钩端螺旋体溶血素及其编码序列 【技术领域】
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码钩端螺旋体溶血素的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
背景技术
钩端螺旋体病是一种分布广泛的人兽共患病，主要分布在中国南方以及东南亚、南亚等发展中国家和地区。在中国，本病1995年列入法定传染病。1955-1993年，年平均发病率为十万分之七，年平均死亡率占发病人数的1.02％。
中国钩端螺旋体病的的流行菌群以黄疸出血群和波摩那群为主。黄疸出血群有15个血清型，其中以赖型最为常见。
中国虽在该病的防治方面取得了巨大的成功，但对该病的致病免疫的机理、疫苗的高效保护等问题仍未解决。
钩端螺旋体(Leptospira sp.)属格兰氏阴性菌。钩端螺旋体病患者不同程度上出现黄疸，同时有或者无出血或者肝肾功能受损，黄疸的程度通常并不与肝坏死有关，病情恢复后肝功能正常。一般认为这与红细胞受损有关，红细胞受到溶血素等毒素的作用后发生溶血，大量的胆红素进入组织中，肝脏不能完全代谢而导致黄疸，续而发生高胆红素症状。
然而，目前为止，仍没有公开过钩端螺旋体溶血素。因此，本领域迫切需要开发新的钩端螺旋体溶血素，以便为研究钩端螺旋体病的致病机制及诊断提供了基础。
【发明内容】
本发明的目的是提供新的钩端螺旋体溶血素以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目地是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的溶血素多肽，它包含；具有SEQID NO：2、4、6、8、10、12、14、16氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16氨基酸序列的多肽。更佳地该多肽不含信号肽序列。
在本发明的第二方面，提供分离的编码上述多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述钩端螺旋体溶血素多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备钩端螺旋体溶血素多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达钩端螺旋体溶血素的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出钩端螺旋体溶血素多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的钩端螺旋体溶血素多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子。
在本发明的第六方面，提供了检测样品中是否存在溶血素的方法，它包括：将样品与溶血素的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在溶血素。
在本发明的第七方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明的钩端螺旋体溶血素的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第八方面，提供了一种检测钩端螺旋体的试剂盒，其特征在于，它含有特异性检测钩端螺旋体溶血素的引物和/或与钩端螺旋体溶血素特异性结合的抗体。
在本发明的第九方面，提供了一种疫苗组合物，它含有安全有效量的本发明的钩端螺旋体溶血素多肽或其片段以及药学上可接受的载体。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【附图说明】
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了本发明各溶血素的功能结构域。图中各编号含义如下：
PD011673是PRECURSOR HYDROLASE SIGNAL SPHINGOMYELINASE HEMOLYSIS SMASEPHOSPHODIESTERASE B
PD447657是PRECURSOR HYDROLASE SIGNAL SPHINGOMYELINASE HEMOLYSIS SMASEPHOSPHODIESTERASE B
PD041204是C SPHINGOMYELINASE PRECURSOR SMASE HEMOLYTIC SIGNAL HYDROLASEPHOSPHODIESTERASE
PD314750是Leptospira borgpetersenii serovar hardjo type hardjobovis(TrEMBLQ9RMG4，HEM)
PD191426是HEMOLYTIC HEMOLYSIN HLPA From Prevotella intermediaTrEMBL 068620，HEM；TrEMBL Q9ZGK8-LEPBO lipopolysaccharide O-antigen；TrEMBL Q9X5J4-MYCAV，HEM)
PD007579是COMPLETE PROTEOME HEMOLYSIN TLYA HAEMOLYSIN HEMOLYSIN-LIKE U0247AMEMBRANE HEMOLYSIS MJ1257 From Tr051459-BORBU，HEM；TrQ9PQ54-UREPA，HEM；HLYA-TREHY，HEM
PD406054是PROTEOME COMPLETE HEMOLYSIN HLYA from TrEMBLQ9F6Y3-CHLAU，TrEMBLP74319-SYNY3；TrEMBLQ9X1R2-THEMA
PD002457是COMPLETE PROTEOME INTEGRAL MEMBRANE TRANSMEMBRANE CBS DOMAIN REPEATHEMOLYSIN PLASMID
PD002327是COMPLETE PROTEOME HEMOLYSIN CBS DOMAIN MAGNESIUM COBALT REPEATTRANSPORT EFFLUX
PD005611是PROTEOME COMPLETE HEMOLYSIN CBS DOM TrEMBL066507-AQUAE，HEM
【具体实施方式】
本发明人经过广泛而深入的研究，从问号钩端螺旋体(Leptospirainerrogans)黄疸出血群赖型赖株中分离纯化和鉴定了一类新的溶血素。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“钩端螺旋体溶血素多肽”或“钩端螺旋体溶血素”可互换使用，都指具有钩端螺旋体溶血素氨基酸序列(SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的钩端螺旋体溶血素，以及含有或不含有信号肽的溶血素。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。例如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的溶血素或多肽”是指溶血素多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化溶血素。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，但优选的是非糖基化的。
