增0.46kb片段，其序列是：
5’引物：5’GCG GTC TGC ACC ATC GTC A 3’
3’引物：5’GTA CCG GCA GGC TGA AGT CCA 3’
实施例1、农杆菌转化玉米幼胚
1、植物受体材料的准备：
玉米试材播种后，按试验需要进行控制授粉，以取得相应的自交系材料或杂交种。授粉后6-13天，取玉米幼穗在超净工作台上剥去苞叶，取出幼胚。
2、农杆菌菌株的培养
(1)菌株的保存方法
用接种环挑取农杆菌的单菌落划线于添加相应抗生素的AB固体培养基上，于28℃的培养箱中培养3天，转入4℃的冰箱保存，每隔一个月继代一次。
(2)菌液的制备
挑取继代3天后的农杆菌单菌落，在加有相应抗生素的液体YEB培养基中，以250rpm进行振荡培养，在28℃培养至对数生长期后，将菌液置于离心管中，在5000rpm下离心5min并收集菌体，将收集的菌体用添加100μM AS的D-inf液体培养基进行洗涤，以去除残余的YEB培养基，最后将农杆菌悬浮于添加100μM AS的D-inf中，OD值约0.3-0.4，备用。或用AB固体培养基培养2-3天，收集菌体，将收集的菌体用添加100μM AS的D-inf液体培养基进行洗涤，最后将农杆菌悬浮于添加100μM AS的D-inf中，OD值约0.3-0.4，放置半小时可用于转化。
3、感染和共培养
将幼胚放置在高渗培养基上3-4小时，用D-inf洗一次，再浸入添加100μM的D-inf农杆菌菌液中，用振荡器振荡30秒，并放置5分种，取出用灭菌滤纸吸干，放到D-AS培养基上，在25℃黑暗共培养3天，并设对照。
4、农杆菌清除和转化受体的恢复
把共培养3天后的幼胚移入含有250mg/L的噻孢霉素的无菌水中，洗涤1-3次，最后一次在含有250mg/L的噻孢霉素的无菌水中浸泡30分钟。取出植物材料，用无菌滤纸吸干，放至含250mg/L的噻孢霉素的愈伤诱导培养基上一周。
5、低压选择
将转化受体移入加有含10mg/L潮霉素(PPT5mg/L)的筛选培养基LSD1.5上，低选择压下培养2周。
6、高压选择
进行2-3轮20mg/L潮霉素(PPT10mg/L)高压选择，每轮3周。每次继代注意淘汰呈褐色和水渍化的愈伤组织，并把生长正常的愈伤组织用镊子夹碎，分开选择培养。
7、胚状体的诱导
将选择到的抗性愈伤组织转到诱导胚状体培养基上，3周即可出现胚状体。
8、再生
将形成胚状体的再转入到分化培养基上进行分化，培养条件为28℃，每日光照3000Lx光强光照16小时，很快就会有小苗再生出来。
9、幼苗锻炼
再生的小植株长到3片叶时，可将幼苗分移植到罐头瓶中，并在室内培养。
10、再生苗第一次移栽
待小苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1∶3)的小花盆中，最初3-5天，幼苗应遮上塑料薄膜，以保持湿度
11、再生苗的第二次移栽
当玉米苗又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中。得到的抗性植株数如表5所示。
自交系Z3、Z31、P9-10及杂交种F的再生植株大多数形态正常，雌雄穗正常，能够自交获得种子。自交系Q31的再生植株较矮，许多植株株高不到20厘米，大多数植株无雄穗产生，顶端也长出花丝，需要另取花粉为其授粉。
实施例2、实施例1中GUS基因的瞬时表达检测
将共培养3天后的外植体，加入已配好的X-Gluc底物溶液中，37℃保温、过夜。肉眼或在体视镜观察外植体表面及内部。绿色组织需用FAA溶液固定1h以上，并依次用70％、90％、100％的乙醇脱色，然后观察统计其表达率，表达率如表6所示：
从表6的结果可以看出，各种基因型的幼胚与含超双元载体pTOK233、At5共培养3天后，都检测到了GUS基因的瞬时表达。GUS瞬时表达率从20％到68.7％，平均为52.3％。说明农杆菌能够侵染玉米，T-DNA已经进入到玉米细胞内。
表5、得到的抗性再生植株数
品种 质粒 植株数
Z3 pTOK233 32
Z31 pTOK233 25
Q31 pTOK233 23
P9-10 pTOK233 11
F pTOK233 26
Z3 pAt5 22
Z31 pAt5 25
P9-10 pAt5 3
F pAt5 11
总计 178
表6、农杆菌侵染玉米幼胚的GUS瞬时表达率
品种 质粒 接种数 GUS+ 比率％
Z3 PTOK233 10 4 40
Z31 PTOK233 40 13 42.5
Z31 At5 10 2 20
Q31 PTOK233 50 28 56
Q31 At5 20 15 75
P9-10 PTOK233 32 22 68.7
F pTOK233 10 6 60
平均 172 90 52.3
实施例3、实施例1中抗性愈伤组织的筛选
经过高压培养的幼胚与含质粒At5的农杆菌共培养的幼胚放至含PPT5mg/L的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后转到含PPT10mg/L的筛选培养基上筛选培养，每三周继代一次。筛选培养至两个月，有一些愈伤生长状态良好，为抗性愈伤组织。统计产生的抗性愈伤率，如表7所示。
表7、农杆菌转化幼胚产生的抗性愈伤率
品种 质粒 接种数 抗性愈伤数 比率(％)
Z3 pTOK233 108 24 22
pAt5 117 26 22
Z31 pTOK233 179 44 26
pAt5 248 44 18
Q31 pTOK233 286 126 44
At5 157 27 17
P9-10 pTOK233 183 61 44
pAt5 121 37 31
F pTOK233 10 4 40
pAt5 61 33 54
平均 1470 426 29
两个月后，产生的抗性愈伤率达17％至54％。两种质粒转化幼胚产生的抗性愈伤率平均为29％。F产生的抗性愈伤率最高，且为II型愈伤。质粒pTOK233转化产生的抗性愈伤率平均为33.8％，质粒pAt5转化产生的抗性愈伤率平均为23.7％。
实施例4、农杆菌转化玉米幼胚再生植株的分子检测
一、RO代的分子检测
1、PCR检测
提取RO代再生植株叶片DNA，随机选取质粒pTOK233所转的植株53株，用hpt基因的引物进行PCR扩增，有48株为PCR阳性，扩增出与质粒正对照同样大小的片段(480bp左右)，而未转化植株没有扩增出相应的片段。部分植株的PCR结果如图1所示，其中M：λ/HindIII+EcoRI marker；Ck+：Plasmid pTOK233；CK-：Untransformed，除泳道13以外，均扩增出了与质粒正对照同样大小的片段。
随机选取质粒At5所转的植株35株用bar基因的引物进行PCR扩增，有28株为PCR阳性，扩增出与质粒正对照同样大小的片段(460bp左右)，而未转化植株没有扩增出相应的片段。部分植株的PCR结果如图2所示，其中Lane M：100bp Ladder；CK+：Plasmid At5 CK-：Untransformed control；Lane1-12：transgenic plants；除泳道11以外，均扩增出了与质粒正对照同样大小的片段。
2、Southern检测
提取RO代再生植株叶片DNA，经BamHI酶切后，用质粒MH酶切回收1.0kb的hpt基因片段为探针，对转pTOK233质粒的植株进行Southern blotting，部分植株得到了信号带，检测到了hpt基因，结果如图3所示，图中1-4泳道为转基因植株。
对转At5质粒的植株，经BamHI酶切后，用质粒pDM302酶切回收0.6kb的bar基因片段为探针，进行Southern blotting，部分植株得到了信号带，检测到了bar基因，结果如图4所示，图中泳道1-8是转基因植物，说明外源基因已经整合进玉米基因组中。
二、转化植株的后代检测
1、转化植株后代的分子检测
将转基因植株进行自交授粉，不能自交授粉的植株取与其相同基因型的其他转化植株或非转化植株的花粉授粉。取后代部分种子播种于温室，提取叶片总DNA进行PCR和Southern检测。转pTOK233质粒的植株后代，其中6个R1代株系检测到了PCR阳性的植株，其中5个R1代株系Southern blotting有阳性带。说明转基因能够稳定遗传到后代。编号为28转基因植株的R1代21株植株中14株Southern检测到hpt基因。
转At5质粒的植株后代的PCR发现，7个R1株系的植株检测到了PCR阳性的植株；2个R2株系，株系A2-1的10株PCR均为阳性，株系A5-1的17株中15株为PCR阳性。Southern blotting结果证实7个R1株系及2个R2代株系中均有阳性带植株。说明转基因已经稳定遗传到R1、R2代。
2、转化植株后代的抗性检测
以为转基因的种子Z31做对照，取转hpt基因的植株的R1代种子20-2和28-6、28-5、28-12、28-13灭菌后，在含有潮霉素的培养基或培养液中筛选发芽，两周后，观察发芽情况，统计发芽粒数及根长，结果见表8。
表8、转基因后代的潮霉素抗性
种子代号 平均根长(cm) 总种子数 发芽种子数 比率％
Z31(CK-) 1 28 4 14.3
20--2 1 28 19 67.9
28--6 1 30 30 100
28--5 0.5 30 30 100
28--12 3 17 6 36.0
28--13 1 17 2 11.8
未转基因种子(CK-)大部分发芽受到抑制，只有14.3％的种子发芽，发芽的种子的平均根长为1厘米。转基因植株的后代大部分发芽正常，但生长也受到影响，平均根长大多在1厘米以上。
