重组蛋白A基因及其表达产物的制备与应用 技术领域 本发明属于生物工程技术领域。具体涉及一种重组蛋白A基因，含有重组蛋白A基因的载体以及该载体转化的菌株和重组蛋白A基因表达产物的制备与应用。背景技术 葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。早在1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。Jensen(1959)也发现类似现象，并将其命名为A抗原。直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质，并与糖相区别，Grov(1960)将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或蛋白A(Protein A)。由于SPA的一些免疫特性，它已引起广大免疫学者的兴趣，并发展成为免疫学上一种有用的工具。
编码SPA的基因于1983年被克隆并在E.coli中表达(Duggleby，C.J and Jones，SA：cloning and expression of the Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichiacoli.Nucl Acids Res.11(1983)3065-3076；Lofdahl，S.，Guss，B.，et al；Gene forStaphylococcal protein A.Proc.Natl.Acid.Sci.USA 80(1983)697-701)。对SPA结构和功能的研究发现，SPA分子包含A、B、C、D、E五个同源结构域，每个结构域都有能与IgG自主结合的能力。SPA基因有1600bp，SPA基因序列及其编码的氨基酸序列见序列表SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4。
由于葡萄球菌蛋白A具有与大多数哺乳动物IgG的Fc段结合的能力，因此被广泛应用于单克隆抗体或多克隆抗体的分离纯化和检测。SPA地主要来源是从金黄色葡萄球菌蛋白中提取而来，SPA占菌体总蛋白的1.7％。但由于金黄色葡萄球菌是一种致病菌，其菌体蛋白的分离纯化存在一定困难，因此，通过基因工程方法获得重组蛋白A成为一种重要的备选方法，为大规模生产蛋白A提供了新的、安全的途径。发明内容 本发明提供了：1.重组蛋白A基因；2.构建含有该基因的载体，特别是表达载体；3.提供由该基因转化的微生物菌株；4.提供由这些转化菌株高效表达、生产重组蛋白A的方法；5.表达产物的应用。
发明的重组蛋白A基因是以3个人工合成的重组蛋白A基因单体串连而成，各重组蛋白A基因单体间以Acc I酶切位点相连，其中第一个重组蛋白A基因单体前端加入GAATTCATATGGTG，包括起始密码子ATG和与表达载体pBV220(由中国预防医学科学院病毒所张治清博士惠赠)相连的EcoR I酶切位点，最后一个重组蛋白A基因单体末端加入GTAGACTAAGGATCC，其中包括中止密码子TAA和与表达载体pBV220相连的BamHI酶切位点。该基因的基本特征如下：
a.序列特征：
类型：核酸
链数：双链
b.分子类型：DNA
c.来源：人工合成的重组蛋白A基因单体串连而成
d.该基因的结构由3个重组蛋白A基因单体串连而成。该基因由551个核苷酸构成，
编码178个氨基酸。该基因序列及其编码的氨基酸序列见序列表SEQ ID No.1、SEQ
ID No.2。
本发明还构建了含有上述重组蛋白A基因的载体，这些载体的构建方法是按照常规方法，将通过人工合成的重组蛋白A基因单体酶切后接入相应载体的相应酶切位点之间，再以Acc I内切酶酶切，连接成包含多个串连重组蛋白A基因单体的重组蛋白A基因表达载体。
上述含重组蛋白A基因的大肠杆菌表达载体优先由本发明合成的重组蛋白A基因与大肠杆菌表达载体pBV220构建成的重组表达载体，命名为pBVA20，其构建过程如图1所示。
本发明还提供了利用上述含大肠杆菌重组表达载体的大肠杆菌重组株生产重组蛋白A的方法，该方法是将菌种进行培养发酵并经热诱导使其高效表达重组蛋白A，再收集菌体，经分离纯化得到重组蛋白A产品。
本发明上述能表达重组蛋白A的大肠杆菌菌株优先为由含有重组蛋白A基因的表达载体pBVA20转化大肠杆菌DH5α得到的菌株，命名为Escherichia coli DH5α/pBVA20，简称DH5α/pBVA20。
利用大肠杆菌重组菌株DH5α/pBVA20生产重组蛋白A的具体方法为：1.种子液的制备：将菌种接种于三角瓶，接种量1-2％V/V，于30℃培养过夜；当O.D600 达到3-3.5时即可接种发酵；上述所用种子培养基为：LB培养基加100-200mg/l氨苄 青霉素；2.发酵：在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按1∶20-1∶5接种于发酵培养基上， 30℃发酵至O.D600达到0.4-0.8时，升温至42℃诱导，诱导3～5小时后离心收菌；3.重组蛋白A的分离纯化：
