脂氧化酶基因及其启动子、转运肽和蛋白质 本发明涉及新的脂氧化酶基因及从其衍生的启动子、转运肽和蛋白质。本发明也涉及使用新的脂氧化酶基因、启动子、转运肽和蛋白质的方法。本发明还涉及分离的编码具有脂氧化酶活性的多肽和转运肽的核酸分子。更特别的，本发明涉及分离的编码赋予联结的核苷酸序列化学诱导性表达而不是伤口或病原体诱导性表达的新启动子的核酸分子。此外，本发明涉及能够使联结的蛋白质定位于质体的肽。本发明也涉及具有脂氧化酶活性的蛋白质和它们在抑制真菌毒素中的使用。本发明更进一步地涉及包括编码新的脂氧化酶基因、启动子或转运肽地核酸分子的重组体核酸分子。同样，本发明涉及包含在此描述的核酸分子或重组体分子的宿主细胞、植物或其后裔。
植物在其生活周期中暴露于多种微生物中，其中的许多都能够导致疾病。因而植物发展了多种避免微生物建群的防御策略。用化学或生物的试剂的某些处理能诱导通常易受感染的植物对后来用有毒力的病原体接种变得系统地有抗性。已知该现象为系统获得性抗性，或SAR。
例如在稻中，用化学药品N-氰甲基-2-氯异烟酰胺(chloroisonicotinamid)，一种2，6-二氯异烟酸(INA)的衍生物，进行的处理具有对稻瘟病好的抗性诱导活性。有趣的是，用N-氰甲基-2-氯异烟酰胺的处理诱导了已知与植物对病原体防御有关的脂氧化酶(LOX，亚油酸酯：氧氧化还原酶，EC 1.13.11.12)(Seguchi等人(1992，Journal.Pest.Sci.17，107-113))。用稻瘟病真菌本身的处理也诱导了该脂氧化酶。然而，在现代农业中需要在手边有一个只被用化学药品的处理诱导而不被病原体或伤口诱导的基因。因而，本发明的一个主要目标是提供一种化学诱导的而不是病原体或伤口诱导的脂氧化酶基因。
提供启动子以及由该脂氧化酶基因编码的转运肽和蛋白质以用于农业生物技术是本发明的另一个目的。
在农业生物技术中，植物可以根据人们的需要而被修饰。实现这一点的一个途径是通过利用现代遗传工程技术。例如，通过向植物中引入一个目的基因，该植物可被特定地修饰以表达想要的表型性状。为此，植物最通常地是用包含启动子区、编码区和终止区的异源基因来转化的。遗传地操纵一个异源基因以在植物中表达时，启动子的选择常常是一个关键因素。虽然组成型地表达某些基因是想要的，即在所有时间并在多数组织和器官中表达，但是更想要其他只在对特殊刺激反应时表达或限于在特定的细胞或组织表达的基因。化学诱导启动子在前面已有描述(见如EP A-332 104)。然而，这些启动子也可被病原体诱导。可是有时候想要使用化学诱导的而不被病原体或伤口诱导的启动子。因而，本发明的一个主要目的是提供这种替代性的启动子以在植物中表达目的核苷酸序列。本发明也提供了包含本发明的启动子的重组体DNA分子、表达载体和转基因植物。当将目的基因引入到植物中时，它们最通常是在细胞质中表达的。作为替代地，有人可能希望在细胞中的其他区室表达那些基因。这可通过例如将目的基因引入到质体基因组而不是核基因组而实现。然而，当前质体转化不是所有农业上重要作物的常规方案。在质体中表达目的蛋白质的另一个可能途径是向编码目的蛋白质的DNA序列的5’端添加一个编码转运肽的DNA序列，并从核基因组中表达该DNA序列。转运肽是能够使联结的蛋白质定位于质体的肽。提供该转运肽从而是本发明的另一个目的。本发明也提供了包含本发明的转运肽的重组体DNA分子、表达载体和转基因植物。该转运肽可被用于完全异源的构建体或与它们天然地联结的启动子或编码区一起使用。本发明还提供了包含本发明的转运肽的重组体DNA分子、表达载体和转基因植物。
在农业生物技术中不仅启动子的选择是重要的，而且联结的编码想要的表型性状的DNA的选择也是重要的。一个特别想要的表型性状是本发明的脂氧化酶蛋白质。本发明从而提供了包含本发明的脂氧化酶蛋白质的重组体DNA分子、表达载体和转基因植物。
本发明从而提供了：
一种能够驱动联结的核苷酸序列化学诱导而非伤口或病原体诱导的表达的分离的核酸分子，其中该分离的核酸分子
●是来自保存于目录号DSM 13524的质粒pBSK+LOX4A的约4.5kb长的PstI/PstI片段的一种成分
●是SEQ ID NO：17描述的核苷酸序列的一种成分
●在SEQ ID NO：18中描述
●在SEQ ID NO：19中描述
●包括SEQ ID NO：1描述的核苷酸序列
●包括SEQ ID NO：2描述的核苷酸序列
●包括SEQ ID NO：2描述的核苷酸序列的nt 1到nt 1358
●包括SEQ ID NO：3描述的核苷酸序列
●包括SEQ ID NO：2的nt 1702到nt 2104和/或SEQ ID NO：3的nt 1到nt 97和/或SEQ ID NO：3的SEQ ID NO：3的nt 367到nt1283
●包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3描述的任一核苷酸序列或其部分的组合
●在严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19，或与保存于目录号DSM 13524的质粒pBSK+LOX4A的约4.5kb长的PstI片段进行杂交，其中所述的核酸分子能够驱动联结的核苷酸序列化学诱导而非伤口或病原体诱导的表达
●包括SEQ ID NO：1的、SEQ ID NO：2的、SEQ ID NO：3的、SEQ ID NO：17的、SEQ ID NO：18的或SEQ ID NO：19的，或保存于目录号DSM 13524的质粒pBSK+LOX4A的约4.5kb长的PstI片段的长度至少为50nt的连续片段，优选地为约500碱基，特别地在约1000碱基和约1500碱基之间，更特别地为约2000碱基，最特别地在约3000碱基和约4500碱基之间，其中所述的分离的核酸分子能够驱动联结的核苷酸序列化学诱导而非伤口或病原体诱导的表达，特别地，其中所述的长度至少为50nt的连续片段与SEQ ID NO：1的、SEQ ID NO：2的、SEQ ID NO：3的、SEQ ID NO：17的、SEQID NO：18的或SEQ ID NO：19的，或保存于目录号DSM 13524的质粒pBSK+LOX4A的约4.5kb长的PstI片段的相应长度的连续片段具有至少70％的序列一致性，优选地为80％，更优选地为90％，最优选地为95％
●其中能够诱导所述的核酸分子的化学诱导物选自BTH(苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)，INA(2，6-二氯异烟酸)和烯丙异噻唑。
●其中能够诱导所述的核酸分子的化学诱导物是茉莉酮酸
更进一步地提供的是包含根据本发明有效地连接到目的核苷酸序列上的核酸分子的重组体核酸分子，其中
●目的核苷酸序列包含蛋白质、多肽或肽编码序列
●编码序列在其5’-端包含编码SEQ ID NO：6描述的氨基酸序列的核苷酸序列
●编码序列编码一个想要的表型性状
●编码序列编码一个选择或筛选标记基因
●编码序列编码能提供抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其他害虫的抗性、除草剂耐受性、改良的营养价值、在工业方法中改良的性能或改变了的繁殖能力的蛋白质
●编码序列编码植物中有商业价值的酶或代谢物
●编码序列处于反义方向
更进一步地提供的是包含本发明的分离的核酸分子或重组体核酸分子的分离的核酸分子表达载体，以及根据本发明用分离的核酸分子或重组体核酸分子稳定转化的宿主细胞，其中
●宿主细胞是细菌
●宿主细胞是植物细胞
●宿主细胞是选自稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、甜玉米、豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、石刁柏、洋葱、大蒜、辣椒、芹菜、南瓜、西葫芦、大麻、小胡瓜、苹果、梨、榅桲、甜瓜、李子、樱桃、桃、nectarine、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、西红柿、高粱属的植物(sorghum)、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、苜蓿、烟草、胡萝卜、棉花、紫花苜蓿、马铃薯、茄子、黄瓜、鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)和木本植物如针叶树和落叶树的植物细胞，特别是选自稻、玉米、小麦、大麦、卷心菜、花椰菜、辣椒、南瓜、甜瓜、大豆、西红柿、甜菜、向日葵或棉花、稻、玉米、小麦、高粱(Sorghum bicolor)，果园杂草(orchardgrass)、甜菜和大豆的细胞
●宿主细胞是一种双子叶植物的细胞
●宿主细胞是一种选自大豆、棉花、烟草、甜菜和油料种子油菜的双子叶植物的细胞
●宿主细胞是一种单子叶植物的细胞
●宿主细胞是一种选自玉米、小麦、高粱属的植物、黑麦、燕麦、草坪草、稻和大麦的单子叶植物的细胞
更进一步地提供的是根据本发明用核酸分子或重组体核酸分子稳定转化的植物及其后裔。特别的，其中所述的植物选自玉米、小麦、高粱属的植物、黑麦、燕麦、草坪草、稻、大麦、大豆、棉花、烟草、甜菜和油料种子油菜。更进一步地提供的是转化的植物及其后裔的种子。
另外，还提供了本发明分离的核酸分子在表达目的核苷酸序列中的应用。
本发明更进一步地公开
●根据本发明分离的核酸分子在表达目的核苷酸序列中的应用
●一种制造根据本发明的分离的核酸分子的方法，其中的核酸分子是通过聚合酶链式反应制得的，其中至少一条所用的寡核苷酸包含一个代表了SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19中15或更多碱基对长的连续片段的核苷酸序列
本发明也提供了编码SEQ ID NO：6描述的氨基酸序列的分离的核酸分子，特别地其中所述的氨基酸序列能够将联结的蛋白质定位于质体，其中
●该核苷酸序列是SEQ ID NO：4描述的序列
●特别地该核苷酸序列能与SEQ ID NO：4在严格的条件下杂交，其中所述的序列与SEQ ID NO：4的核苷酸序列具有70％，优选地为80％，更优选地为90％的序列一致性并且其编码的肽能够将联结的蛋白质定位于质体
更进一步地提供了由上述分离的核酸分子编码的多肽或肽以及这些多肽或肽在将联结的目的蛋白质定位于质体中的应用。
另外，本发明提供了在严格条件下与SEQ ID NO：5杂交并编码具有脂氧化酶活性的蛋白质的分离的核酸分子，并且其中由所述的核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID NO：7描述的氨基酸序列具有至少65％，优选地为75％，更优选地为85％，最优选地为95％的氨基酸序列一致性。
本发明更进一步地提供了在上文中提到的核酸分子，其中该核酸分子编码SEQ ID NO：7描述的蛋白质。更进一步地提供了由在上文中提到的核酸分子编码的蛋白质，特别地为SEQ ID NO：7或具有脂氧化酶活性的蛋白质或多肽的部分。
本发明更进一步地公开了在上文中提到的蛋白质抑制真菌毒素特别是黄曲霉毒素的应用。本发明更进一步地提供了通过在转化的植物中表达本发明中编码脂氧化酶活性的分离的核酸分子而提高植物疾病抗性或抑制真菌毒素的方法。
更进一步地提供的是包含上述的核酸分子的重组体核酸分子，用其稳定转化了的宿主细胞，特别地，其中所述的宿主细胞是一种植物细胞，以及用上述的重组体核酸分子稳定地转化了的植物及其后裔。
为了确保对说明书和权利要求有一个清楚并一致的理解，提供了如下定义：
DNA改组：DNA改组是一种快速地、容易地且有效地在DNA分子中(优选为随机地)引入重排或(优选为随机地)在两个或更多DNA分子间产生DNA序列交换的方法。从DNA改组而得来的DNA分子是一种改组的DNA分子，即来自于至少一个模板DNA分子的非天然出现的DNA分子。
表达：指植物中内源基因或转基因的转录和/或翻译。例如在反义构建体的情况下，表达可仅指反义DNA的转录。
功能相当的序列：指与稻脂氧化酶基因启动子或其部分具有基本上相似的启动子活性，并且在严格的条件下可与所述的启动子序列杂交的DNA序列。
基因：指编码序列和联结的调节序列，其中编码序列被转录成RNA如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有意义RNA或反义RNA。调节序列的例子有启动子序列、5’-和3’-非翻译序列和终止序列。可能存在的其他元件为如内含子。
目的基因：指当转移到植物中后，可以使植物具有所需要的特征如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其他害虫的抗性、除草剂耐受性、改良的营养价值、在工业方法中改良的性能或改变了的繁殖能力的任何基因。“目的基因”也可以是转移到植物中以在植物中生产有商业价值的酶或代谢物的基因。
异源的：用在这里指具有不同的天然来源或具有合成的来源。例如，如果用不出现于非转化的宿主细胞中的核酸分子来转化宿主细胞，这个核酸分子相对于该宿主细胞就是异源的。转化的核酸分子可以包含异源的启动子、异源的编码序列或异源的终止序列。作为替代的，用于转化的核酸可以是完全异源的，或可以包括异源和内源的核酸序列的任何可能组合。
前导区：基因中在转录起始点和翻译起始点间的区域。
LOX：脂氧化酶。
标记基因：指编码可选择或可筛选性状的基因。
nt：核苷酸，并且是天然存在的或合成的核苷酸。
核酸分子：是任何通常为DNA或RNA的单链或双链多核苷酸，可包含天然存在的或合成的核苷酸。
有效地连接到/与之联结的：如果两个序列所处位置使得调节DNA序列影响到编码DNA序列的表达时，则将该调节DNA序列称为“有效地连接到”编码RNA或蛋白质的DNA序列或“与之联结的”。
植物：指任何植物，特别指种子植物。
植物细胞：植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以下列形式存在，即分离的单细胞或培养的细胞，或作为高级组织单位如植物组织或植物器官的一部分。
植物材料：指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵细胞、受精卵、胚、种子、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
多核苷酸：任何单链的以磷酸二酯键在(通常地)一个核苷酸的单糖的3’位置和临近的核苷酸的单糖的5’位置相连的至少约10个核苷酸的同聚物或杂聚物，或任何包含两个以氢键连接在一起的该单链分子的双链分子。
启动子：指启动联结的DNA序列转录的DNA序列。启动子区也可以包括作为基因表达调节物的元件如激活剂、增强子、和/或阻抑物，并可包括5’非翻译区的所有部分或部分。
蛋白质、多肽或肽：在这里可交换地使用，指由肽键连接的氨基酸残基。
重组体DNA分子：用重组体DNA技术连接在一起的DNA序列的组合。
重组体DNA技术：用以将所述的DNA序列连接在一起的方法，例如见Sambrook等人，1989，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
筛选标记基因：指一个表达后不赋予转化的细胞选择优势但其表达使得转化的细胞在形态上与未转化的细胞有区别的基因。
选择标记基因：指其在植物细胞中的表达赋予该细胞选择优势的基因。用选择标记基因转化的细胞所拥有的选择优势可以是由于与未转化的细胞的生长相比，它们在负选择剂如抗生素或除草剂存在下生长的能力。与未转化的细胞相比，转化的细胞所拥有的选择优势也可以是由于它们增强的或新的利用添加的化合物作为营养物、生长因子或能量来源的能力。选择标记基因也可指基因或基因的组合，当选择试剂存在时，它们在植物细胞中的表达与选择试剂不存在时相比，对转化的植物细胞有正效应而对未转化的细胞有负效应，例如关于生长的情况，因而给转化的细胞带来了正的选择优势。