本发明还包括钩端螺旋体溶血素的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然钩端螺旋体溶血素相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“钩端螺旋体溶血素多肽”指具有钩端螺旋体溶血素活性或免疫原性的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16序列的多肽。该术语还包括具有与钩端螺旋体溶血素相同功能的、上述序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。该术语还包括钩端螺旋体溶血素的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与钩端螺旋体溶血素DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗钩端螺旋体溶血素多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含钩端螺旋体溶血素多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了钩端螺旋体溶血素多肽的可溶性片段。通常，该片段具有钩端螺旋体溶血素多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。这些片段也可用作免疫原以诱导针对钩端螺旋体的免疫应答反应。
发明还提供钩端螺旋体溶血素或多肽的类似物。这些类似物与天然钩端螺旋体溶血素多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“钩端螺旋体溶血素保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1 最初的残基 代表性的取代优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro；Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。以溶血素lep919_12为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，以溶血素lep919_12为例，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ IDNO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。本发明的其他蛋白依此类推。本发明的核苷酸序列可以根据密码子的对应关系，根据SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16的氨基酸推导出。
编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟的钩端螺旋体溶血素有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码溶血素的多聚核苷酸。
本发明的钩端螺旋体溶血素核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA文库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的DNA文库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或溶血素编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224；1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的溶血素多肽。一般来说有以下步骤；
(1).用本发明的编码钩端螺旋体溶血素多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，钩端螺旋体溶血素多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含钩端螺旋体溶血素编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的钩端螺旋体溶血素或多肽有多方面的用途，其中包括(但不限于)：将溶血素的某些片段融合在一起构成具有免疫原性且没有毒性的融合抗原，用作免疫原。
另一方面，本发明还包括对钩端螺旋体溶血素DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于钩端螺旋体溶血素基因产物或片段。较佳地，指那些能与钩端螺旋体溶血素基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的钩端螺旋体溶血素基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的钩端螺旋体溶血素基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达钩端螺旋体溶血素或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
菌体培养
1)培养基：使用EMJH液体培养基，配制5×的EMJH培养基1000毫升，称取BSA50g。无水醋酸钠0.5g，丙酮酸钠1g，硫酸亚铁0.25g，1.5％的氯化镁3.5ml，0.4％的硫酸锌5ml，0.15的硫酸铜1ml，磷酸氢二钠12.6g，磷酸二氢钾1.5g，氯化钠5g，氯化铵1.25g，0.05％的VB122ml，VB10.025g，调pH为7.2-7.6，定容至1000ml分别以0.7、0.45、0.2nm孔径的硝酸纤维素膜过滤除菌。使用时，用无菌水其5倍稀释。
2)培养条件：30℃，100转/分钟摇动培养40小时。
3)菌株：问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株。
实施例2
溶血素的核酸序列和氨基酸序列
用常规方法抽提钩端螺旋体DNA，构建文库。测定基因组全序列。根据计算机分析，合成引物，以抽提的钩端螺旋体DNA为模板，进行PCR扩增，获得溶血素的ORF序列。再次测序验证，与基因组序列相符。这些ORF编码具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16所示氨基酸序列的多肽。本发明的8种溶血素的基本情况如下表所示。
表A溶血素的核酸序列和氨基酸序列 名称ORF序列SEQ ID NO： 长度 (bp)蛋白序列的SEQ ID NO： 长度 (aa)溶血素No.1 lep919_12 1 720 2 239溶血素No.2 lep923-82 3 1677 4 558溶血素No.3 lep928_20 5 1794 6 597溶血素No.4 lep928_23 7 1872 8 623溶血素No.5 lep904_14 9 1335 10 444溶血素No.6 lep925_128 11 831 12 276溶血素No.7 lep925_54 13 1179 14 392溶血素No.8 lep924-101 15 942 16 313
本发明的钩端螺旋体溶血素No.1-8与其他细菌的溶血素都有一定的同源性，且具有溶血素特有的结构域(图1)。
实施例3
蛋白表达
用常规基因工程方法将钩端螺旋体溶血素基因克隆入融合表达载体pET28b(Novagene公司)，融合表达的受体菌选用大肠杆菌BL21(DE3)。常规条件发酵后，提取重组菌体蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳，分子量与预测值基本相同。大肠杆菌中表达的溶血素(带有His-tag的融合蛋白)，通过Ni-NTA柱分离纯化，得到纯的钩端螺旋体溶血素(融合蛋白)。
实施例4
制备抗体
将实施例3中获得的纯化的、重组His-融合蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下：将融合蛋白用等量的完全Freund′s佐剂乳化。用200μg乳化过的蛋白，对家兔进行淋巴结注射。一个月后，用等量的非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，对家兔以200μg的剂量进行淋巴结注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用ELISA检验抗体滴度。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生物工程研究中心<120>钩端螺旋体溶血素及其编码序列<130>021333<160>16<170>PatentIn version3.1<210>1<211>720<212>DNA<213>钩端螺旋体(Leptospira interrogans)<400>1atgaaaatga tacaaaatat tttgcgaaaa gaaaaagtta aaacatggaa tcaattgaaa 60ggctctaaat ttttcagatg ttgttgtctg tttattattt tatttttttt cgattgttta 120cctgatttac agtcttctga aaataattta tttttatctt tgctttctct tccaaaaaat 180caaggtataa tattaagaaa cgataaatct attgcaaagt ctaaaacgac acgaaaatac 240ggctgggtta cttttacatc tcaagtaacc ggaaaaaaaa tccaagcaga tcctgaacga 300cctgacggat ggttaagagt gaatgcttcg agtaacacgg attttacgac gttcacttta 360tatcaggatg gaaaagatcc agattgtatc aaaggcggcc ctatccgggt tgagcctact 420gcgtatcgaa attattattg gaattggtgg cttggaggag gtgcgggtaa ttacgcctat 480tatcctaaat ataaagatgg ttctaacaaa cttcaaattt acgttttaaa agtcagcggc 540tgtttggaat caggagatag agtcttattt tcggattatg atactataac tcaggatgat 600tattttgtca tagattggga tggaggcagc tggaatgagt atctttttct ttggtataaa 660tttcctaagg ttcagagagg atatttttat gttcaattga atgaaggccc tgaggaataa 720<210>2<211>239<212>PRT<213>钩端螺旋体(Leptospira interrogans)<400>2Met Lys Met Ile Gln Asn Ile Leu Arg Lys Glu Lys Val Lys Thr Trp1 5 10 15Asn Gln Leu Lys Gly Ser Lys Phe Phe Arg Cys Cys Cys Leu Phe Ile
20 25 30Ile Leu Phe Phe Phe Asp Cys Leu Pro Asp Leu Gln Ser Ser Glu Asn
35 40 45Asn Leu Phe Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro Lys Asn Gln Gly Ile Ile
50 55 60Leu Arg Asn Asp Lys Ser Ile Ala Lys Ser Lys Thr Thr Arg Lys Tyr65 70 75 80Gly Trp Val Thr Phe Thr Ser Gln Val Thr Gly Lys Lys Ile Gln Ala
85 90 95Asp Pro Glu Arg Pro Asp Gly Trp Leu Arg Val Asn Ala Ser Ser Asn
100 105 110Thr Asp Phe Thr Thr Phe Thr Leu Tyr Gln Asp Gly Lys Asp Pro Asp
115 120 125Cys Ile Lys Gly Gly Pro Ile Arg Val Glu Pro Thr Ala Tyr Arg Asn
130 135 140Tyr Tyr Trp Asn Trp Trp Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asn Tyr Ala Tyr145 150 155 160Tyr Pro Lys Tyr Lys Asp Gly Ser Asn Lys Leu Gln Ile Tyr Val Leu
165 170 175Lys Val Ser Gly Cys Leu Glu Ser Gly Asp Arg Val Leu Phe Ser Asp
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