1)粗提：
将上述收集菌体用NaCl+磷酸盐缓冲液(7.0-8.0)悬浮，超声破碎，4℃离心，收集上清，得粗提液。
经SDS-PAGE电泳检测表明，用本法提取表达于大肠杆菌胞周质的重组蛋白A效果很好，粗提后大部分重组蛋白A被粗提，残存于菌体的量极微；
2)纯化
将粗提液进行Sephacryl S200分子筛(法玛西亚公司生产)纯化，收集特征峰(第二洗脱峰)即为纯化的重组蛋白A，其纯度可达90％以上。
本发明生产的重组蛋白A表达于大肠杆菌胞周质中，有利于表达产物的分离纯化。利用本发明表达生产重组蛋白A，具有表达量效率高，表达量大(占细菌可溶性蛋白总量的60-80％)，表达时间短(仅3-5小时)，易于纯化等优点，并且经实验证明，本发明所表达的重组蛋白A于天然蛋白A的生物活性无明显区别。
本发明采用温控型大肠杆菌表达系统生产重组蛋白A，还具有生产周期短(1天)，消耗低，能有效地降低成本，有利于基因工程重组蛋白A的产业化应用。附图说明
图1是重组表达载体pBVA20构建的示意图，其中，PR、PL为噬菌体启动子，T1、T2为的转录终止序列。
图2是重组蛋白A表达产物的SDS-PAGE电泳图。其中，M是标准分子量对照，泳道1是42℃诱导含pBV220空载体的DH5α/pBV220菌体，泳道2是42℃诱导表达的DH5α/pBVA20菌体，泳道3是42℃诱导表达的DH5α/pBVA20菌体培养上清。
图3是重组蛋白A表达产物分步纯化的SDS-PAGE电泳图。其中，M是标准分子量对照，泳道1是诱导表达的DH5α(pBVA20)菌体，泳道2、泳道3是菌体粗提后初步纯化的重组蛋白A，泳道4是菌体粗提后经分子筛Sephacryl S200纯化后的重组蛋白A。具体实施方式 以下通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1 重组蛋白A基因单体的合成：
通过化学合成的方法，设计合成重组蛋白A基因单体的两条链，退火获得重组蛋白A基因单体序列。其序列包括长度为174bp，两端是Acc I酶切位点，用于多个重组蛋白A基因单体构建的重复序列区。另外，还包括起始密码子ATG，第二密码子GTG，终止密码子TAA，及克隆用EcoR I及BamH I限制性内切酶接头共29bp。上述过程见说明书附图图1。
实施例2 含一个重组蛋白A基因单体的pBV220载体的构建：
用限制型内切酶EcoR I和BamH I将上述重组蛋白A基因单体切下，与经EcoR I及BamH I酶切的载体pBV220连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切鉴定后证明重组蛋白A基因单体已克隆至pBV220中。上述过程见说明书附图之图1。
实施例3 含有重组蛋白A基因的pBVA20载体的构建：
将上述含一个重组蛋白A基因单体的pBV220载体及重组蛋白A基因单体以Acc I酶切，回收相应片段后连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切筛选获得含有重组蛋白A基因的pBVA20载体。上述过程见说明书附图之图1。
实施例4 能高效表达重组蛋白A的大肠杆菌菌株DH5α/pBVA20的构建：
用CaCl2法将pBVA20转化E.coli DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pBVA20的重组转化子DH5α/pBVA20。上述过程见说明书附图之图1。
实施例5 利用大肠杆菌工程菌E.coli DH5α/pBVA20生产重组蛋白A：
1)菌种的培养发酵
挑取大肠杆菌工程菌E.coli DH5α/pBVA20，接种于LB培养基中，接种量1-2％V/V，于30℃培养过夜；次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按1∶20-1∶5接种于发酵培养基上，30℃发酵至O.D600达到0.4-0.8时，升温至42℃诱导，诱导3～5小时后离心收菌；
取少量细胞加2×上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准做SDS-PAGE凝胶电泳，结果如说明书附图图2，经诱导的E.coli DH5α/pBVA20菌体及上清在20kD的位置出现一条新的蛋白带(见图2泳道1及泳道3)，DH5α/pBV220(DH5α/pBV220为转化了pBV220空载体的DH5α菌，见图2泳道1)不出现此带，证明重组蛋白A已在E.coli DH5α/pBVA20中诱导表达。