序列一致性：序列一致性的百分比是用基于动态规划算法的计算机程序来确定的。在本发明范围内优选的计算机程序包括设计用于探索所有可利用的序列数据库的BLAST(基础局部比对搜索工具(BasicLocal Alignment Search Tool))搜索程序，不管该查询是蛋白质还是DNA。本搜索工具的BLAST 2.0版(Gapped BLAST)已经是在因特网上公众可用的了(目前为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。它使用了探索式算法，搜索局部比对而不是全局比对从而能够探测到仅共享分离的区域的序列间的关系。在BLAST搜索中指定的分值具有定义明确的统计学解释。该程序优选地将可选择的参数设为默认值来运行。
转化：指将核酸引入细胞。特别的，它指将DNA分子稳定地整合入目的生物体的基因组中。
本发明涉及脂氧化酶基因，和从它衍生的启动子、转运肽以及蛋白质。优选的是化学诱导的而不是病原体或伤口诱导的脂氧化酶基因。特别的，该脂氧化酶基因来自稻。这样的脂氧化酶基因或它的部分或片段可通过如基于PCR的策略而获得。为此，利用本领域已知的计算机程序将已知的脂氧化酶编码序列，如来自稻的(Peng等人(1994)J.Biol.Chem.269，3755-3761；Ohta等人(1992)Eur.J.Biochem.206，331-336)和来自小麦的(Grlach等人(1996)Plant Cell.8，629-643)进行比对以鉴定保守区。通过这种方法，鉴定了一些保守区，其中的一个靠近C-末端并包含在所有三个序列中不变的氨基酸序列HAAVNFG。于是，从未处理的对照叶子和喷洒了100ppm的INA溶液并在处理后24和48小时收获的叶子中分离了总RNA或聚腺苷酸化RNA。
将RNA样品用做RT-PCR的模板，该RT-PCR以与稻RLL2脂氧化酶(Peng等人(1994)J.Biol.Chem.269，3755-3761)的C-末端区HAAVNFG的氨基酸序列基元相对应的简并的寡核苷酸5’-CAYGCNGTNAANTTYGG-3’(SEQ ID NO：8)作为正向引物，以一个锚式寡脱氧胸苷酸引物作为反向引物(5’-AATGCTTTTTTTTTTTTTTTV-3’，SEQ ID NO：9)。当将此方法在稻的总RNA或聚腺苷酸化RNA中实行时，只在INA-处理的样品而不在对照中，在用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶中出现了约600bp长的PCR产物。本领域的技术人员知道条带的大小将依赖于从中分离RNA的生物体，可能会更小或更大。所得的条带可被克隆、测序并用本领域公知的方法用做探针来筛选cDNA或基因组文库以获得全长的脂氧化酶cDNA或基因组克隆。经筛选从INA-处理的叶子构建的稻cDNA文库，获得了长度为3018bp的全长稻脂氧化酶cDNA克隆(SEQID NO：5)。命名为RCI-1(稻化学诱导的cDNA 1)的该cDNA克隆包含一个编码922个氨基酸残基预期分子量为105kDa的蛋白质(SEQID NO：7)的2766bp长的可读框(SEQ ID NO：5中从碱基48到碱基2816)。对那些本领域的技术人员而言，众所周知所得的cDNA克隆依赖于该克隆是否是全长的、5’和3’非翻译区的长度和从中构建该文库的生物体，可以是更大或更小。
当将RCI-1 cDNA作为探针与来自化学处理的叶子(如用INA、BTH、烯丙异噻唑或茉莉酮酸处理的叶子)的RNA进行Northern印迹分析时，观察到了强的杂交信号，显示RCI-1 mRNA的积聚。当使用来自伤口或病原体处理的叶子的RNA时没有观察到这种mRNA的积聚。这是很令人惊讶的，因为已知受伤可增加稻内源的茉莉酮酸水平并诱导对稻瘟病感染的增加的系统保护(Schweizer等人(1998)Plant J.14，475-481；Schweizer等人(1997)Plant Physiol.114，79-88)。然而本发明的脂氧化酶既不是由病原体如稻瘟病菌Magnaporthegrisea也不是由细菌病原体丁香假单孢菌丁香致病变种(Pseudomonassyringae pv.syringae)诱导的。这显示相应基因的启动子区一定包含赋予联结的编码序列化学诱导性而不是伤口-或病原体诱导性表达模式的调节元件。
由RCI-1 cDNA编码的蛋白质与大麦的LOX2：Hv：1最相似(60％的一致性和68％的相似性)。在氨基酸水平上的序列一致性(相似性)对主要在谷粒和幼苗中发现的稻脂氧化酶L-2为43％(52％)(Ohta等人(1992)Eur.J.Biochem.2O6，331-336)，对Magnaporthe grisea-诱导的稻脂氧化酶RLL2为50％(58％)(Peng等人(1994)J.Biol.Chem.269，3755-3761)。本发明包含的DNA序列是那些在严格条件下与RCI-1 cDNA克隆(SEQ ID NO：5)杂交的序列和那些编码序列与SEQ ID NO：7描述的蛋白质具有至少65％，优选地为75％，更优选地为85％和最优选地为95％的氨基酸序列一致性的序列，并且该序列编码一个具有脂氧化酶活性的蛋白质。
本发明的脂氧化酶cDNA用本领域公知的方法可在大肠杆菌(E.coli)或任何其他适宜表达真核序列的表达系统中进行表达。然后分析表达的蛋白质并可选择地纯化。所有这些方法对于本领域的技术人员而言是公知的。当分析表达本发明的cDNA的大肠杆菌细胞抽提物时，用亚油酸作为底物探测到了增加的LOX活性，而对照的没有表达构建体或含有空载体的大肠杆菌抽提物没有可探测的LOX活性。最大的活性是在pH8到9附近观察到的，显示RCI-1必须被归为1型LOX(Siedow(1991)Ann.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol.42，145-188)。然而，应该注意到目前引入了基于质体(plastomic)转运肽的存在的第二个分类系统(Shibata等人(1994)Plant Mol.Biol.Rep.12，41-42)。根据这个方案，RCI-1必须被归为2型LOX。
当本发明的重组体脂氧化酶反应产物用HPLC进行分析时(Bohland等人(1997)Plant Physiol.114，679-685)，不论是用亚油酸还是用亚麻酸作为酶的底物，(13S)-氢过氧-(9Z，11E，15Z)-十八烯三酸(13-HPOD)都是主要产物。只探测到了较小量的(9S)-氢过氧-(10E，12Z，15Z)-十八烯三酸(9-HPOD)。已报道用从13-HPOD衍生的反应产物充当Magnaporthe grisea的抗微生物物质(Shimura等人(1981)Agric Biol Chem 45：1431-1435；Shimura等人(1983)Agric Biol Chem 47：1983-1989)。这显示本发明的脂氧化酶，特别是RCI-1 LOX，参与了可能充当信号或展示直接的抗微生物活性的脂肪酸衍生物的产生(在Slusarenko，A.J.(1996)脂氧化酶在抗感染中的作用(The role of lipoxygenase in resistance to infection.)中有综述。《Lipoxygenase and Lipoxygenase Pathway Enzymes》(Piazza，G.J.，ed)pp.176-197.American Oil Chemists Society Press，Champaign，Illinois)。在一个特别的实施方案中，本发明的脂氧化酶适宜于消除或基本减少真菌毒素的活性，该真菌毒素包括但并不限于黄曲霉毒素及其前体柄曲霉素、桔霉素、fungal tremorgens、羽扇豆中毒(lupinosis)、赭曲毒素、棒曲霉素、红色青霉毒素、葚孢菌素、葡萄穗霉毒素(stachybotyrotoxins)、单端孢菌毒素和玉米赤霉烯酮，但特别是黄曲霉毒素和柄曲霉素。
将本发明的脂氧化酶蛋白质的氨基酸序列与其他脂氧化酶如大麦LoxA(GenBank目录号L35931)或稻L-2(Swissprot目录号P29250)的氨基酸序列所做的比对显示本发明的脂氧化酶具有N-末端30到50个氨基酸残基的延长。在稻脂氧化酶RCI-1的情况下该延长长度为约47个氨基酸。这个N-末端的延长明显地将这类LOX与其他主要在种子和幼苗中发现的包括来自大麦的LoxA、LoxB和LoxC(vanMechelen等人(1999)plant.Mol.Biol.39，1283-1298)和来自稻的LOX L-2(Ohta等人(1992)Eur.J.Biochem.206，331-336)的种类区分开来了。当N-末端延长的一部分或全部融合到报告基因的N-末端区时，该报告基因就定位于质体，特别是叶绿体。例如，当通过将RCI-1cDNA(SEQ ID NO：4)的前158 bp融合到绿色荧光蛋白(GFP)编码序列的5’末端而构建了嵌合基因时，即得到了在N-末端含有RCI-1(SEQ ID NO：6)的前37个氨基酸的修饰的GFP。当将该构建体通过例如基于农杆菌属(Agrobacterium)的转化系统而引入到拟南芥(Arabidopsis)组织中时，即观察到了GFP荧光和叶绿素自身荧光的严格叠合，显示融合蛋白质定位在叶绿体中了。因而，本发明脂氧化酶蛋白质的N-末端延长发挥了转运肽的功能而将联结的蛋白质转移到质体中，特别是叶绿体中。
另外，本发明也提供了能够赋予联结的目的核苷酸序列化学诱导性而不是伤口-或病原体-诱导性表达的启动子。优选地是从稻脂氧化酶基因RCI-1得到的启动子序列。包含其功能的和/或结构的等价物的核苷酸序列也包含在本发明中。本发明从而涉及发挥联结的核苷酸序列转录的启动子功能的核苷酸序列。启动子区也可包括充当基因表达调节物的元件如激活剂、增强子和/或阻抑物，并可包括转录的mRNA的5’非翻译前导序列和/或内含子，也可任选的包括外显子。化学诱导性而不是伤口-或病原体诱导性表达意思是目的核苷酸序列优选地当应用了根据本发明的化学化合物而不是在受伤或暴露在病原体中时表达。因而，根据本发明的核苷酸序列对联结的目的核苷酸序列的化学诱导性而不是伤口-或病原体诱导性表达是有用的，该目的核苷酸序列优选地是编码序列。本领域的技术人员公知联结的目的编码序列可在有意义或反义的方向被表达。更进一步地，对被转化的植物而言，目的编码序列可以是异源的或同源的。在同源的编码序列的情况下，根据本发明的核苷酸序列对该序列的异位表达是有用的。在本发明一个特殊的实施方案中，在根据本发明的核苷酸序列控制下的目的编码序列的表达通过一个称为共抑制的方法抑制了它自身及基因的原始拷贝的表达。
本发明的启动子可通过例如用本领域公知的技术用根据本发明的cDNA作为探针对稻基因组文库进行探测而从稻基因组DNA中获得。对于本领域的技术人员而言，很显然来自其他生物体特别是植物的基因组DNA可被用来从任何目的生物体中获得脂氧化酶启动子。然后将基因组DNA测序并与cDNA序列进行比对。基本上，认为起始密码子上游的所有核苷酸序列都是脂氧化酶启动子区的一部分。另外，可将内含子和任选的外显子添加到该区域以构成一个赋予联结的编码区化学诱导的而不是伤口-或病原体诱导的表达的功能性启动子。
在本发明的一个优选实施方案中，脂氧化酶启动子是来自以目录号DSM 13524保存的质粒pBSK+LOX4A的长度约为4.5kb的PstI/PstI片段的一个成分。SEQ ID NO：17描述了来自质粒pBSK+LOX4A的约4.5kb长的PstI/PstI片段的核苷酸序列。本发明其他的优选实施方案是SEQ ID Nos：18、19、1、2和3所描述的核苷酸序列，它们是上文中提到的4.5kbPstI/PstI片段的成分。本发明另一个优选实施方案包含SEQ ID NO：2描述的核苷酸序列的nt 1到nt 1358。
SEQ ID NO：1包含4.5kbPstI/PstI片段的5’末端。该核苷酸序列长为358核苷酸且在其5’末端位置1到6含有PstI位点。在4.5kbPstI/PstI片段中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间的区域长度约在240和440bp之间。4.5kb PstI/PstI片段的中央区域显示在SEQ IDNO：2中，长度为2104bp。它含有推定的TATA盒(SEQ ID NO：2中位置1261到1266)，推定的起始密码子(SEQ ID NO：2中位置1359到1361)，以及5’非翻译区和推定的TATA盒上游的核苷酸序列。对基因组DNA(SEQ ID NO：2)和cDNA(SEQ ID NO：5)所作的比较显示位于SEQ ID NO：2中位置1312到1701的序列包含外显子1的全长或部分，位于SEQ ID NO：2中位置1702到2104的序列为内含子1的5’部分。在4.5kb PstI/PstI片段中SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3之间区域长度约在85和285bp之间。4.5kb PstI/PstI片段的3’末端显示在SEQ ID NO：3中。该序列描述了长度为1516bp的核苷酸序列。它从5’到3’的方向包含内含子1的3’末端(SEQ ID NO：3中位置1到97)，随后是外显子2(SEQ ID NO：3中位置98到366)，内含子2(SEQ ID NO：3中位置367到1283)和外显子3的一部分(SEQ ID NO：3中位置1284到1516)。PstI位点位于位置1511到1516。
基于在SEQ ID NO：1到3中所给的序列信息，本发明的DNA序列可以例如通过PCR(以质粒pBSK+LOX4A或来自稻或任何其他生物体的目的基因组DNA作为模板)获得。本领域的技术人员知道怎样用本领域公知的方法得到这些序列。然后将这些序列融合到报告基因以证明启动子活性。例如，可构建包含融合到GFP编码序列的RCI-1基因的部分5’调节序列的嵌合基因。最后，pBSK+LOX4A(参见实施例9)可被用作聚合酶链式反应(PCR)的模板。可以设计基因特异性的引物来扩增基因的5’启动子区。利用如反向引物R1(SEQ ID NO：12)和正向引物F1(SEQ ID NO：13)和F2(SEQ ID NO：14)的组合分离得到了起始甲硫氨酸上游～1.2kb和～2kb长的调节序列。用正向引物F1和反向引物R1扩增的PCR片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：18所示，用正向引物F2和反向引物R1扩增的PCR片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。为了使克隆容易，引物由如基因特异性序列和GATEWAYTM克隆技术(LifeTechnologies，GIBCO BRL，Rockville，MD，美国)的attB重组位点组成。引物R1可以用作反向引物，具有如下序列：5’-CAAGAAAGCTGGGTTGACAAATTAAGTTGTCAGTGTG-3’(SEQ ID NO：12)。反向引物R1的基因特异性序列用下划线表示(相应于SEQ ID NO：2中位置1356到1334)，attB重组序列以斜体字显示。正向引物的例子为引物F1和F2。正向引物F1具有如下序列：5’-CAAAAAAGCAGGCTTGTAACATCCTACTCCTATTGTG-3’(SEQ ID NO：13)。正向引物F1的基因特异性序列用下划线表示(相应于SEQ ID NO：2中位置159到181)，attB重组序列以斜体字显示。F1与R1组合扩增了一个长～1.2kb的片段。正向引物F2具有如下序列：5’-CAAAAAAGCAGGCTCCCCGTCTTTATCTACTC-3’(SEO ID NO：14)。正向引物F2的基因特异性序列用下划线表示(相应于SEQ ID NO：1中位置31到48)，attB重组序列以斜体字显示。引物F2与引物R1组合扩增了一个长～2kb的片段。
利用嵌套式PCR策略，调节序列可以先用引物F1+R1或F2+R1随后以引物attB1(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’，SEQ ID NO：15)和引物attB2(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’，SEQ ID NO：16)进行二次PCR而扩增得来。最适的退火温度可用一台梯度热循环仪(DNA Engine，MJ Research，Inc.Waltham，MA，美国)和对基因特异性引物F1+R1或F2+R1的如下PCR条件：[(94℃：10秒)：(94℃：10秒/45℃到70℃梯度：10秒/72℃：10秒)×15]而确定。PCR反应后产物可通过凝胶电泳而显现，来自得到可见产物的具最高Tm值的反应的DNA可被选择出来用引物attB1+attB2进行扩增。在随后的PCR扩增中，可用如下PCR条件：[(94℃：10秒)：(94℃：10秒/50℃到70℃梯度10秒/72℃：10秒)×15]。结果所得的PCR产物在侧翼与attB重组位点相接，使其可被用来根据厂商的方案通过BP反应在pENTR中产生进入克隆(Entry Clones)(参见：GATEWAYTMCloning Technology说明书手册，GIBCO BRL，Rockville，MD，美国，http：//www.lifetech.com/)。将含有RCI-1起始密码子5’的～1.2kb和～2kb的所得质粒称为pENTR+LOXp1.2，pENTR+LOXp2。然后根据在说明书手册(GATEWAYTM Cloning Technology，GIBCO BRL，Rockville，MD，http：//www.lifetech.com/)中所述的厂商的方案用GATEWAYTM技术通过重组而将调节/启动子序列融合到mGFP-5报告基因上(MRC Laboratory of Molecular Biology，Cambridge，英格兰)。简要地说，根据本方案，将在进入载体(entry vector)中的启动子片段通过LR反应而与含有在GFP报告基因5’有一个attR位点的mGFP-5编码区的二元农杆菌属目的载体进行重组。插入片段的方向由att序列来维持，最终的构建体由测序来验证。将该构建体称为pLOXp1.2启动子∷GFP或pLOXp2启动子∷GFP，且可将它通过电穿孔而转化入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株。任何其他二元载体也可被修饰来容纳本发明的启动子片段以驱动联结的报告基因的表达。技术人员知道如何从商业上可获得的二元载体例如pGPTV-BLEO(ATCC号码77392)，pBI 121(Clontech，Palo Alto，California)，或pCambia 1302(Cambia，Canberra，澳大利亚)来构建这样的载体。然后利用如农杆菌介导的转化技术来制得转基因植物。基因融合蛋白质的表达可在转化体中使用Leica-TCS共焦激光扫描显微镜和PLAPO×100油浸物镜(Leica Microsystems，Heidelberg，德国)通过共焦成像来监控，滤器设置如下：激发波长476/488nm；GFP-发射波长515-552nm，叶绿素-发射波长673-695nm。利用独立的2-通道-探测来同时记录GFP荧光和叶绿素自身荧光。
可以对来自表达pRCI启动子∷GFP构建体的转基因稻植株的叶子进行共焦成像以分析响应非生物的和生物的诱导物的启动子活性。
基于在SEQ ID NO：1到3中所示的核苷酸序列，对于技术人员而言很显然任何目的引物组合都可以被选择用来PCR扩增根据本发明可使用的各种长度的DNA片段。于是，任何目的区域都可以从SEQID NOs：1到3扩增而来。例如，可以设计引物来特异地扩增内含子1或内含子2或5’上游区域。此处定义5’上游区域为位于脂氧化酶蛋白质推定的TATA盒和推定的起始密码子之间的区域。技术人员也可考虑将内含子1和/或内含子2与SEQ ID NOs：1，2和/或3的各个部分组合，以得到含有SEQ ID NO：2的nt 1702到nt 2104和/或SEQ IDNO：3的nt 1到nt 97和/或SEQ ID NO：3的SEQ IN NO：3的nt 367到nt 1283的DNA分子。
更进一步地，可能也希望将任何这些序列与脂氧化酶cDNA序列的3’非翻译区(SEQ ID NO：5的位置2817到3018)进行组合。
本发明于是包含衍生自稻RCI-1脂氧化酶基因的片段，该片段发挥根据本发明的功能，即能够赋予联结的核苷酸序列化学诱导的而不是伤口-或病原体诱导的表达。这可以通过生成这些启动子片段，将其融合到选择性或筛选性标记基因上，并在原生质体或稳定转化了的植物中瞬时表达分析该融合的构建体中启动子活性的保持来进行检验。这些检验在普通技术人员的技术范围内。本发明优选的核酸分子片段的长度为至少约500碱基，特别的在约1000碱基和约1500碱基之间，更特别的为约2000碱基，最特别的为约3000碱基和约4500碱基之间。
技术人员很清楚利用本领域公知的技术可以将一个或多个核苷酸的突变、插入、删除和/或替换引入到SEQ ID NOs：1，2和3或衍生自其序列信息的更长或更短的片段的核苷酸序列中。另外，可以通过改组本发明的序列而改变本发明未修饰的或修饰的核苷酸序列。为了检验根据本发明的核苷酸序列变体的功能，将目的序列有效地连接到选择或筛选标记基因上，该标记基因的表达在原生质体或稳定转化了的植物中用瞬时表达分析进行检验。技术人员公知能够驱动联结的核苷酸序列表达的核苷酸序列是以模块(modular)的途径建立的。因此，更短的核酸分子片段的表达水平可能不同于最长片段的，且二者可能各不相同。例如，一个减量调节的上游元件的缺失将导致联结的核苷酸序列表达水平的上升，而一个增量调节元件的缺失将导致联结的核苷酸序列表达水平的下降。鉴定联结的核苷酸序列的调节表达所必需的启动子元件的另一个途径是所谓的接头分区(linker-scanning)分析。接头分区诱变使得可鉴定突变后改变启动子活性的确定的短基元。因此，一套融合到GUS报告基因或其他标记基因的编码序列的接头分区突变启动子可利用本领域公知的方法构建而成。然后将这些构建体转化入例如拟南芥中，并在一些独立的转基因品系中分析GUS活性。然后再将每一突变对启动子活性的影响与含有未突变的稻脂氧化酶基因启动子的数量相当的转基因品系进行比较。可以预期，当一个参与化学性而不是伤口或病原体-诱导性表达的基元突变后，报告基因的表达水平就被修饰。如果例如与对照构建体相比由化学诱导物得到了更高GUS活性的平均诱导量，那么在此构建体中极可能有一个负调节元件被突变了。另一方面，如果观察到由根据本发明的化学调节物导致的GUS活性可诱导性的完全丧失，那么极可能一个化学诱导必需的正调节元件被突变了。在下一步中，特别是在推定的正调节元件的情况下，将与突变的片段相对应的野生型序列融合到一个最小的启动子上，并检验该新创造的启动子赋予联结的标记基因可调节的表达的能力。
包含在本发明中的还有本发明的RCI-1启动子的功能性等价物，即在严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19，或与以目录号DSM 13524存放的质粒pBSK+LOX4A的4.5kb长的PstI/PstI片段杂交的核苷酸序列。严格的杂交是在温度为65℃，优选地为60℃，最优选地为55℃时在二倍强度(2×)的含有0.1％SDS的柠檬酸缓冲的盐溶液(SSC)中进行，随后在相同温度用具有降低的SSC浓度的缓冲液漂洗支持体。该降低浓度的缓冲液一般为含有0.1％SDS的十分之一(0.1×SSC)的SSC，优选地为含有0.1％SSC的0.2×SSC，最优选地为含有0.1％SDS的半倍强度(0.5×SSC)的SSC。事实上，通过将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或以目录号DSM 13524存放的质粒pBSK+LOX4A的4.5kb PstI/PstI片段中任何一个与从目的生物体特别是另外的单子叶植物分离的基因组DNA进行杂交，即可发现RCI-1脂氧化酶启动子的全部或部分在其他生物体中的功能等价物。技术人员知道如何去发现这些序列，因为本领域公知有许多途径可以从其他生物体中鉴定同源序列。然后这些新鉴定的DNA分子可被测序，并可与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19或与以目录号DSM 13524存放的pBSK+LOX4A的4.5kb PstI/PstI片段的核苷酸序列中任何一个进行比较，它们的启动子活性也可被检验。在本发明的范围内的DNA分子与SEQ ID NOs：1、2或3中任何一个的核苷酸序列在至少50核苷酸的长度上具有至少75％，优选地为80％，更优选地为90％，最优选地为95％的序列一致性。序列一致性的百分数是利用基于动态规划算法的计算机程序来确定的。在本发明的范围内优选的计算机程序包括设计用于探索所有可利用的序列数据库的BLAST(基础局部比对搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool))搜索程序，不管该查询是蛋白质还是DNA。本搜索工具的BLAST 2.0版(Gapped BLAST)已经是在因特网上公众可用的了(目前为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。它使用了探索式算法，搜索局部比对而不是全局比对从而能够探测到仅共享分离的区域的序列间的关系。在BLAST搜索中指定的分值具有定义明确的统计学解释。该程序优选地将可选择的参数设为默认值来运行。
如果需要，可将本发明的启动子与根据本发明编码转运肽的核苷酸序列(例如用SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列)进行融合，以在质体特别是叶绿体中得到联结的目的编码区的化学调节的表达。
根据本发明化学调节物被定义为通过一个化学可调节的DNA序列来调节基因表达的物质。离子或中性形式的，具有或不具有溶剂化或其他络合的分子或阴离子的该物质在需要调节时相对于含有化学诱导性基因的系统而言通常是外生的。外生的化学调节物的使用之所以是优选的，是因为在系统中控制调节物的量容易且方便。然而，本发明也包括内生调节物的使用，例如在系统中的活性或水平由系统中或作用于系统的其他成分控制的化学药品。
根据本发明的化学调节物包括苯甲酸、水杨酸、聚丙烯酸和它们的替代衍生物；合适的取代基包括低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基(alkylthio)和卤素，但特别是INA、BTH、烯丙异噻唑、茉莉酮酸酯和茉莉酮酸甲酯。
本发明的化学调节性DNA序列和嵌合基因的另外一组调节物是基于苯并-1，2，3-噻二唑结构的，包括但不局限于下述类型的化合物：苯并-1，2，3-噻二唑羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑硫代羧酸、氰基苯并-1，2，3-噻二唑、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸酰胺、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸酰肼和它们的衍生物。
一组优选的调节物包括但不局限于苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑-7-硫代羧酸、7-氰基苯并-1，2，3-噻二唑、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸酰胺、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸酰肼和它们的衍生物。
合适的衍生物包括但不局限于所述化合物类型的代表物，其中苯并-1，2，3-噻二唑部分是被通常用在农用化学品的芳香环中的小取代基如低级烷基、低级烷氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、低级烷硫基、氰基、硝基和卤素不取代或取代的。更进一步地，合适的衍生物包括但不局限于所述的苯并-1，2，3-噻二唑化合物的代表物，其中羧酸、硫代羧酸、羧酸酰胺或羧酸酰肼功能基团被脂肪族的、芳代脂肪族的(araliphatic)或芳香族基团不取代或取代。合适的基团包括但不局限于烷基(尤其是低级烷基)、烷氧基(尤其是低级烷氧基)、低级烷氧基烷基、烷氧基烷氧基烷基、环烷基、环烷基烷基、苯基烷基(尤其是苯甲基)、萘基烷基、苯氧基烷基、链烯基和链炔基，其中取代基中的烷基部分被羟基、卤素、氰基或硝基不取代或取代，取代基的芳香部分被通常用在农用化学品的芳香环中的小取代基如低级烷基、低级烷氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、低级烷硫基、氰基、硝基和卤素不取代或取代。
基于苯并-1，2，3-噻二唑结构的调节物包括所有能够释放事实上充当调节物的分子系统。
一组优选的基于苯并-1，2，3-噻二唑结构的调节物包括苯并-1，2，3-噻二唑羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸烷基酯(其中的烷基基团含有1到6个碳原子)，以及这些化合物的取代的衍生物。合适的取代基包括低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基和卤素。特别的，苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸及其烷基酯，例如苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸甲酯，是含有从PR蛋白质基因中分离得来的化学调节性DNA序列的嵌合DNA序列的优选诱导物。上述的化学调节物的合成及其作为杀生物剂的效用可通过英国第1,176,799号专利和Kirby，P等人，J.Chem..Soc.C 2250(1970)来了解。
在基于苯并-1，2，3-噻二唑结构的优选的种类中可能提及例如苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸甲酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸正丙酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸苯甲酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸仲丁基酰肼等。
本发明的化学调节性DNA序列的另外一组调节物是基于吡啶羧酸结构的，例如异烟酸结构和优选地为卤代异烟酸结构。优选地为二氯异烟酸及其衍生物，例如低级烷基酯。这类化合物中的合适的调节物为如2，6-二氯异烟酸及其低级烷基酯，尤其是甲基酯。
化学调节物可以纯的形式、溶液或悬浮液、作为粉末或粉剂、或农业上或在生物反应器方法中使用的其他常规配方形式使用。这些配方可含有固体或液体载体，即将调节物结合于其上以利于在植物、组织、细胞或细胞培养物等中的应用的物质，或改进保存、处理或运输性质的物质。合适的载体的例子包括硅酸盐、粘土、碳、硫、树脂、醇、酮、芳烃等。如果设计为常规的可湿的粉末或乳状水溶液，那么调节制剂可含有一种或多种常规的表面活性剂，离子型的或非离子型的，例如润温的、乳化的或分散的试剂。
调节物也可与其他希望能带给植物一些益处的试剂联合应用于植物，该益处涉及或不涉及由被调节物调节的任何嵌合基因控制的性状。例如，调节物可与一种肥料掺和并正好在需要一个不涉及多产的转基因的性状表达之前应用。或者它可以与一种除草剂联合使用以在当该除草剂的影响为最大时减轻这种影响。
作为一种液体制剂，调节物可以喷雾应用于植物叶、茎或枝、种植前的种子、或土壤、或其他支持该植物的生长培养基中。调节物也可被用于生物反应器系统中，通过向反应培养基中一次性地加入调节物制剂或在预定的时间内逐渐地加入来完成调节。
调节物应以足够量且在足够的时间内应用以影响到想要的调节。优选的调节物是那些对植物、植物组织或植物细胞在应用了应用量的调节物时不显示或只显示最小限度的毒害植物的或其他有害的影响的调节物。
本发明更进一步的方面是调节化学诱导性而不是伤口或病原体诱导性基因转录的方法，该方法包括将这种化学调节物应用于含有如上所述的化学可调节的核苷酸序列的植物组织、植物或种子。优选的是这样一种方法，其中植物组织、植物或种子含有上述的优选的化学调节核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供含有根据本发明有效地连接到目的核苷酸序列上的启动子的重组核酸分子。目的核苷酸序列可编码如核糖体RNA、反义RNA或任何其他类型的不翻译成蛋白质的RNA。在本发明另一个优选实施方案中，目的核苷酸序列被翻译成了蛋白质产物。与启动子序列联结的核苷酸序列对于要转化的植物而言可以是同源的或异源的。序列也可以是完全地或部分地合成的。不管来源如何，联结的核苷酸序列将在转化的植物中按照与其连接的启动子的表达性质表达。在与启动子序列联结的是同源核苷酸序列的情况下，根据本发明的启动子对于该同源序列的异位表达是有用的。异位表达意思指与启动子序列联结的同源核苷酸序列在该序列自身的启动子控制下不表达的组织和器官和/或时间中表达。在本发明一个特定的实施方案中，与启动子序列联结的核苷酸序列的表达通过一个称为共抑制的方法抑制了它自身的表达及基因的原始拷贝的表达。
在本发明一个优选的实施方案中，联结的核苷酸序列可编码需要以化学诱导性但不是伤口-或病原体诱导性方式表达的蛋白质。这样的核苷酸序列优选地编码赋予以其转化的植物想要的表型性状的蛋白质。例子为编码赋予抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其他害虫的抗性、除草剂耐受性、改良的营养价值、在工业方法中改良的性能或改变了的繁殖能力的蛋白质的核苷酸序列。联结的核苷酸序列也可以是转化入植物以在植物中生产有商业价值的酶或代谢物的。包含在本发明中的也有选择性或筛选性标记基因，即包含本发明中有效地连接到编码一个选择性或筛选性性状的编码区的核苷酸序列的基因。
选择性或筛选性标记基因的例子如下所述。对于某些目的物种而言，不同的抗生素或除草剂选择性标记是优选的。常规用于转化的选择性标记包括赋予卡那霉素、巴龙霉素、遗传霉素及相关抗生素抗性(Vieira和Messing，1982，Gene 19：259-268；Bevan等人，1983，Nature 304：184-187)的nptII基因，编码氨基糖苷3’腺苷酰基转移酶并赋予对链霉素或壮观霉素的抗性的细菌aadA基因(Goldschmidt-Clermont，1991，Nucl.Acids Res.19：4083-4089)，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochlinger和Diggelmann，1984，Mol.Cell.Biol.4：2929-2931)，和赋予对氨甲蝶呤抗性的dhfr基因(Bourouis和Jarry，1983，EMBO J.2：1099-1104)。所用的其他标记基因包括赋予对除草剂膦丝菌素抗性的膦丝菌素乙酰转移酶基因(White等人，1990，Nucl.Acids Res.18：1062；Spencer等人，1990，Theor.Appl.Genet.79：625-631)，编码草甘膦抗性的突变的EPSP合酶基因(Hinchee等人，1988，Bio/Technology 6：915-922)，赋予咪唑啉酮(imidazolione)或磺酰脲抗性的突变的乙酰乳酸合酶基因(ALS)(Lee等，1988，EMBO J.7：1241-1248)，赋予对莠去津抗性的突变的psbA基因(Smeda等人，1993，Plant Physiol.103：911-917)，或如EP 0 769 059中描述的突变的原卟啉原氧化酶基因。也用到了导致正选择的选择性标记，如在专利申请WO 93/05163中描述的磷酸甘露糖异构酶基因。
转化细胞的鉴定也可通过筛选性标记基因的表达而完成，例如编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、荧光素酶(LUC)，和绿色荧光蛋白(GFP)或其他赋予转化的细胞以表型上独特的性状的任何蛋白质的基因。
本发明的更进一步的目的是提供包含本发明中融合到联结的目的核苷酸序列的核苷酸序列的重组表达载体。在这些载体中，可将外源核酸分子插入到多位点接头区以使得这些外源序列可在例如细菌或植物来源的合适的宿主细胞中得到表达。例如，衍生自根癌农杆菌二元载体pBIN19的质粒pBI101使得可利用β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)表达信号来克隆和检验启动子(Jefferson等人，1987，EMBO J 6：3901-3907)。载体的大小为12.2kb。它含有一个低拷贝的RK2复制起点，可在细菌和植物二者当中均赋予卡那霉素抗性。本领域的技术人员公知根据本发明有许多其他的表达载体可被利用。
本发明更进一步的目的是提供包含本发明的重组DNA序列的转基因植物。本发明从而涉及植物细胞、衍生自该细胞的植物、植物材料、衍生自该植物的后裔和种子以及具有由下述任何转化方法获得的改良性质的农业产品。根据本发明转化的植物可以是单子叶的或双子叶的，包括但不局限于稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、甜玉米、豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、石刁柏、洋葱、大蒜、辣椒、芹菜、南瓜、西葫芦、大麻、小胡瓜、苹果、梨、榅桲、甜瓜、李子、樱桃、桃、nectarine、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、西红柿、高粱属的植物、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、苜蓿、烟草、胡萝卜、棉花、紫花苜蓿、马铃薯、茄子、黄瓜、鼠耳芥和木本植物如针叶树和落叶树。优选地转化的植物为稻、玉米、小麦、大麦、卷心菜、花椰菜、辣椒、南瓜、甜瓜、大豆、西红柿、甜菜、向日葵或棉花，但尤其是稻、玉米、小麦、高粱，果园杂草、甜菜和大豆。本发明的重组DNA序列可以许多众所周知的方法引入到植物细胞中。本领域的技术人员可意识到这些方法的选择可能依赖于作为转化目标的植物的类型，即单子叶或双子叶。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人，1986，Bio Techniques 4：320-334)，电穿孔(Riggs和Bates，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国83：5602-5606)，农杆菌介导的转化(Hinchee等人，1988，Bio/Technology 6：915-922；EP0 853 675)，直接基因转移(Paszkowski等人，1984，EMBO J.3：2717-2722)，以及利用Agracetus，Inc.，Madison，Wisconsin和Dupont，Inc.，Wilmington，Delaware提供的设备的弹道微粒加速(ballisticparticle acceleration)(参见如美国专利号No.4,945,050和McCabe等人，1988，Bio/Technology 6：923-926)。要转化的细胞可以是分化的叶细胞、胚性发生细胞或任何其他类型的细胞。在对原生质体的直接转化中，原生质体对外源遗传材料的摄取可通过使用化学试剂或电场而被增强。然后可将外源的材料整合入核基因组中。以前的工作是在双子叶的烟草植物中实施的，结果外源DNA被整合并传递到了子代植株中(Paszkowski等人，1984，EMBO J.3：2712-2722；Potrykus等人，1985，Mol.Gen.Genet.199：169-177)。利用该程序转化了单子叶原生质体，例如一粒小麦(Triticum monococcum)、多花黑麦草(Lolium multiflorum)(意大利黑麦草)、玉米和黑墨西哥甜玉米(Black Mexican sweet corn)的原生质体。另外的优选实施方案是如在EP 0 292 435以及EP 0 846 771中公开的玉米原生质体转化方法。关于玉米转化也可参见Koziel等人，1993，Bio/Technology 11：194-200。稻的转化可通过利用原生质体的直接基因转移或微粒轰击而实现。原生质体介导的转化是对日本产类型和印度产类型(Indica-types)而描述的(Zhang等人，1988，Plant Cell Rep.，7：379-384；Shimamoto等人，1989，Nature 338：274-276；Datta等人，1990，Bio/Technology8：736-740)。上述的两种类型也是常规的用微粒轰击可转化的(Christou等人，1991，Bio/Technology 9：957-962)。专利申请No.EP0 332 581描述了Pooideae原生质体的产生、转化和再生的技术。这些技术使得可转化所有Pooideae植物包括鸭茅属和小麦。此外，小麦转化在专利申请No.EP 0 674 715和Weeks等人，1993(Plant.Physiol.102：1077-1084)中有描述。这样构建的植物表达载体可例如根据常规的植物转化方法而被引入到稻的愈伤组织中，从中诱导根和叶的分化，然后移入花盆培养，从而获得转化的稻。
经本发明的DNA序列或载体转化所得的植物将在植物全身和大多数的组织和器官中表达目的核苷酸序列。
如上所述设计入转基因植物的遗传性质通过有性繁殖或营养生长而传递，从而可在后代植物中维持并繁殖。通常所说的维持和繁殖利用了已知的发展来适应特定目的如耕种、播种或收获的农业方法。也可应用如水培或温室技术的专门方法。更进一步地将根据本发明的转基因植物的有益遗传性状用于植物育种，以发展具有改良性质的植物，如对害虫、除草剂或逆境的耐受性，改良的营养价值，增加的产量，或使得存放或粉碎损失较小的改良的结构。各个育种步骤特征在于明确的人工干预例如选择要进行交配的品系、亲本品系的定向授粉或选择合适的子代植物。依赖于想要的性质而采取不同的育种措施。相关的技术是本领域中众所周知的，包括但不局限于杂交、近交、回交育种、多线育种、品种混合(variety blend)、种间杂交、非整倍体技术等等。杂交技术也包括通过机械的、化学的或生化的方法而造成植物的不育化以获得雄性或雌性不育植株。用一个雄性不育植株与不同品系的花粉进行异花授粉可保证雄性不育但雌性可育的植株的基因组将均一地获得亲本品系双方的性质。根据本发明的转基因植物从而可被用于改良的植物品系的育种，例如增加常规方法如除草剂或杀虫剂处理的功效或由于其修饰的遗传性质而免除所述的方法。作为替代的，可获得具有改良的逆境耐受性的新作物，该作物由于其最优化的遗传“装备”而比那些不能耐受同等不利的发育条件的作物获得更好质量的收获产物。
本发明的另一个目的是提供可用来在想要的生物体中表达目的核苷酸序列的核苷酸序列。这种分子通常指“启动子”。生物体可以是细菌、植物或任何其他目的生物体。
更进一步地，SEQ ID NOs：1到3的公布使得本领域的技术人员可以为聚合酶链式反应设计寡核苷酸，以从包含特征在于SEQ IDNOs：1、2或3中任何连续的15且优选地为20到30或更多碱基对的核苷酸序列的模板中尝试扩增DNA片段。该核苷酸包含代表SEQ IDNOs：1、2或3中15且优选地为20到30或更多碱基对的核苷酸序列。利用至少一个这样的寡核苷酸而进行的聚合酶链式反应和它们的扩增产物组成本发明的另一个实施方案。
序列表中的序列简述
SEQ ID NO：1稻RCI-1基因5’上游序列的部分
SEQ ID NO：2包括推定的TATA盒和推定的起始密码子的部分稻RCI-1基因
SEQ ID NO：3包括部分内含子1、外显子2、内含子2和部分外显子3的稻RCI-1基因的一部分
SEQ ID NO：4稻脂氧化酶RCI-1转运肽的核苷酸序列
SEQ ID NO：5稻脂氧化酶RCI-1cDNA的核苷酸序列
SEQ ID NO：6稻脂氧化酶RCI-1转运肽的氨基酸序列
SEQ ID NO：7稻脂氧化酶RCI-1cDNA的推定的氨基酸序列
SEQ ID NO：8简并引物
SEQ ID NO：9锚式寡脱氧胸苷酸反向引物
SEQ ID NO：10正向引物
SEQ ID NO：11反向引物
SEQ ID NO：12反向引物R1
SEQ ID NO：13正向引物F1
SEQ ID NO：14正向引物F2
SEQ ID NO：15引物attB1
SEQ ID NO：16引物attB2
SEQ ID NO：17来自质粒pBSK+LOX4a的约4.5kb长的PstI/PstI片段的核苷酸序列
SEQ ID NO：18用正向引物F1和反向引物R1经PCR获得的稻RCI-1基因5’上游序列的部分
SEQ ID NO：19用正向引物F2和反向引物R1经PCR获得的稻RCI-1基因5’上游序列的部分
SEQ ID NO：20带有GIG报告基因的GatewayTM修饰的pNOV2347二元GatewayTM目的载体
SEQ ID NO：21 GIG，GUS内含子GUS，具内含子的GUS编码序列
SEQ ID NO：22 pNOV6800二元载体
保藏 保藏的材料 目录号 保藏日期 pBSK+LOX4A DSM 13524 06.06.2000 pNOV6800 NRRL B-30480 May 25，2001
pBSK+LOX4A保藏于Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig，德国。pNOV6800保藏于AgriculturalResearch Service Culture Collection(NRRL)，属于National Centerfor Agricultural Utilization Research，Agricultural Research Service，美国农业部，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604美国。
下面是本发明的说明性的实施例。本发明并不局限于所述的特定实施例的范围内，该实施例只是对发明的单个方面作简单的说明，任何功能上等价的构建体、启动子、转运肽或酶都在本发明的范围之内。
实施例
此处所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并在如Sambrook等人，1989，“Molecular Cloning”，Cold SpringHarbor，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY和Ausubel等人，1994，“Current protocols in molecular biology”，John Wiley和Sons，New York中有描述。
实施例1：植物材料及处理
稻植株(Oryza sativa cv.Kusabue)在16小时光照/8小时黑暗的周期中生长在含有用铁肥料溶液(iron fertilizer solution)浸泡的粘土的罐中，温度25℃，湿度80％。
M.grisea(品种007和031，来自Institute of Biochemistry，Facultyof Agriculture，Tamagawa University，Machida-shi，Tokyo194，日本)被培养在燕麦粗粉淀粉琼脂(oat-meal starch agar)中(30gl-1燕麦片，20gl-1琼脂-琼脂，10gl-1淀粉和2gl-1酵母提取物)。在27℃培育2星期后，用消过毒的抹刀将气生菌丝体去除并更进一步地在黑光下(310-360nm)培育以诱导同步的孢子形成。为了接种应将分生孢子的浓度调节为1×106ml-1的喷雾溶液(1gl-1明胶，0.1％Tween-20)。
在播种后12-14天将植株通过向叶子喷洒分生孢子悬浮液而接种。在黑暗潮湿的室(26℃，约100％相对湿度)内培育24小时后，将植株在如上所述的同样温度和光照模式下保存在潮湿的环境中。
在播种后10天当出现了叶子3时将植株用化学诱导物处理。所有化学药品的浓度均以ppm表示(每升使用的溶液中活性成分的毫克数)。烯丙异噻唑通过如所述的湿透土壤以含250ppm的纯物质的溶液应用(Thieron等人(1995)稻中系统获得性抗性：对在稻中能诱导对Pyricularia oryzae的抗性的不同物质的作用模式研究(Systemicacquired resistance in rice：Studies on the mode of action of diversesubstances inducing resistance in rice to Pyricularia oryzae.)Mededelingen Faculteit Landbouwkundige en Toegepaste BiologischeWetenschappen Universiteit Gent.60：421-430)。BTH(活性成分和可湿的粉末的1∶1(w/w)混和物)和INA的制剂(活性成分和可湿的颗粒的1∶3(w/w)混和物)通过喷洒而应用于叶子上。所有对照是通过应用无活性成分的喷雾溶液而完成的。茉莉酮酸以所述的在乙醇中的1mM溶液而应用(Schweizer等人(1997)Plant Physiol.114，79-88)。伤口及在全身组织中基因表达的测量根据(Schweizer等人(1998)Plant J.14，475-481)而进行。
实施例2：cDNA文库的构建
从用100ppm INA处理过并在24和48小时后收获的稻叶子中抽提了总RNA。如在实施例2中所述的准备聚腺苷酸化RNA，从两个时间点获取同样的量。根据厂商的说明书利用lambda Zap ExpresscDNA Synthesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)来构建cDNA文库。
实施例3：稻脂氧化酶cDNA RCI-1的克隆
A.通过PCR克隆稻脂氧化酶cDNA片段
一种基于PCR的策略被用来从INA-处理的稻叶子中产生脂氧化酶cDNA片段。通过比对两个来自稻(Peng等人(1994)J.Biol.Chem.269，3755-3761；Ohta等人(1992)Eur.J.Biochem.206，331-336)和一个来自小麦(Grlach等人(1996)Plant Cell.8，629-643)的脂氧化酶序列，鉴定了一些保守区，其中一个是靠近C-末端的且含有在所有三个序列中不变的氨基酸序列HAAVNFG。
总RNA是以如所述的方法(Dudler & Hertig(1992)J.Biol.Chem.267，5882-5888)从未处理的对照叶子和用100ppm INA溶液喷洒处理24和48小时后叶子中抽提的。聚腺苷酸化RNA是用来自Stratagene(La Jolla，CA)的快速mRNA分离试剂盒从总RNA中制得的。获取来自两个时间点的聚腺苷酸化mRNA样品，将1μg聚腺苷酸化RNA的等分试样用做RT-PCR的模板，该RT-PCR以对应于稻RLL2脂氧化酶(Peng等人(1994)J.Biol.Chem.269，3755-3761)C-末端区的HAAVNFG氨基酸序列基元的简并寡核苷酸5’-CAYGCNGTNAANTTYGG-3’(SEQ ID NO：8)为正向引物，以锚式寡脱氧胸苷酸为反向引物(5’-AATGCTTTTTTTTTTTTTTTV-3’，SEQ ID NO：9)。
反转录进行如下：
将1μl RNA(1μg/ml)
8μl5×RT-缓冲液
4μl锚式寡脱氧胸苷酸反向引物(100pmol/μl)
4μl dNTP(各10mM)
18μl H2ODEPC
混合并在94℃培育15分钟。随后在42℃培育1小时。在转移到42℃中5分钟后，加入3μl AMV-RT(Boehringer)和2μl RNA酶抑制剂(Boehringer)。反转录通过在75℃中培育5分钟而被终止。
用反转录的RNA所做的PCR进行如下：
将3μl cDNA(见上述)
10μl10×PCR-缓冲液
1μl锚式寡脱氧胸苷酸反向引物(100pmol/μl)
1μl简并引物(100pmol/μl)
2μl dNTP(各10mM)
0.5μl Taq DNA聚合酶(Boehringer)
82.5μl H2O
混合并进行如下程序：
1个循环 94℃/15分钟 39℃/2分钟 72℃/3分钟
35个循环 94℃/30秒 39℃/30秒 72℃/1分钟
1个循环 94℃/1分钟 39℃/2分钟 72℃/10分钟
然后，加入0.5μl新鲜的Taq DNA聚合酶，并在上面给出的条件下再进行20个循环。
将来自处理的和未处理的叶子的PCR产物在溴化乙锭-染色的琼脂糖凝胶上显现。只在INA-处理的样品但不在对照中出现了约600bp长的PCR产物。将只在有INA-处理的样品的泳道中出现的对应于该约600bp条带的胶块切下。随后将DNA从凝胶中洗脱出来并克隆入pGEMTeasy载体(Promega，Madison，美国)中，将所得质粒称为pKL-5。
B.筛选cDNA文库以得到全长的稻脂氧化酶cDNA克隆
将pKL-5的32P-标记的插入片段用做探针以筛选从INA-处理的稻叶构建而来的λcDNA文库(参见实施例2)。将阳性克隆纯化。具有最大插入片段的克隆被称为RCI-1(稻化学诱导性cDNA1)，并根据厂商的说明书通过体内切除而被亚克隆入pBK-CMV(Stratagene)噬菌粒载体中。将所得的质粒称为pRCI-1。通过引物步移法用CY5-标记的引物和ALF DNA-测序仪(Pharmacia，Uppsala，瑞典)对RCI-1插入片段的两条链都测了序。
RCI-1 cDNA插入片段(SEQ ID NO：5)由3018bp组成且含有一编码922个氨基酸残基预测分子量为105kDa的蛋白质(SEQ IDNO：7)的2766bp长的可读框(从SEQ ID NO：5的碱基48到碱基2816)。假定的翻译起始位点是可读框中的第一个甲硫氨酸密码子。序列比较揭示RCI-1蛋白质与大麦LOX2：Hv：1(Vrs等人(1998)Eur.J.Biochem.251，36-44)最相似，在蛋白质水平显示60％的一致性和68％的相似性。与两个已经发表的稻脂氧化酶形式相比，在氨基酸水平上的序列相似性(一致性)分别与L-2(Ohta等人(1992)Eur.J.Biochem.206，331-336)相比为52％(43％)，与RLL2(Peng等人(1994)J.Biol.Chem.269，3755-3761)相比为58％(50％)。
RCI-1稻脂氧化酶具有一个据认为可指导这类蛋白质进入质体，特别是叶绿体的N-末端延长(SEQ ID NO：6，相应于SEQ ID NO：7的氨基酸1到36)。该推定的叶绿体定位序列将这类脂氧化酶(LOX)与另一类主要在种子和幼苗中发现的并且包括来自大麦的LoxA、LoxB和LoxC(van Mechelen等人(1999)Plant.Mol.Biol.39，1283-1298)和来自稻的LOX L-2(Ohta等人(1992)Eur.J.Biochem.206，331-336)的脂氧化酶明显地区分开来。
实施例4：Southern印迹分析
利用CTAB程序从稻叶中抽提了基因组DNA(Ausubel等人，1987，Current protocols in molecular biology，Wiley和Sons，New York)。根据标准程序进行了限制性酶切消化、琼脂糖凝胶电泳分离并转移到GeneScreen膜(Dupont NEN，Brussels，比利时)上。在1M NaCl，1％SDS，10％葡聚糖硫酸酯以及100μgml-1变性的鲑精DNA中于68℃将膜与由包含RCI-1 cDNA的前1280bp的pRCI-1的EcoRI/HindIII片段构成的32P-标记的探针杂交过夜。将膜在0.2×SSC(1×SSC是150mM NaCl；15mM柠檬酸钠)；0.1％SDS中于65℃洗涤。
当分析用许多不在探针序列内切割的酶消化的DNA时，探测到了1到3个杂交到探针上的条带。这暗示除RCI-1外，至少还有一个其他的与探针较弱地交叉杂交的稻基因。
实施例5：RCI-1表达研究
利用RNA凝胶印迹分析研究了各种刺激对RCI-1转录本丰度的影响。为此，如所述的从处理的和未处理的叶子中抽提了总RNA(Dudler.& Hertig.(1992)J.Biol.Chem.267，5882-5888)。为了凝胶印迹分析，在每泳道中加入10μg总RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中分离，转移到GeneScreen膜上并用UV交联剂(Amersham，UK)进行交联。泳道的上样在转移前是用溴化乙锭染色凝胶来监控的。在1MNaCl，1％SDS，10％葡聚糖硫酸酯以及100μgml-1变性的鲑精DNA中于68℃将膜与由包含RCI-1 cDNA的前1280bp的pRCI-1的EcoRI/Hind III片段组成的32P-标记的探针杂交过夜。将膜在0.2×SSC(1×SSC是150mM NaCl；15mM柠檬酸钠)；0.1％SDS中于65℃洗涤。将编码稻核糖体蛋白质L3(RP-L3，目录号D12630)一部分的528bp cDNA用做组成型表达转录本的探针。该片段偶然地被扩增并与部分脂氧化酶克隆pKL-5一起被克隆。对经INA处理的稻叶用RNA凝胶印迹分析进行了时程实验。杂交信号显示为对应于约3200bp长的RNA的明显条带，模糊电泳条带信号为约1200到1700bp长。将同一张膜剥离并通过用一个组成型表达基因(RP-L3)重新探查，证实了RNA制剂的高质量。模糊电泳条带信号从而显示RCI-1转录本特别不稳定，可能是由于高的转换率。时程实验揭示RCI-1转录本在处理后8小时开始集聚，在24到48小时后达到最高水平。相似地，用抗性激活剂BTH(即一种INA的功能性类似物)处理如同应用代表了抗性诱导化学药品的不同类的烯丙异噻唑(商品名为oryzemate)一样也诱导了RCI-1转录本的集聚(Kessmann等人(1994)Ann.Rev.Phytopathol.32，439-459)。响应烯丙异噻唑处理的RCI-1 mRNA的集聚的时间延迟反映了应用的不同模式(即在INA和BTH的情况下喷洒到叶子上，而在烯丙异噻唑的情况下则是浸湿土壤)，而不是反映信号的差异。从而，RCI-1转录本在应用许多不同的化学抗性诱导物时集聚。相反，RCI-1 mRNA水平既不在接种了非宿主病原体丁香假单孢菌丁香致病变种(一种对稻瘟病抗性的生物诱导物)后增加(Smith和Métraux(1991)Physiol. Mol. Plant Pathol.39，451-461)，也不在被M.grisea(稻瘟病的致病介质)感染后增加。
更进一步地，RCI-1转录本的水平在用1mM茉莉酮酸(JA)溶液喷洒在稻叶上后7到12小时有极大的增加。有趣的是，已知可以增加稻中JA的内源水平并诱导对稻瘟病感染增加的系统性保护的伤口(Schweizer等人(1998)Plant J.14，475-481；Schweizer等人(1997)Plant Physiol.114，79-88)既不局部地也不系统地激活RCI-1转录。为研究用化学诱导物处理后观察到的RCI-1转录本的增加是否与在稻叶中脂氧化酶(LOX)的酶活性的增加相关，最后在所显示的也用于RNA凝胶印迹分析(见上文)的BTH处理的稻叶中测量LOX活性。与RNA凝胶印迹分析的结果相一致，酶活性的极大增加在用BTH处理后24和48小时之间观察到了。此外，足够触发RCI-1转录本集聚的BTH剂量也导致了LOX酶活性的增加。两个结果都与酶活性的增加主要是由于RCI-1(和同源的)基因的激活的假设一致。为了更进一步分析该假设，将来自BTH-处理的稻植株的RNA用相应于病原体-诱导的基因(RLL2；Peng等人(1994)J.Biol.Chem.269，3755-3761)和在幼苗中表达的基因(L-2；Ohta等人(1992)Eur.J.Biochem.206，331-336)的其它稻LOX cDNA进行探查。与RCI-1 mRNA相反，RLL2和L-2转录本在用INA、BTH和烯丙异噻唑处理后不集聚。
实施例6：RCI-1在大肠杆菌中的表达
将RCI-1编码区置于大肠杆菌表达载体中IPTG-诱导性启动子的控制之下。更特别的，将RCI-1 cDNA克隆到pDS56/RBS II，SphI表达载体中(Stüber等人(1990)大肠杆菌中重组蛋白质的高水平生产和快速纯化系统：在表位作图、抗体制备和结构功能分析中的应用(System for high-leVel production in Escherichia coli and rapidpurification of recombinant proteins：Applications to epitope mapping，preparation of antibodies，and structure-function analysis.)《Immunological Methods》(Levkovits，I.& Pernis，B.，eds)pp.121-152.Academic Press，New York)，通过Pstl酶消化并在用T4 DNA聚合酶将粘性末端变齐后重新连接而从该载体中去除单一的Pstl位点。将新的载体称为pDS56/RBS II，SphI(-PstI)。通过用正向引物5’-GTCAGCATGCTCACGGCCAC-3’(SEO ID NO：10；SphI位点是有下划线的；翻译起始密码子以斜体形式给出)和反向引物5’-CATTGACGACCTCCGACAAG-3’(SEQ ID NO：11)进行PCR扩增了一段146bp长的RCI-1片段，从而在RCI-1 cDNA的翻译起始位点处引入了一个SphI位点，其中反向引物与内部XhoI位点(SEQ IDNO：5的核苷酸位置149)下游序列退火。将扩增的片段用SphI和XhoI酶切割并与2.3kb含有RCI-1 cDNA中间部分(SEQ ID NO：5的核苷酸位置149-2468)的XhoI/BamHI片段一起在一个反应中连接入已经用SphI和BamHI消化了的pDS56/RBS II，SphI(-PstI)中。所得的载体(pExpr1)用限制性分析进行检查。然后将pExpr1用PstI(位于cDNA插入片段上链(top strand)的891位置，对应于SEQ ID NO：5的碱基891)和SalI(位于插入序列下游的pDS56/RBS II，SphI(-PstI)的多克隆位点)进行切割，将结果所得的cDNA片段用相应的pRCI-1的PstI/XhoI片段(XhoI在cDNA插入序列下游的多克隆位点切割)进行替换。结果所得的含有在IPTG-诱导性启动子的控制之下的全长RCI-1编码区的构建体(pExprRCI-1)随后被转化入M15大肠杆菌细胞中(Stüber等人(1990)大肠杆菌中重组蛋白质的高水平生产和快速纯化系统：在表位作图、抗体制备和结构功能分析中的应用(System forhigh-level production in Escherichia coli and rapid purification ofrecombinant proteins：Applications to epitope mapping，preparationof antibodies，and structure-function analysis.)《ImmunologicalMethods》(Levkovits，I.& Pernis，B.，eds)pp.121-152.AcademicPress，New York)。
重组体RCI-1蛋白质的制造是通过向生长到OD600为1的250ml大肠杆菌M15培养物中加入1mM IPTG(终浓度)并在摇床中于19℃进一步培育过夜而被诱导的。将细胞通过离心(5000g，10分钟)收获并重悬在5ml溶菌缓冲液中(含有1mg l-1溶菌酶的50mM钠-磷酸盐缓冲液，pH7.5)。在冰浴30分钟后，离心溶解产物(12000g，15分钟)，将沉淀转移到研钵中在抽提缓冲液中(0.1M钾-磷酸盐缓冲液pH7，30mg聚乙烯聚吡咯烷酮，1mM EDTA)研磨。离心后，将清澈的上清液用作一种酶制剂以备更进一步的生化分析。
对用该构建体转化的大肠杆菌抽提物的SDS-PAGE分析揭示了一种分子量约为103kDa的被LOX特异性抗体在western-印迹中识别的新的蛋白质。该大小与预期的105kDa的值相一致(见实施例3)。
实施例7：RCI-1脂氧化酶活性的生化分析
脂氧化酶活性是用作为底物的亚油酸和来自重组体RCI-1酶抽提物的5-20μl在30℃于234nm以分光光度法测量的(Bohland等人(1997)Plant Physiol.114，679-685)。为了确定最适的pH值，使用了pH范围交迭的不同缓冲液(pH4-6：0.1M乙酸钠；pH6-8：0.1M钠-磷酸盐；pH8-10：0.1M Tris-HCl)。将反应产物的摩尔消光系数2.5×107cm-1 mol-1用来计算酶活性。
这些细菌的粗抽提物以亚油酸为底物显示了增加的LOX活性，而对照的没有表达构建体或含有空载体的大肠杆菌抽提物则没有可探测到的LOX活性。在pH8到9左右观察到了最高的活性，显示RCI-1必须被归为1型LOX(Siedow(1991)Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42，145-188)。然而，应该注意到目前引入了第二个基于质体转运肽存在与否的分类方法(Shibata等人(1994)Plant.Mol.Biol.Rep.12，41-42)。根据这个方案，RCI-1必须被归为2型LOX。
用HPLC对RCI-1蛋白质的具酶活性的产物进行了分析(Bohland等人(1997)Plant Physiol.114，679-685)。将从重组体RCI-1蛋白质中获得的约0.2nkat的酶活性与50μl底物溶液(亚油酸或α-亚麻酸各10μl；20μl乙醇，20μl水)在2ml 0.1M Tris-HCl(pH8.8)中于30℃培育20分钟。该反应通过用稀释的HCl使pH降低到3.0而终止，将氢过氧化物用1ml CHCl3抽提随后用水洗涤两次。将反应产物进行HPLC-分析(4-μm颗粒大小，Suprasphere-Si，4.6×125mm，Merk，Darmstadt，德国)。等度洗脱是用己烷∶2-丙醇∶乙腈∶乙酸(98.3∶1.5∶0.1∶0.1，v/v/v/v)以流速1ml min-1进行的。在234nm处探测到了产物，标准物是从Biomol(Hamburg，德国)获得的或以所述的方法分别将亚油酸或α-亚麻酸与大豆脂氧化酶培育而制得(Bohland等人(1997)Plant Physiol.114，679-685)。
当重组体RCI-1的反应产物用HPLC进行分析时，不论是用亚油酸还是用亚麻酸作为酶的底物，(13S)-氢过氧-(9Z，11E，15Z)-十八烯三酸(13-HPOD)都是主要产物。只探测到了较小量的(9S)-氢过氧-(10E，12Z，15Z)-十八烯三酸(9-HPOD)
实施例8：RCI-1转运肽∷GFP报告基因的构建和转化
构建了一个编码含有RCI-1蛋白质(SEQ ID NO：6)的N-末端37个氨基酸和随后来自克隆程序的4个氨基酸以及随后的GFP序列的融合蛋白质的嵌合基因。最终，将pRCI-1(参见实施例3B)用XhoI酶进行消化并且重新连接，该酶在cDNA插入片段的位置149(对应于SEQ ID NO：5的碱基149)之后和在插入片段下游的多克隆位点中切割上链。结果所得的质粒包含RCI-1 cDNA的前158bp，因为在克隆位点下游的载体核苷酸序列与SEQ ID NO：5的碱基150到碱基158相同。将该质粒称为pRCI158。其包含转运肽cDNA(SEQ ID NO：4)的插入片段用也在多克隆位点切割的EcoRI和XbaI切出，将粘性末端通过Klenow酶填充以变平。将平端片段克隆入含有mGFP-5编码区(MRC Laboratory of Molecular Biology，Cambridge，英国)的二元pCambia 1302载体(Cambia，Canberra，澳大利亚)的补平的且去磷酸化的SpeI克隆位点。插入片段的正确方向是通过限制性消化来检查的，最终的构建体通过测序而证实。将该构建体称为pRCI转运肽∷GFP并通过三亲交配而转化入根癌农杆菌品系LBA 4404中。对拟南芥叶细胞的转化是根据Kapila等人(1997)(Plant Sci.122，101-108)通过使农杆菌渗入到发芽后14天的鼠耳芥生态型Wassiljewskija(Ws)的完整叶子中而完成的。融合蛋白质的表达可以在转化2天后用Leica-TCS共焦激光扫描显微镜和PLAPO×100油浸物镜(Leica Microsystems，Heidelberg，德国)通过共焦成像来监控，滤器设置如下：激发波长476/488nm；GFP-发射波长515-552nm，叶绿素-发射波长673-695nm。利用独立的2-通道-探测来同时记录GFP荧光和叶绿素自身荧光。
对来自表达pRCI转运肽∷GFP构建体的转基因拟南芥植株的叶子所做的共焦成像揭示GFP荧光和叶绿素自身荧光有严格的一致性，显示融合蛋白质是位于叶绿体中的。
实施例9：RCI-1启动子区的克隆
A.筛选一个稻λ-DASH基因组DNA文库
根据Stratagene(La Jolla，美国)的方案构建了代表稻(Oryzasativa cv.Norin)植株的基因组的λ-DASH II/BamHI DNA文库。该文库的效价被确定为2.12×1010pfu/ml。文库的筛选是根据Stratagene的方案来操作的。将该文库置于4个530cm2的含有NZY琼脂的生物分析皿(Nalge Nunc Int.，Naperville，美国)中。将密度调整到150’000pfu/平板，并且根据Stratagene的方案用大肠杆菌XL1-blue MRA(Srtatagene，La Jolla，美国)作为宿主品系来完成平板培养。将噬斑转移到尼龙膜(HybondTM N 0.45μm，Amersham，Uppsala，瑞典)上，将DNA在UV交联剂(Amersham，Uppsala，瑞典)中交联。将代表了稻RCI-1脂氧化酶cDNA克隆pRCI-1(SEQ ID NO：5)的5’末端的900bp的PstI片段用32P标记并根据标准程序(Maniatis等人，1982)与噬斑挑取物(lift)在65℃杂交过夜。额外两轮的筛选得到了一个阳性λ-克隆(λLOX4)。
B.推定的LOX启动子区的亚克隆
λ-克隆的液体溶解产物的DNA制备物根据标准程序制备，并用限制性酶PstI消化和0.6％(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行分析。Southern印迹和随后的膜与RCI-1 cDNA的900bp的PstI片段的杂交是根据标准程序进行的。探测到了相应于λLOX4的4.5kb片段的强条带。将该4.5kb的DNA片段亚克隆入pBluescript/SK+载体(Stratagene，La Jolla，美国)中。大肠杆菌株系DH5α细胞的转化是根据标准程序进行的，转化体是在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂上选择的。结果所得的克隆被称为pBSK+LOX4A。克隆pBSK+LOX4A由DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)以目录号DSM 13524于2000年6月6日保存。克隆pBSK+LOX4A含有位于4.5kb的PstI/PstI片段上的RCI-1脂氧化酶启动子，并更进一步地通过DNA测序进行分析。克隆pBSK+LOX4A以从5’到3’的方向包含SEQ ID NO：1，2和3描述的核苷酸序列。SEQ ID NO：1包含4.5kb的PstI/PstI片段的5’末端。该核苷酸序列长度为358核苷酸并在其5’末端位置1到6包含有PstI位点。4.5kb的PstI/PstI片段的位于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间的区域长度在约240到约440bp之间。4.5kb的PstI/PstI片段的中央区域显示于SEQ ID NO：2，长度为2104bp。它含有推定的TATA盒(SEQID NO：2中位置1261到1266)，推定的起始密码子(SEQ ID NO：2中位置1359到1361)，以及5’非翻译区和推定的TATA盒上游的核苷酸序列。对基因组DNA(SEQ ID NO：2)和cDNA(SEQ ID NO：5)所作的比较显示位于SEQ ID NO：2中位置1312到1701的序列包含外显子1的全长或部分，位于SEQ ID NO：2中位置1702到2104的序列为内含子1的5’部分。在4.5kb PstI/PstI片段中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3之间的区域长度约在85和285bp之间。4.5kb PstI/PstI片段的3’末端如SEQ ID NO：3所示。该序列描述了长度为1516bp的核苷酸序列。它从5’到3’的方向包含内含子1的3’末端(SEQ IDNO：3中位置1到97)，随后是外显子2(SEQ ID NO：3中位置98到366)，内含子2(SEQ ID NO：3中位置367到1283)和外显子3(SEQ ID NO：3中位置1284到1516)的一部分。PstI位点位于位置1511到1516。
实施例10：克隆pBSK+LOX4A的质粒扩增和DNA测序
将转化体于37℃生长在50ml过夜的含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上。收获细胞，用Jetstar Midi质粒抽提试剂盒(GenomedGmbH，Bad Oeynhausen，德国)来抽提质粒DNA。克隆pBSK+LOX4A的测序是用链终止法完成的(Maniatis等人(1982)Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor)。测序反应是根据厂商的说明书用BigDyeTMterminator cycle sequencing kit(Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，Connecticut)进行的，序列由373 DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，California)来确定的。将序列用Wisconsin SequenceAnalysis package(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)进行装配和分析。通过与相应的电泳图进行比较而澄清不明确的地方。SEQ ID NO：1相应于pBSK+LOX4A的4.5kb插入片段的5’端，SEQID NO：2相应于其中间部分，SEQ ID NO：3相应于其3’端。
实施例11：CaMV 35S启动子∷RCI-1 cDNA构建体的制备
起始质粒是含有在CaMV 35S启动子控制下的GUS报告基因的植物二元载体pBI 121(Clontech，Palo Alto，Califorina)。将GUS报告基因从pBI 121中去除并用RCI-1 cDNA替代。最终，用限制性酶SstI消化pBI 121，并根据标准程序用dNTPs和T4 DNA聚合酶将粘性末端补平。在用SmaI切割后，将载体通过琼脂糖凝胶电泳与GUS报告基因分离并重新连接。将该载体命名为pBI 121(-GUS)。将pBI121(-GUS)用Bam HI切割，粘性末端通过用dNTPs和T4 DNA聚合酶填充而变平，并将RCI-1 cDNA片段在被用EcoRI和XbaI从pRCI-1中切下且其粘性末端用dNTPs和T4 DNA聚合酶变平后连接到该载体上。当转化入大肠杆菌后，从许多菌落中制得质粒。RCI-1片段的方向通过用在紧靠插入片段的上游处切割的XbaI和在核苷酸2688之后切割RCI-1 cDNA的上链的Bam HI限制性酶切进行检查。正确的方向结果得到一个长度约2700bp的片段，而错误方向得到长度约350bp的片段。于是含有正确方向的RCI-1 cDNA的质粒(即补平的EcoRI位点靠近CaMV 35S启动子)被选择出来并命名为p35S启动子∷RCI-1 cDNA。对于农杆菌介导的转化，将质粒用电穿孔法转化入根癌农杆菌菌株LBA 4404中。
实施例12：稻的转化
使转化的根癌农杆菌菌株在补充了30mg/L的潮霉素B和3mg/L的四环素的AB液体培养基上生长3天，并将其与在含有2mg/L 2，5-D的N6培养基(Chu，C.C.等人，Sci，Sin.，18，659-668(1975))上从成熟种子的盾片诱导的三星期长时间的愈伤组织一起于25℃在黑暗中在补充了1mM甜菜碱的2N6-As培养基(Hiei，Y等人，Plant J.，6，271-282(1994)上培养2-3天。将共同培养的愈伤组织用含有100mg/L的氨噻肟头孢霉素的灭过菌的水洗涤，并再次在含有40mg/L的潮霉素和250mg/L的氨噻肟头孢霉素的N6培养基上培育3星期。将活跃生长的抗潮霉素的愈伤组织转移到选择培养基上[例如，MS培养基(Life Technologies)+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+2mg/L细胞分裂素+2％山梨糖醇+1.6％phytagar(Gibco)+50mg/L潮霉素B+250mg/L的氨噻肟头孢霉素]，然后在40μmol m-2s-1的连续光照条件下培养2-3星期。将这样得到的小植物装入罐中并在10小时光照/14小时黑暗的条件下生长在生长室内以获得转基因稻植株。
实施例13：玉米的转化
I型胚性发生玉米愈伤组织培养物(Green等人，Miami WinterSymposium 20，1983)是从来自温室生长的材料的长度为1.5-2.5mm未成熟的胚起始的。胚是在无菌条件下从授粉后约14天的表面灭菌了的穗上切除下来的。可将胚置于含2％蔗糖和5mg/L灭草平的D愈伤组织起始培养基上(Duncan等人，Planta 165：322-332，1985)或含3％蔗糖和0.75mg/L 2，4-d的KM愈伤组织起始培养基上(Kao和Michayluk，Planta 126：105-110，1975)。随后使胚和胚性发生培养物培养在黑暗中。在～14天之后将应激胚(embryogenic responses)从外植体中去除。将来自D愈伤组织起始培养基的应激胚置于含2％蔗糖和0.5mg/L 2，4-d的D愈伤组织维持培养基中，而将来自KM愈伤组织起始培养基的置于含2％蔗糖和5mg/L麦草畏的KM愈伤组织维持培养基中。经过在3到8个星期中每星期选择性地在新鲜的维持培养基中传代培养，建立了高质量且致密的胚性发生培养物。活跃生长的胚性发生愈伤组织被选择用作基因传送的目标组织。在基因传送前约4小时将愈伤组织放置在含12％蔗糖的维持培养基的目标平板上。愈伤组织以圆圈方式放置，半径为自目标平板的中心起8和10mm。
如在DuPont Biolistics手册所描述的，将包含启动子-RCI-1-cDNA构建体或RCI-1-启动子-报告基因构建体的质粒DNA沉淀在金微载体上。在每个用于6次发射的微载体制剂中用到了2到3μg的每一种质粒。基因是使用PDS-1000He Biolistics设备传送到目标组织细胞的。Biolistics设备的设置如下：在可裂膜(rupture disc)和巨载体之间8mm，在巨载体和阻止屏之间10mm，在阻止屏和目标之间7cm。每一个目标平板被用650psi的可裂膜射击两次。在阻止屏和目标组织之间放置了200×200的不锈钢网(McMaster-Carr，New Brunswick，NJ)。
在基因传送7天以后，将目标组织片从高渗透性的培养基转移到选择性培养基。对使用BAR基因的选择而言，将目标组织置于含有100mg/L草铵膦(Basta)或20mg/L双丙氨酰膦(Herbiace)的维持培养基上。将所有氨基酸从选择性培养基上去除掉。在这些高水平的选择性培养基上5到8星期后，所有生长的愈伤组织都被传代培养到含3-20mg/L Basta的培养基上。
对使用甘露糖磷酸异构酶基因的选择而言，将目标组织置于各自不含蔗糖而含1％甘露糖的维持培养基中。不去除这些培养基中的氨基酸。5到8星期后，或者将生长的愈伤组织传代培养到不含蔗糖而含1.5％甘露糖的D愈伤组织维持培养基或者传代培养到含1％蔗糖和0.5％甘露糖的KM愈伤组织维持培养基中。在选择性培养基中生长的胚性发生愈伤组织在4到8星期中每2个星期被传代一次直到制造出足够的愈伤组织以产生10-20植株。将从一个最初的目标组织片经过选择而存活的组织以单一群体传代并称作独立转化事件。
在这点上，将在Basta上选择的群体转移到含有3％蔗糖(MSS)而无选择试剂的修饰的MS培养基上(Murashige和Skoog，Physiol.Plant，15：473-497，1962)并置于光照中。将0.25mg/L的三环苯嘧醇和0.5mg/L细胞分裂素二者加入到该培养基中以诱导胚萌发，或者加入2mg/L的苄基腺嘌呤。将用甘露糖选择的群体转移到含有2％蔗糖和1％甘露糖(MS2S+1M)且具有上述的三环苯嘧醇和细胞分裂素添加物的修饰的MS培养基或含有2％蔗糖和0.5％甘露糖(MS2S+0.5M)且具有上述的苄基腺嘌呤添加物的修饰的MS培养基中。从Basta选择再生的群体在2星期后被转移到无三环苯嘧醇和细胞分裂素或苄基腺嘌呤的MS3S培养基中。从甘露糖选择再生的群体则在2星期后被分别转移到无激素的MS2S+1M和MS2S+0.5M培养基中。来自所有群体的具根或不具根的再生苗均被转移到含有MS3S培养基的Magenta箱中，具有根的小植株最终痊愈并被转移到温室的土壤上。
利用一个修饰的48-孔的氯酚红试验来检验植物PMI基因的表达，其中的培养基不含蔗糖而含0.5％的甘露糖。将叶子样品(～5mm×5mm)于黑暗中在该检验培养基中放置生长～72小时。如果植株表达PMI基因，那么它将可以代谢甘露糖并且培养基将变黄。如果不表达，那么培养基将保持红色。
也利用标准的培养技术用来自未成熟的合子胚的I型愈伤组织创造了转化事件。为了传送基因，在基因传送前1到2天通过传代到新鲜培养基中、选择目标组织片并将它们以离开目标平板中心10mm的环状放置于含有12％蔗糖的培养基中而制备了大约300mg的I型愈伤组织。在大约4小时后，用来自DuPont的PDS-1000/He Biolistic设备轰击该组织。将要转化的质粒用DuPont的标准方案沉淀到1μm的金颗粒上。用对每一个目标平板以650psi进行两次轰击来传送基因。在基因传送后大约16小时，将愈伤组织转移到含有2％的蔗糖而无选择试剂的标准培养基中。在基因传送后12或13天，将目标组织片转移到含有40mg/l膦丝菌素作为Basta或双丙氨酰膦的选择性培养基中。在选择中将愈伤组织传代培养12到16星期，之后存活并生长的愈伤组织被转移到含有3mg/l膦丝菌素作为Basta的再生培养基中以生产植株。
实施例14：大豆的转化
大豆(Glycine max)的原生质体是通过如Tricoli等人，1986(PlantCell Rep.5：334-337)，或Chowhury和Widholm，1985(Plant Cell Rep.4：289-292)，或Klein等人，1981(Planta 152：105-114)所述的方法而制备的。将原生质体悬浮液以1ml的等分分配到塑料的一次性的小杯中。为了转化，将10μg DNA加入到10μl消过毒的蒸馏水中并以Paszkowski等人，1984(EMBO J.3：：2717-2722)所述的方法进行消毒。将溶液轻轻混合，然后使其在室温(24到28℃)遭受来自使用471电极集合的BTX-Transfector300电穿孔仪器的具有10ms指数式衰减常数的400Vcm-1的脉冲。
以如下一个或多个修饰而重复上述过程：
(1)所使用的电压是200Vcm-1，或在100Vcm-1和800Vcm-1之间
(2)指数式衰减常数是5ms、15ms或20ms
(3)将在25μl无菌水中的50μg剪切的小牛胸腺DNA与质粒DNA一起加入
(4)将质粒DNA在使用前用合适的限制性酶(例如BamHI)处理而成为线状
将原生质体以如Klein等人，1981(Planta 152：105-114)，或Chowhury和Widholm，1985(Plant Cell Rep.4：289-292)，或Tricoli等人，1986(Plant Cell Rep.5：334-337)所述的方法培养，不加入藻酸盐以不使培养基固化。
实施例15：棉花的转化
将含有用标准方法构建的用于转化的二元载体的农杆菌株系在谷氨酸盐培养基中培养18到24小时(在它们在不含抗生素的相同培养基中稀释到OD600值为0.2之前)，其中该谷氨酸盐培养基的pH值被调节为5.6，并补充了0.15％的甘露醇、50μg/ml的卡那霉素、50μg/ml的壮观霉素和1mg/ml的链霉素。然后使细菌在被稀释到OD600值为0.2到0.4之前生长3到5小时，并用于对从表面灭菌的棉花种子剪来的盘板(disc)进行接种。
将棉花种子在10％的chlorox中浸泡20分钟并用无菌水漂洗。使种子在黑暗中在0.7％水琼脂上发芽。在将细菌接种到子叶表面之前使幼苗生长一星期。
接种后的子叶在被切割并置于含有MS盐、3％蔗糖、100μg/ml的羧苄青霉素和100μg/ml的mefoxim的0.7％琼脂上之前允许形成愈伤组织。每3个星期将愈伤组织转移到新鲜培养基上直到获得4平板的足够的量。从致病性强的农杆菌株系而来的半数愈伤组织被转移到不含激素而含50μg/ml的卡那霉素的培养基中。
实施例16：黄色曲霉(Aspergillus flavus)/黄曲霉毒素疾病检验
接种物的生产和接种方案：
接种物是来自四种高度强致病性的黄色曲霉分离物的分生孢子的等量混合物。使每一种分离物在28℃以12小时光照在培养皿中的马铃薯葡萄糖琼脂上单独培养12到16天。将包括培养基在内的培养物与蒸馏水混和并经过双层粗滤布过滤。分生孢子的浓度用血细胞计数器来估计并用蒸馏水来调节。每100ml加入两滴Tween 20作为表面活性剂。分生孢子悬浮液是在使用前即时配置的并在从实验室到田间的运输中被保存在冰上。
每一植株的初级穗是在中穗丝生长期(midsilk growth stage)(50％的穗出现穗丝)使用pin-board接种器用1×106分生孢子/ml的孢子悬浮液接种20-24天的[Plant Disease(1994)78：778-781]。
穗腐病级别和黄曲霉毒素分析：
在接种后40到45天，将穗剥去外壳并对每一接种的穗制做了1到9(1＝无疾病，9＝90-100％受感染)的可视疾病严重程度的级别，并对每一块样地进行平均。
如果必要，通过强迫通风使穗干燥并使其去壳。将每一块样地的谷粒集中起来，取分样作真菌毒素分析。
将分样样品用Romer Mill(Model 2A)磨碎并用标准AOAC方法以薄层层析分析总的黄曲霉毒素。
实施例17：含有有效地连接到GUS或GFP报告基因上的5’-启动子片段的植物转化载体的构建
为了生产启动子∷报告基因融合物，使用pBSK+LOX4A(参见实施例9)作为聚合酶链式反应(PCR)的模板。用基因特异性的引物来扩增基因的5’启动子区。使用反向引物R1(SEQ ID NO：12)与正向引物F1(SEQ ID NO：13)和F2(SEQ ID NO：14)的组合分离了在起始甲硫氨酸上游的～1.2kb和～2kb长的调节序列。用正向引物F1和反向引物R1扩增的PCR片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示，用正向引物F2和反向引物R1扩增的PCR片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。为了易于克隆，引物由基因特异性序列和GATEWAYTM克隆技术(Life Technologies，Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，美国)中的attB重组位点组成。至于反向引物，则使用了引物R1，具有如下序列：5’-CAAGAAAGCTGGGTTGACAAATTAAGTTGTCAGTGTG-3’(SEQ ID NO：12)。反向引物R1的基因特异性序列用下划线表示(相应于SEQ ID NO：2的位置1356到1334)，attB重组序列以斜体表示。正向引物是引物F1和F2。正向引物F1具有如下序列：5’-CAAAAAAGCAGGCTTGTAACATCCTACTCCTATTGTG-3’(SEQID NO：13)。正向引物F1的基因特异性序列用下划线表示(相应于SEQ ID NO：2的碱基159到181)，attB重组序列以斜体表示。F1与R1组合扩增了一个～1.2kb长的片段。正向引物F2具有如下序列：5’-CAAAAAAGCAGGCTCCCCGTCTTTATCTACTC-3’(SEO ID NO：14)。正向引物F2的基因特异性序列用下划线表示(相应于SEQ IDNO：1的碱基31到48)，attB重组序列以斜体表示。引物F2与引物R1组合扩增了一个～2kb长的片段。
采用嵌套式PCR策略先用引物F1+R1或F2+R1随后以引物attB1(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’，SEQ IDNO：15)和引物attB2(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’，SEQ ID NO：16)进行二次PCR扩增了调节序列。对于基因特异性引物F1+R1或F2+R1使用了如下的PCR条件：((94℃：15分钟)：(94℃：10秒/53℃：10秒/72℃：1分钟)×15：(72℃：2分钟))。PCR后将产物用attB1+attB2引物进行二次PCR扩增。在随后的PCR扩增中，使用了如下PCR条件：((94℃：15秒)：(94℃：15秒/68℃：2分钟，15秒)×25：(68℃：3分钟)。于是结果所得的PCR产物在侧翼与attB重组位点相接，并被用来根据厂商的方案通过BP反应在pDONR201中产生进入克隆(参见：GATEWAYTM cloning Technology的说明书手册，GIBCO BRL，Rockville，MD，美国，http：//www.lifetech.com/)。结果所得质粒含有RCI-1起始密码子5’的～1.2kb和～2kb并被称为pENTR+LOXp1.2，pENTR+LOXp2。
1.生产的进入载体构建体
● pENTR+LOXp1.2(pDONR201+在侧翼与attB重组序列相接的1.2kb启动子片段)
● pENTR+LOXp2(pDONR201+在侧翼与attB重组序列相接的2kb启动子片段)
这些进入载体是用来构建用于玉米或稻转化的二元启动子∷报告基因质粒的。根据在说明书手册中描述的厂商的方案(GATEWAYTMCloning Technology，GIBCO BRL，Rockville，MD，http：//www.lifetech.com/)用GATEWAYTM技术通过重组将调节/启动子序列融合到GUS报告基因(Jefferson等人，1987，EMBO J 6：3901-3907)或GFP中。简要地，根据此方案通过LR反应将进入载体中的启动子片段与含有GUS(具有内含子)编码区或GFP的二元农杆菌目的载体重组，该载体在GUS或GFP报告基因的5’具有attR位点(分别为pNOV2347或pNOV2361)。插入片段的方向通过att序列来维持，而最终构建体通过测序来核实。然后将构建体通过电穿孔转化入根癌农杆菌株系中。
pNOV2347和pNOV2361是二元载体，具有VS1复制起点、主链中的农杆菌virG基因拷贝和在T-DNA左右边缘之间的玉米泛素启动子-PMI基因-nos终止子表达盒。PMI(磷酸甘露糖异构酶)是大肠杆菌manA基因的编码区(Joersbo和Okkels，1996，Plant Cell Reports16：219-221；Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports 19：798-803)。nos(胭脂碱合酶)终止子是从根癌农杆菌T-DNA中获得的(Depicker等人，1982，J.Mol.APPl.Genet.1(6)，561-573)。玉米泛素启动子、磷酸甘露糖异构酶编码序列和nos终止子分别位于pNOV2347(SEQID NO：20)的nt 4114到nt 5114，nt 6192到nt 7295和nt 7356到7604。pNOV2361除了具有GFP代替GUS报告基因外与pNOV2347是同样的。报告基因-启动子盒是插入在右边缘最近处的。二元载体中选择标记表达盒是最靠近左边缘的。载体含有GATEWAYTM重组成分，后者是用GATEWAYTM Vector Conversion System通过连接含有attR位点的平末端盒、ccdB和氯霉素抗性标记而引入到二元载体主链的。GATEWAYTM盒位于pNOV2347的nt 2351和4050(补充的)之间和pNOV2361的nt 9201和10910之间。通过LR重组反应(LifeTechnology，www.lifetech.com)使启动子盒插入，由此pNOV2347位于nt 2351和nt 4050之间的DNA序列被去除并用在侧翼与att序列相接的LOX启动子片段替换。重组导致了融合到GFP或具有内含子的GUS报告基因(GIG)序列的启动子序列。GIG基因含有来自Solanum tuberosum的位于GUS(SEQ ID NO：21)的nt 385到nt 576的ST-LS1内含子(从Purdue University的Stanton Gelvin博士处获得，描述在Narasimhulu等人，1996，Plant Cell，8：873-886)。如下所示的为二元载体构建体中选择性标记和启动子-报告基因盒的方向。
2.生产的用于稳定转化的构建体
● pNOV6800(RB nos+GIG基因+LOX 1.2启动子片段-ZmUbi+PMI基因+nos LB)
● pNOV6801(RB LOX 1.2 启动子片段+GFP基因+nos-ZmUbi+PMI基因+nos LB)
pNOV6800的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示。pNOV6800与pNOV6801只在位于二元载体的左右边缘之间的表达盒上有差异。
3.用于比较的构建体
● pNOV2110(RB ZmUbi启动子+GFP基因+nos-ZmUbi+PMI基因+nos LB)
● pNOV3640(RB nos-GIG-ZmUbi启动子nos-AtPPOdm-ZmUbi启动子LB)
GUS-内含子-GUS、GFP和polyA片段与那些用于上述LOX启动子构建体的相同。ZmUbi启动子相应于pNOV2110的碱基12到碱基2009的片段且含有玉米泛素基因的启动子、外显子1和内含子1。AtPPOdm序列编码原卟啉原(protophorinogen)氧化酶蛋白质的一种突变型，该酶赋予对通常使酶失活的除草剂(PPO抑制剂)的抗性(美国专利申请号：5,939,602)。
实施例18：农杆菌介导的玉米的转化
未成熟玉米胚的转化基本上是依如在Negrotto等人，(2000)PlantCell Reports 19：798-803中所述的方法进行的。对本实施例而言，所有培养基成分都如上面的Negrotto等人所述。然而，在文献中描述的各种培养基成分都可以被替代。
1.转化质粒和选择性标记
如实施例17所述，将用作转化的基因克隆入适合于玉米转化的载体中。所用的载体含有磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因(Negrotto等人，(2000)Plant Cell Reports 19：798-803)作为选择性标记。
2.根癌农杆菌的制备
使含有植物转化质粒的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)在YEP(酵母提取物(5g/L)，蛋白胨(10g/L)，NaCl(5g/L)，15g/l琼脂，pH6.8)固体培养基中于28℃生长2到4天。将大约0.8×109的农杆菌悬浮在补充了100μM乙酰丁香酮(As)的LS-inf培养基(LSAs培养基)中(Negrotto等人，(2000)Plant Cell Rep19：798-803)。使细菌在此培养基中前诱导30-60分钟。
3.接种
将来自A188或其他合适的玉米基因型的未成熟胚从8-12天的穗上切下并置于液体LS-inf+100μM As(LSAs)中。胚用新鲜的感染培养基漂洗一次。然后加入农杆菌溶液，涡旋振荡胚30秒，使其与细菌共处5分钟。然后将胚使其盾片朝上转移至LSAs培养基并在黑暗中培养2到3天。随后，将每培养板20到25个胚转移到补充了氨噻肟头孢霉素(250mg/l)和硝酸银(1.6mg/l)(Negrotto等人，2000)的LSDc培养基中并在黑暗中于28℃培养10天。
4.转化的细胞的选择和转化的植株的再生
将生产胚性发生愈伤组织的未成熟胚转移到LSD1M0.5S培养基中(LSDs含0.5mg/l的2，4-D替代麦草畏、10g/l甘露糖、5g/l蔗糖且不含硝酸银)。将培养物在该培养基中选择6星期，每3星期传代一次。存活的愈伤组织或者被转移到LSD1M0.5S培养基中以大批培养或者被转移到Reg1培养基中(如Negrotto等人，2000所述)。在光照培养后(16小时光照/8小时黑暗的方案)，将绿色组织转移到无生长调节物的Reg2培养基中(如Negrotto等人，2000所述)并培育1-2星期。小植株则被转移到含有Reg3培养基(如Negrotto等人，2000所述)的Magenta GA-7箱(Magenta Corp，Chicago，Ill.)中并在光照中培养。将对于启动子-报告基因盒PCR显示阳性的植株转移到土壤中并于温室中生长。
实施例19：GUS报告基因检验
利用对β-葡糖醛酸酶(GUS)表达的组织化学和荧光检验对启动子的活性进行了定性和定量估计。
1.组织化学的β-葡糖醛酸酶(GUS)检验
为了对启动子的活性进行定性估计，在GUS组织化学检验中用到了各种组织和器官。将整个器官或者组织片浸入GUS染液中。GUS染液含有1mM的5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc，Duchefa，20mM贮存于DMSO中)、100mM Na-磷酸盐缓冲液pH7.0、10mM EDTApH8.0、和0.1％Triton×100。使组织样品在37℃培育1-16小时。如果必需，可将样品通过用70％乙醇洗涤几次除去叶绿素而净化。之后在光学显微镜下观察染色的组织以估计表示GUS表达模式的蓝色染色。
2.β-葡糖醛酸酶(GUS)的荧光检验
为了在各种组织和器官中定量地分析启动子的表达活性，将GUS的表达进行荧光测定。收获组织样品并在用冰预冷的GUS抽提缓冲液(50mM Na2HPO4 pH7.0，5mM DTT，1mM Na2EDTA，0.1％Triton×100，0.1％十二烷基肌氨酸钠)中研磨。将磨碎的样品在小型离心机中于4℃在10,000rpm离心15分钟。离心之后取下上层液进行GUS检验并用于蛋白质浓度确定。
为了测量GUS活性，将植物抽提物在预热到37℃的GUS检验缓冲液(50mM Na2HPO4 pH7.0，5mM DTT，1mM Na2EDTA，0.1％Triton×100，0.1％十二烷基肌氨酸钠，1mM 4-甲基伞形烷基(Methylumbelliferyl)-β-D-葡糖醛酸二水合物(MUG))中进行检验。将反应物培育，在30分钟内以10分钟的间隔取出100μL等分试样加入到含有900μL 2％的Na2CO3的管中以终止反应。然后在Tecan荧光分光光度计上以365nm激发波长和455nm发射波长对终止的反应物读数。蛋白质的浓度是遵循厂商方案用BCA检验确定的。GUS活性表示为相对荧光单位(RFU)/mg蛋白质。
实施例20：GFP报告基因检验
通过对绿色荧光蛋白质表达的利用显微荧光成像的定性检验和利用荧光检验的定量检验来估计启动子的活性。
1.GFP表达的显微估计
在转化体中启动子∷GFP融合体的表达是通过利用Leica MzFL III荧光显微镜(Leica Microsystems，Heidelberg，德国)以GFP2和GFP3的滤器设置进行显微成像而监控的。
2.定量GFP荧光测定
为了测定转基因植物组织中GFP的表达，将收获的组织冷冻并彻底地研磨冷冻的组织。研磨后加入300μL抽提缓冲液(EB；10mMTris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，1mM MgCl2，10mM DTT和0.1％十二烷基肌氨酸钠)。充分涡旋振荡以混合样品，离心10分钟，然后将上清液转移到新的管或微量滴定板孔中以供读数。然后将样品管或滴定板插入到Tecan荧光分光光度计的设置为465nm激发波长和512nm发射波长闪光10次且增益(gain)为100的滴定板读取器上。如果表达水平过高导致一些样品超出范围(即细胞的值)，于是参数将变为闪光8次且增益为80。
蛋白质的浓度是遵循厂商方案用BCA检验确定的。GFP活性表示为相对荧光单位(RFU)每毫克蛋白质。
实施例21：启动子活性的估计
为了估计启动子∷报告基因融合体的活性，从未处理的对照植物中以及用化学激活剂(BTH或茉莉酮酸)处理的植物中收获组织样品。在转基因稻中，用化学诱导物的处理是在播种了T1种子10天以后当出现叶子3时进行的。在转基因玉米中，用化学诱导物的处理是在播种了T1种子3个星期以后进行的。所有化学药品的浓度均以ppm(每升使用溶液中的活性成分的毫克数)给出。烯丙异噻唑通过如所述的湿透土壤以含250ppm的纯物质的溶液而应用(Thieron等人(1995)稻中系统获得性抗性：在稻中诱导对Pyricularia oryzae抗性的不同物质作用模式的研究(Systemic acquired resistance in rice：Studies onthe mode of action of diverse substances inducing resistance in rice toPyricularia Oryzae)，Mededelingen Faculteit Landbouwkundige enToegepaste Biologische Wetenschappen Universiteit Gent.60：421-430)。制剂BTH(活性成分和可湿的粉末的1∶1(w/w)混和物)通过喷洒而应用于叶子上。所有对照是通过应用无活性成分的喷雾溶液而完成的。茉莉酮酸以如所述的在乙醇中的1mM溶液而应用(Schweizer等人(1997)Plant Physiol.114，79-88)。伤口及在全身组织中基因表达的测量根据(Schweizer等人(1998)Plant J.14，475-481)而进行。
通过前述的描述和实施例，对本发明的各种除此处显示及描述的之外的修饰对于本领域的技术人员将是显而易见的。这些修饰意味着是在所附的权利要求的范围之内的。
此处引用了各种参考文献和专利，它们均被整体引用作为参考。
序列表<110>Syngenta Participations AG
University of Zurich<120>脂氧化酶基因及其启动子、转运肽和蛋白质<130>A-31484A<140><141><150>GB 0017275.9<151>2000-07-13<150>GB 0022739.7<151>2000-09-15<160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>358<212>DNA<213>Oryza sativa<400>1ctgcaggccc agcaaacacg cgtcacacgt ccccgtcttt atctactcgc gcccatcctc 60tacttatcta ctcggcctct cctcctccac tactcctcgc ctggtcctcc cctctcctcg 120atcccctctt ccccttcccg ggcctctccg tggtggttgg cgcgcggcgg caggcggagg 180cgggcggtgg tgcgcggcgg cgtgacataa gcggcgggct gatgggaggg cgggcggcgg 240gtggagggga ggatggtggc gggcggatgg gtgggcgaca acgggtgggc ggcagcggga 300ggcggtgccc tcccttctgc cggaggggag gcgggaggcg gcagcggcag cggcggat 358<210>2<211>2104<212>DNA<213>Oryza sativa<400>2actatgtttg tcggagtgtg tacatagata gggggccatt cgatgggacc gctttctatg 60agttcggggg tgtcgcacgt gagggagcgc tcgggttccc attgaggacg gaaacaaatg 120aacaaacaat aattatatta gtttgagaca tccggatgtg taacatccta ctcctattgt 180gtcatgtgtt ttctctcttg ctagtgaatg atcttatatg tcagacttag agtcgtagtt 240catctctttt ggatttccga agaacttcac tgtgtatggc tatatgttct aataactctg 300tatgttcgaa cctcctttct cttggtcatg gctctcccat tatatctatc tagggacacc 360acatgatcag aatattaggg agatgctaat taagtgcata gtgccggatt atgtaaggaa 420aatcttgtca gcactgctcc tctctccctt tttgcgaggc ttagcgtaga accacgaaaa 480aaaaacttgt attaaagaca ccaagataac tagctgcaaa catcccagac aagccgatca 540tactcgaaat caaccacctt ctctatcaca tcatattgaa tttaaggttt atccaatcac 600attcaaagtt actaactaca gcaaccagga aaatcctcga aagaattaga agcatcaatg 660aagaagcatt gaacatcact tctataatcc ctccaggaaa ccatcagaag taaaacattc 720tctggccccc attggttgaa tttttttcta ataagccaaa acggcttatt agagaataaa 780aataaatgtg taggtaaaac ttttatatat gtgttttttt taacttaaaa gccaatactg 840aaaaaaacta cgttgaaaat atctcagaat caatctcaaa attaagtttg aaaattcaaa 900atttggctta ttctttggct tattgggcca tctgatggga gcctctatat ttggtagcac 960ataactaaat aaataaaagg gttcatattc ctaattgtcg aaagtctctc aaagtgacat 1020aacacactag tatttacact acggacaacc ctcctagttt agactttaga gttacatgtt 1080gcccagtttc gaggtaaagt agactagctc aaatgtgtct caaacagtcg ttcccggaac 1140ataagtcaca agtgttccca cgtgtaggca tgtttcacgc ttagatcgat cgagtttcgt 1200ttccatctgt acgtacgttg taccacccca acccgtcgat cgatatgatc gatcgtcccc 1260tataaattgg acatcctgga catgctcttt cttcagacat ctccaccctt cctatcttga 1320tatataactt cgacacactg acaacttaat ttgtcagaat gctcacggcc acgcagactc 1380tggcgccggc agtgctctcc cggagccatg gcgccccttc ttccttctcc agccagccgc 1440gccgcaccgc cgccgccgcc tcgagagtaa gctgcacccg cgtcggcgcc ttgtcggagg 1500tcgtcaatgg cgaactcgtc gtcggcgacc aagaacagac gaccgacgac ctccttacgc 1560ggcacaagaa tgtcgtcgcc gactacacgc tgagcgccac ggtgacggtg agcttgaagc 1620aggacgattc cactccccag aaggtggcgg acatggttaa tcgagactgg cttttccttg 1680atttcttcag ctcgcatata ggtgatgaca agctccatag ctactctatc gatcgtaccg 1740gccgcctctt tcgcgccata tataatcttg aacatgggca ctgattccca ttcgaaaaaa 1800tatcttaatt tgagaggatg ctttctactg gtagctagca ttctactact agaattatcg 1860tattaaaagt gatcgcagcc gttcgattta ctagctagct cgaatgatag catatattgt 1920aagtgtaaat tttgatacat tttgatatat aacttcgaca ttaggaaaaa aactacatta 1980
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