3、转化植株后代的抗性检测
转质粒At5的植株的R1代种子A6-4、A6-12和R2代种子A2-3、A2-5、A5-6抗除草剂PPT的发芽结果如表9所示：
表9、转基因后代的PPT抗性种子代号 平均根长(cm) 总种子数 发芽种子数 比率％Z31(CK-) 3 27 13 48.1A2-3 10 29 27 93.1A2-5 8 29 25 86.3A5-6 9 27 26 96.3A6-4 8 25 25 100A6-12 5 27 22 81.5
未转基因种子(CK-)大部分发芽受到抑制，只有48.1％的种子发芽，发芽种子的平均根长为3厘米。转基因植株的后代大部分生长正常，平均根长大多在9厘米左右。
实施例5、农杆菌转化玉米愈伤组织
初生愈伤组织：将幼胚盾片朝上，接种于愈伤培养基上，每培养皿中接种20-40个幼胚，28℃暗培养2-3周后，即可诱导出初生愈伤组织。
愈伤组织：诱导出初生愈伤组织后，每2-3周继代一次，保留生长状态良好的愈伤组织。
按照实施例1的方法以愈伤组织为受体用带有外源基因的农杆菌对其进行转化，结果表明，初生愈伤组织作为转化受体，得到的抗性愈伤率为8％至46.4％，平均产生抗性愈伤率22.0％。
实施例6、基因枪辅助农杆菌转化玉米幼胚
1、用70％乙醇将PDS-1000/He型基因枪的样品室及其部件，包括可裂膜、载体膜、阻挡网等喷洒或浸泡灭菌。
2、称取60mg金粉(直径1.0μm，Bio-Rad)，置于1.5ml离心管中，加入1ml无水乙醇浸泡一夜，振荡悬浮数次，离心收集金粉微粒沉淀。然后用无菌水冲洗3-4次，最后用1ml无菌水重新悬浮即成为微粒载体。
3、空微弹载体的制备：
取金粉悬浮液50ul，放入无菌的1.5ml离心管中，可供轰击5枪。
4、取制备好的微弹溶液迅速而均匀地涂于载体膜上，待水或乙醇挥发后将DNA面朝下装入载体固定架中，然后装上可裂膜，把在高渗培养基上处理4个小时的新剥离玉米幼胚放放入样品室内。
5、根据PDS-1000/He型基因枪操作指南，抽真空轰击。样品室真空度27mmHg，可裂膜压力1100psi，微弹飞行距离9cm，每皿轰击一次。
6、轰击后取出材料，封口，置于28℃培养室内。在高渗培养基上放置20小时后，再按照实施例1的方法与农杆菌共培养3天，然后放到筛选培养基上进行筛选培养，2个月后统计产生的抗性愈伤数，如表10所示：
表10、基因枪辅助农杆菌转化
质粒 品种 接种数 抗性愈伤数 比率(％)
pTOK233 Z3 90 39 43.3
pAt5 Z31 90 34 37.7
平均 180 73 40
从表10可以看出，幼胚经基因枪轰击造成伤口，再用农杆菌侵染，产生的抗性愈伤率平均达40％，转化率明显得到提高。抗性愈伤经分化，得到了再生植株。
实施例7、基因枪辅助农杆菌转化玉米愈伤组织
1、玉米自交系Z3、Z31、Q31、P9-10的愈伤组织放在高渗培养基上处理4个小时备用。
2、用70％乙醇将PDS-1000/He型基因枪的样品室及其部件，包括可裂膜、载体膜、阻挡网等喷洒或浸泡灭菌。
3、称取60mg金粉(直径1.0μm，Bio-Rad)，置于1.5ml离心管中，加入1ml无水乙醇浸泡一夜，振荡悬浮数次，离心收集金粉微粒沉淀。然后用无菌水冲洗3-4次，最后用1ml无菌水重新悬浮即成为微粒载体。
4、微粒载体包被农杆菌：取金粉悬浮液50μl，放入无菌的1.5ml离心管中，加入1mL农杆菌溶液，振荡器上振荡5分钟，4000转/分离心1分钟，去掉上清液，重复3次。微弹载体用16μl含100μM乙酰丁香酮的无菌水重悬，每次射击用4μl。
5、取制备好的微弹溶液迅速而均匀地涂于载体膜上，待水或乙醇挥发后将DNA面朝下装入载体固定架中，然后装上可裂膜，把第1步制备的样品放入样品室内。
6、根据PDS-1000/He型基因枪操作指南，抽真空轰击。样品室真空度27mmHg，可裂膜压力1100psi，微弹飞行距离9cm，每皿轰击一次。
7、轰击后取出材料，封口，置于28℃培养室内，在高渗培养基上放置20小时，转移到D-AS培养基上，视农杆菌的生长情况，以看不到农杆菌菌落为标准，尽量延长共培养时间。
8、共培养3-7天。洗涤去菌后转移到筛选培养基上进行筛选培养，统计产生的抗性愈伤数，如表11所示。
表11、基因枪辅助农杆菌转化产生抗性愈伤率
质粒 品种 接种数 抗性愈伤数 比率(％)
pTOK233 Z3 110 9 8.2
p3301 Q31 110 17 15.5
p3301 Z31 110 13 11.8
pAt5 P9-10 60 7 11.7
平均 390 46 11.8
基因枪直接将农杆菌射入到植物愈伤组织中，产生抗性愈伤率平均为11.8％，比农杆菌转化幼胚的转化率低，但比基因枪直接射质粒的转化率高。