2)表达的重组蛋白A的纯化
将上述收集菌体用NaCl+磷酸盐缓冲液(pH7.0-8.0)悬浮，超声破碎，4℃离心，收集上清，得粗提液。经SDS-PAGE电泳检测表明，用本法提取表达于大肠杆菌胞周质的重组蛋白A效果很好，粗提后大部分重组蛋白A被粗提，残存于菌体的量极微；将粗提液进行Sephacryl S200分子筛纯化，收集特征峰(第二洗脱峰)即为纯化的重组蛋白A，其纯度可达90％以上。
实施例6 Elisa检测表达的重组蛋白A抗体结合实验：1)包被：96孔板，每孔包被重组蛋白A样品100μl，37℃，1小时。2)封闭：每孔以100μl 1％的BSA封闭，37℃，1小时。3)加一抗：每孔加入约100μg人抗体，37℃，1小时。4)加二抗：每孔加入约100μl 1∶1000辣根标记抗体，37℃，1小时。5)显色。
经Elisa检测表明本发明提取的重组蛋白A与人抗体有强结合活性，与野生型蛋白A结合活性相近，每孔包被5ng重组蛋白A即可获得明显检测信号。对说明书中的名词的解释：
1.葡萄球菌蛋白A：简称SPA或蛋白A(Protein A)。
2.pBVA20：为含有本发明专利所述的目的蛋白A的pBV220。
3.pBV220：一种温控型大肠杆菌表达载体。
4.E.coli DH5α：大肠杆菌菌株DH5α。
5.DH5α/pBV220：为转化了pBV220的Escherichia coli DH5α菌；DH5α为
Escherichia coli DH5α的简称。
6.BSA：牛血清白蛋白。
7.重组蛋白A基因单体：即构成重组蛋白A基因的基因基本单位，有相对独立的结构。
序列表
(1)一般信息：
发明名称：重组蛋白A基因及其表达产物的制备与应用
序列数目：4
(2)SEQ ID No1的信息：
(I)序列特征：
(A)类型：核酸
(B)长度：551个碱基
(C)链数：双链
(II)分子类型：DNA
(III)序列描述：GAATTCATAT GGTGGTAGAC AACAAATTCA ACAAAGAACA ACAAAACGCG TTCTATGAGATCTTACATTT ACCTAACTTA AACGAAGAAC AACGAAACGC CTTCATCCAA AGTTTAAAAGATGACCCAAG CCAAAGCGCT AACCTTTTAG CAGAAGCTAA AAAGCTAAAT GATGCTCAGGCGCCGAAAGT AGACAACAAA TTCAACAAAG AACAACAAAA CGCGTTCTAT GAGATCTTACATTTACCTAA CTTAAACGAA GAACAACGAA ACGCCTTCAT CCAAAGTTTA AAAGATGACCCAAGCCAAAG CGCTAACCTT TTAGCAGAAG CTAAAAAGCT AAATGATGCT CAGGCGCCGAAAGTAGACAA CAAATTCAAC AAAGAACAAC AAAACGCGTT CTATGAGATC TTACATTTACCTAACTTAAA CGAAGAACAA CGAAACGCCT TCATCCAAAG TTTAAAAGAT GACCCAAGCCAAAGCGCTAA CCTTTTAGCA GAAGCTAAAA AGCTAAATGA TGCTCAGGCG CCGAAAGTAGACTAAGGATC C
(3)SEQ ID No2的信息：
(I)序列特征：
(A)类型：氨基酸
(B)长度：178个氨基酸
(II)分子类型：蛋白质
(III)序列描述：Met Val Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr GluIle Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile GlnSer Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala LysLys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys GluGln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu GluGln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser AlaAsn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys ValAsp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu HisLeu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu LysAsp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu AsnAsp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp
(4)SEQ ID No3的信息：
(I)序列特征：
(A)类型：核酸
(B)长度：1600个碱基
(C)链数：双链
(II)分子类型：DNA
(III)序列描述：tgattttgcg gttttaagcc ttttacttcc tgaataaatc tttcagcaaa atatttattttataagttgt aaaacttaca tttaaattta attataaata tagattttag tattgcaatacataattcgt tatattatga tgactttaca aatacataca gggggtatta atttgaaaaagaaaaacatt tattcaattc gtaaactagg tgtaggtatt gcatctgtaa ctttaggtacattacttata tctggtggcg taacacctgc tgcaaatgct gcgcaacacg atgaagctcaacaaaatgct ttttatcaag tgttaaatat gcctaactta aacgctgatc aacgtaatggttttatccaa agccttaaag atgatccaag ccaaagtgct aacgttttag gtgaagctcaaaaacttaat gactctcaag ctccaaaagc tgatgcgcaa caaaataact tcaacaaagatcaacaaagc gccttctatg aaatcttgaa catgcctaac ttaaacgaag cgcaacgtaacggcttcatt caaagtctta aagacgaccc aagccaaagc actaatgttt taggtgaagctaaaaaatta aacgaatctc aagcaccgaa agctgataac aatttcaaca aagaacaacaaaatgctttc tatgaaatct tgaatatgcc taacttaaac gaagaacaac gcaatggtttcatccaaagc ttaaaagatg acccaagcca aagtgctaac ctattgtcag aagctaaaaagttaaatgaa tctcaagcac cgaaagcgga taacaaattc aacaaagaac aacaaaatgctttctatgaa atcttacatt tacctaactt aaacgaagaa caacgtaacg gcttcatccaaagccttaaa gacgatcctt cagtgagcaa agaaatttta gcagaagcta aaaagctaaacgatgctcaa gcaccaaaag aggaagacaa caaaaaacct ggtaaagaag acggcaacaaacctggcaaa gaagacggca acaagcctgg taaagaagac aacaaaaaac ctggtaaagaagacggcaac aagcctggta aagaagacaa caacaaacct ggcaaagaag acggcaacaagcctggtaaa gaagacaaca acaagcctgg taaagaagac ggcaacaagc ctggtaaagaagacggcaac aaacctggta aagaagacgg caacggagta catgtcgtta aacctggtgatacagtaaat gacattgcaa aagcaaacgg cactactgct gacaaaattg ctgcagataacaaattagct gataaaaaca tgatcaaacc tggtcaagaa cttgttgttg ataagaagcaaccagcaaac catgcagatg ctaacaaagc tcaagcatta ccagaaactg gtgaagaaaatccattcatc ggtacaactg tatttggtgg attatcatta gccttaggtg cagcgttattagctggacgt cgtcgcgaac tataaaaaca aacaatacac aacgatagat atcattttatccaaaccaat tttaacttat atacgttgat taacacattc
(5)SEQ ID No4的信息：
(I)序列特征：
(A)类型：氨基酸
(B)长度：450个氨基酸
(II)分子类型：蛋白质
(III)序列描述：MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL