玉米DREB类转录因子及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明涉及玉米DREB类转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及玉米DREB类耐寒和耐旱转录因子及其编码基因与应用。背景技术
植物在生长过程中会受到诸多环境条件的影响，冷害和干旱会导致农作物的大规模减产。培育耐逆性的作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。生物体能感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，从而对外界的变化做出相应的反应。转录因子作为一种调控基因，当生物体感受逆境胁迫时，能调控一系列下游基因的表达，从而增强生物体对逆境的耐受力，达到抵抗不良环境条件胁迫的效果。在植物中，AP2/EREBP家族中的DREB类转录因子能够接受环境胁迫信号并且启动逆境应答基因的表达。
玉米(Zea mays L.)是重要地粮食作物之一，培育耐寒，耐旱的品种对提高玉米产量具有重要意义。发明内容
本发明的目的是提供玉米的2个DREB类转录因子及其编码基因，该转录因子在植物抗寒和抗旱反应中具有调控作用。
本发明提供的2个玉米DREB类转录因子之一为maDREB1，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2的玉米DREB类转录因子maDREB1由281个氨基酸残基组成。
玉米DREB类转录因子maDREB1的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中序列1的DNA序列；
2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1编码玉米DREB类转录因子maDREB1的基因由1388个碱基组成。该基因的读码框为自3’端第57到第902位碱基。
本发明提供的另一个玉米的DREB类转录因子是maDREB2，它具有序列表中序列4的氨基酸残基序列或将序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列4的氨基酸残基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白质。
序列表中序列4的玉米DREB类转录因子maDREB2由267个氨基酸残基组成。
玉米DREB类转录因子maDREB2的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中序列3的DNA序列；
2)与序列表中序列3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列3编码玉米DREB类转录因子maDREB2的基因由1085个碱基组成。该基因的读码框为自3’端第120到第923位碱基。
本发明所提供的2个玉米DREB类转录因子maDREB1和maDREB2具有与DRE顺式作用元件结合的能力，并能激活下游基因的表达。其编码基因都含有保守的AP2/EREBP结构域序列，代表了玉米中的一种转录因子家族。
用本发明所提供的编码转录因子maDREB1和maDREB2的基因，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体(这些植物表达载体包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，都可获得对低温和干旱胁迫耐受力得到增强的转基因植株。载体还可包括3’非翻译区域，包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片段。聚腺苷酸信号引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。3’区域的例子有农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’转录的非翻译区等。本发明的maDREB1和maDREB2基因的3’非翻译区域可被用于在植物中表达。本发明的2个基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。这些启动子很多，如花椰菜花叶病毒(CAMV 35S)和Ubiqutin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。本发明的2个基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是天然或合成等多种不同来源的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。使用的选择性标记可以是编码对抗生素抗性酶的基因，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。也可以是产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS、荧光酶，还可以是抗化学试剂(例如除莠剂)的基因。当然，也可以不用任何筛选标记。
携带有本发明maDREB1和maDREB2基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，Now York，pp.421-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2ndEdition)。
可使用包括本发明的2个基因maDREB1和maDREB2的植物表达载体转化植物宿主(既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等)，培育抗寒和抗旱的植物品种。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。附图说明
图1为maDREB1基因转化酵母双报导子细胞后，在0mM 3-AT SD/-His-Ura-Trp平板和30mM 3-ATSD/-His-Ura-Trp平板上的生长情况。
图2为maDREB2基因转化酵母双报导子细胞后，在0mM 3-AT SD/-His-Ura-Trp平板和30mM 3-ATSD/-His-Ura-Trp平板上的生长情况。
图3为Southern杂交分析maDREB1基因在玉米基因组中组成的结果。
图4为Southern杂交分析maDREB2基因在玉米基因组中组成的结果。
图7为maDREB1基因在低温、干旱条件下表达状态的RT-PCR检测结果。
图8为maDREB2基因在低温、干旱条件下表达状态的RT-PCR检测结果。具体实施方式
实施例1、玉米cDNA文库的构建
玉米(Zea mays L.)品种P138植株栽培在1/2MS固体培养基上，置于光照培养箱中(28℃，12小时光照，12小时黑暗)培养10-14天，取全株于液氮中速冻、研磨，悬于TRIzole(Gibco)中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入异丙醇沉淀总RNA，溶于水中。经mRNA纯化试剂盒处理得到mRNA。取2ug mRNA进行逆转录反应，然后再合成第二链。双链cDNA与EcoRI-NotI-BamHI接头连接后磷酸化，经制备离心柱(Sephacryl-400)取除多余的接头，然后与pAD-GAL4载体连接(具体步骤详见Stratagene HybriZAP-2.1 XR Library Construction Kit)。
实施例2、含有DRE顺式作用元件的酵母双报道子细胞的获得
将从rd29A启动子区分离的由75bp组成的DRE顺式作用元件通过HindIII酶切位点将其串联成4个重复，获得含有4个串联重复的DRE元件的DNA片段。将所得到的DNA片段插入pHISi-1载体的PminHIS3启动子的上游，并获得能在缺乏组氨酸的SD培养基上正常生长的酵母转化体。同时将这个DNA片段构建到pLacZi载体的PCYC1启动子的上游，然后将载体转化到含有pHISi-1载体的酵母转化体中。这样，在同时缺乏组氨酸和尿氨酸的培养基上，选择获得含有pHISi-1和pLacZi载体的酵母转化体。以同样的方法获得含有突变型DRE顺式作用元件的酵母双报导子细胞。HIS和LacZ基因作为2个报告基因，当其上游的DRE元件被DREB转录因子识别后，其表达强度会显著增强。通过3-AT(组氨酸合成酶竞争性抑制剂)来检测HIS基因的表达强度，同时通过β-半乳糖苷酶活力的测定来检测LacZ基因的表达强度。若其上游为突变型的DRE顺式作用元件，则其表达将无法得到增强。图3和图4分别显示了本发明编码DREB类转录因子maDREB1和maDREB2的2个基因转化酵母双报导子细胞后在含3-AT的SD/-His-Ura-Trp平板上的生长情况。图3中，A、B、C分别表示拟南芥DREB1A、maDREB1、YepGAP空载体转化酵母细胞所得的转化子。图4中，A、B、C分别表示拟南芥DREB1A、maDREB2、YepGAP空载体转化酵母细胞所得的转化子。
实施例3、玉米cDNA文库的筛选和编码转录因子maDREB1和maDREB2的基因的克隆
利用含有DRE顺式作用元件的酵母双报导子细胞，在含30mM 3-AT的SD/-His-Ura-Leu的平板上筛选玉米cDNA文库，(具体操作步骤见Clontech Mathchmakerone-hybrid system)。所得到的阳性克隆在YPD液体培养基中培养，提取质粒转化大肠杆菌。将所插入的cDNA片段从载体上切下，构建到YepGAP酵母表达载体中。由于此载体上无GAL4转录激活区域，因此只有既能与DRE元件结合又能激活下游报导基因表达的蛋白才能在30mM 3-AT的SD/-His-Ura-Leu的平板上生长。对于这样的阳性克隆，将其cDNA片段再构建到SK+载体上，经过测序获得了编码转录因子maDREB1和maDREB2的基因的核苷酸序列。maDREB1基因包括843bp的开放读码框架，编码由281个氨基酸组成的多肽，其5’端为56bp，3’端为488bp，为序列表中的序列1。maDREB2基因包括816bp的开放读码框架，编码由272个氨基酸组成的多肽，其5’端为119bp，3’端为165bp，为序列表中的序列3。
实施例4、maDREB1和maDREB2基因在玉米基因组中的分析
提取玉米品种P138和水6的基因组总DNA，分别用EcoRI、XbaI、PstI3种限制性内切酶进行消化。将消化后的DNA转到N+Hybond膜上，用全长的maDREB1作探针，进行Southern杂交分析。在高严谨度条件下洗膜(65℃，0.2×SSC，0.1％SDS)得到2-3杂交条带，结果如图3所示，图中E带是用EcoRI进行消化的、X带是用XbaI进行消化的、P带是用PstI进行消化的，表明maDREB1基因在玉米基因组中以低拷贝形式存在。提取玉米品种P138的基因组总DNA，分别用BamHI、SalI、XbaI、PstI 4种限制性内切酶进行消化。以同样的方法进行Southern杂交分析，在高严谨条件下同样得到2-3杂交条带，结果如图4所示，图中B带是用BamHI进行消化的、S带是用SalI进行消化的、X带是用XbaI进行消化的、P带是用PstI进行消化的，结果表明maDREB2基因在玉米基因组中与maDREB1基因一样以低拷贝形式存在。
实施例5、玉米maDREB1和maDREB2基因在逆境中的表达特征
对在1/2MS培养基上生长10-14天的玉米植株，在4℃下低温处理4小时，或在干旱条件下处理4小时，经液氮速冻，提取RNA作RT-PCR分析。RT-PCR反应中以玉米actinl基因为内对照，以控制PCR反应中模板cDNA浓度的一致。结果如图5、图6所示，图5中(A)是检测maDREB1基因在低温、干旱条件下表达状态的实验组、(B)是对照组、C带的样品未经逆境处理、L带的样品经低温处理4小时、D带的样品经干旱处理4小时，从图中可以看出maDREB1的转录受到低温和干旱的微弱诱导；图6中(A)是检测maDREB2基因在低温、干旱条件下表达状态的实验组、(B)是对照组、C带的样品未经逆境处理、L带的样品经低温处理4小时、D带的样品经干旱处理4小时，从图中可以看出maDREB2基因的转录受到低温和干旱的强烈诱导。
序列表<160>4<210>1<211>1388<212>DNA<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<220><221>CDS<222>(57)...(902)<400>1ccagagtacc agacaccact gcgcatcagt gcaaagaggt agctacccta tctgcc atg 59
Met
1gct caa gag ctc cac gaa acg tcc tct tgc tct gcc acc acc acc tcg 107Ala Gln Glu Leu His Glu Thr Ser Ser Cys Ser Ala Thr Thr Thr Ser
5 10 15tcg tgc acc aca tcc tgc tgc tcg tcc act gtc aca gac tcg tcc tct 155Ser Cys Thr Thr Ser Cys Cys Ser Ser Thr Val Thr Asp Ser Ser Ser
20 25 30tcg ccc ccg tca ccg gcg gcg gcc aat gcc gcg ccc gcg aca cgg aag 203Ser Pro Pro Ser Pro Ala Ala Ala Asn Ala Ala Pro Ala Thr Arg Lys
35 40 45cgg cag gcg ttg gag gcc gag gcc gag gcc gag gcg ggc ggt gag gag 251Arg Gln Ala Leu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Gly Gly Glu Glu50 55 60 65gag gag gag gag gag gaa ggc tgt gct ggt aat aag gcg gcg ccg gcc 299Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Cys Ala Gly Asn Lys Ala Ala Pro Ala
70 75 80aag aag cga ccg cgg ggc agc gag ggg aag cac ccg acg ttc cgc ggc 347Lys Lys Arg Pro Arg Gly Ser Glu Gly Lys His Pro Thr Phe Arg Gly
85 90 95gtg cgg atg cgg gcg tgg ggc aag tgg gtg tcg gag atc cgc gag ccg 395Val Arg Met Arg Ala Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu Pro
100 105 110cgc aag aag tcg cgc ata tgg ctc ggc acg ttc ccc acc gcc gag atg 443Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Met
115 120 125gcc gcg cgc gcc cac gac gtc gcg gcg ctc gcc atc aag ggc cgc gcc 491Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile Lys Gly Arg Ala130 135 140 145gcg cac ctc aac ttc ccg gac ctc gcc ggc gcg ctc ccg cgc gcc gcg 539Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala Gly Ala Leu Pro Arg Ala Ala
150 155 160tcc gcg gcg ccc aag gac gtc cag gca gcc gcc gca ttg gcc gct gcg 587Ser Ala Ala Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala
165 170 175ttc acg tcg ccg tca tcg gag ccc ggc gcc ggc gcg cac gag gag ccc 635Phe Thr Ser Pro Ser Ser Glu Pro Gly Ala Gly Ala His Glu Glu Pro
180 185 190gct gcc aag gac ggc gcc gcg ccc gag gag gca gcc gcc gac gca cag 683Ala Ala Lys Asp Gly Ala Ala Pro Glu Glu Ala Ala Ala Asp Ala Gln
195 200 205gca cca gta cca gta gca cta cca ccg ccg gcg gcc tct cgg cca ggg 731Ala Pro Val Pro Val Ala Leu Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Pro Gly210 215 220 225acg ccg tcg agc ggc gtg gag gac gag cgg cag ctg ttc gac ctg ccg 779Thr Pro Ser Ser Gly Val Glu Asp Glu Arg Gln Leu Phe Asp Leu Pro
230 235 240gac ctg ctc ctc gac atc cgg gac ggg ttc ggg cgc ttc ccg ccg atg 827Asp Leu Leu Leu Asp Ile Arg Asp Gly Phe Gly Arg Phe Pro Pro Met
245 250 255tgg gcc ccg ctc act gac gtg gag gag gtg gtc aat gcg gag ctg cgc 875Trp Ala Pro Leu Thr Asp Val Glu Glu Val Val Asn Ala Glu Leu Arg
260 265 270ctc gag gag ccg ctg ctt tgg gag tagcggtcag agatgctcgt tgcctgcatt 929Leu Glu Glu Pro Leu Leu Trp Glu
275 280gcaaacgagg tctaaacaat agtagcagtg gtatcccatt tcttctcgtt ttgcttctcg 989ccctctcctt tttttctctc tttcttgctt actttggggg gaaaacagct agttcttttt 1049ttcttcttct tcttcttctt ttattaaatt gagttttaat aagtataaac atatataaac 1109gagagagaga tataagctgt gtacttaaaa gtgtaagacg agtacctatc agttcattat 1169tacgtatcta ctagtggtac cagtagtgat catgttgtcc cggccgtgtg tgaattccag 1229cggtagttgt tgaccttgct agatttttat agttgcttgt gttgtgtgct gtaccaaaat 1289tccccaggga aaaagggcag gaagcaaacg aatgtaacgg gaacacaagc agcatctaat 1349ctctattact gctgacaacg aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1388<210>2<211>281<212>PRT<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<400>2Met Ala Gln Glu Leu His Glu Thr Ser Ser Cys Ser Ala Thr Thr Thr1 5 10 15Ser Ser Cys Thr Thr Ser Cys Cys Ser Ser Thr Val Thr Asp Ser Ser
20 25 30Ser Ser Pro Pro Ser Pro Ala Ala Ala Asn Ala Ala Pro Ala Thr Arg
35 40 45Lys Arg Gln Ala Leu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Gly Gly Glu
50 55 60Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Cys Ala Gly Ash Lys Ala Ala Pro65 70 75 80Ala Lys Lys Arg Pro Arg Gly Ser Glu Gly Lys His Pro Thr Phe Arg
85 90 95Gly Val Arg Met Arg Ala Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu
100 105 110Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu
115 120 125Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile Lys Gly Arg
130 135 140Ala Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala Gly Ala Leu Pro Arg Ala145 150 155 160 Ala Ser Ala Ala Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ala
165 170 175Ala Phe Thr Ser Pro Ser Ser Glu Pro Gly Ala Gly Ala His Glu Glu
180 185 190Pro Ala Ala Lys Asp Gly Ala Ala Pro Glu Glu Ala Ala Ala Asp Ala
195 200 205Gln Ala Pro Val Pro Val Ala Leu Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Pro
210 215 220Gly Thr Pro Ser Ser Gly Val Glu Asp Glu Arg Gln Leu Phe Asp Leu225 230 235 240Pro Asp Leu Leu Leu Asp Ile Arg Asp Gly Phe Gly Arg Phe Pro Pro
245 250 255Met Trp Ala Pro Leu Thr Asp Val Glu Glu Val Val Asn Ala Glu Leu
260 265 270Arg Leu Glu Glu Pro Leu Leu Trp Glu
275 280<210>3<211>1085<212>DNA<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<220><221>CDS<222>(120)...(923)<400>3gctcaagctc gagacaagaa accagaacca gctcactcct cactccactt ccactcccaa 60cagcaagctc aagcagtcag tcaccggcag gggtcagggt cacagtcaca gcagcagcc 119atg gac acg gcc ggc ctc gtc cag cac gcg acc tcc tcg tct tcc acc 167Met Asp Thr Ala Gly Leu Val Gln His Ala Thr Ser Ser Ser Ser Thr1 5 10 15tcc acc tcg gcg tcg tcg tcc tcg tcc gag cag cag agc cgc aag gcg 215Ser Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Glu Gln Gln Ser Arg Lys Ala
20 25 30gcg tgg ccg ccg tcg acc gct tcc tca cca cag cag ccg ccc aag aag 263Ala Trp Pro Pro Ser Thr Ala Ser Ser Pro Gln Gln Pro Pro Lys Lys
35 40 45cgc ccc gcg ggg cgc aca aag ttc cgg gag acg cgg cac ccg gtg ttc 311Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Phe
50 55 60cgc ggc gtg cgg cgg cgg ggc gcc gcg ggc cgg tgg gtg tgc gag gtg 359Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Ala Ala Gly Arg Trp Val Cys Glu Val65 70 75 80cgc gtc ccg ggg agg cgc ggc gcg cgg ctg tgg ctc ggc acc tac ctc 407Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Ala Arg Leu Trp Leu Gly Thr Tyr Leu
85 90 95gcc gcc gag gcg gcg gcg cgc gcg cac gac gcc gcg ata ctc gcc ctg 455Ala Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala His Asp Ala Ala Ile Leu Ala Leu
100 105 110cag ggc cgc ggc gcg ggg cgc ctc aac ttc ccg gac tcc gcg cgg ctg 503Gln Gly Arg Gly Ala Gly Arg Leu Asn Phe Pro Asp Ser Ala Arg Leu
115 120 125ctc gcc gtg ccg ccc ccg tcc gcg ctc ccg ggc ctg gac gac gcc cgc 551Leu Ala Val Pro Pro Pro Ser Ala Leu Pro Gly Leu Asp Asp Ala Arg
130 135 140cgc gcg gcg ctc gag gcc gtc gcg gag ttc cag cgc cgc tct ggg tcc 599Arg Ala Ala Leu Glu Ala Val Ala Glu Phe Gln Arg Arg Ser Gly Ser145 150 155 160ggg tcc ggg gcc gcc gac gaa gcg acc tcg ggc gcg tct cct ccc tcc 647Gly Ser Gly Ala Ala Asp Glu Ala Thr Ser Gly Ala Ser Pro Pro Ser
165 170 175tcg tcg ccg tcg ctg ccg gac gtt tct gcg gct ggc tcg ccg gcg gcg 695Ser Ser Pro Ser Leu Pro Asp Val Ser Ala Ala Gly Ser Pro Ala Ala
180 185 190gcg ctt gag cac gtg cct gtg aag gcc gac gaa gca gtg gcg ttg gac 743Ala Leu Glu His Val Pro Val Lys Ala Asp Glu Ala Val Ala Leu Asp
195 200 205ttg gac ggc gac gtg ttc ggg ccc gac tgg ttc ggg gac atg ggc ctg 791Leu Asp Gly Asp Val Phe Gly Pro Asp Trp Phe Gly Asp Met Gly Leu
210 215 220gag ttg gat gcg tac tac gcc agc ctc gcg gaa ggg ttg ctc gtg gag 839Glu Leu Asp Ala Tyr Tyr Ala Ser Leu Ala Glu Gly Leu Leu Val Glu225 230 235 240ccg ccg ccg ccg ccg gcg gcc tgg gat cat gga gac tgc tgt gac tcc 887Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala Trp Asp His Gly Asp Cys Cys Asp Ser
245 250 255gga gct gcg gac gtc gcg ctc tgg agc tac tac tagcaaagtt aacaataata 940Gly Ala Ala Asp Val Ala Leu Trp Ser Tyr Tyr
260 265agcttgacag ccaaccccaa aagcccccca actgattgta ttcacctctg taacaaaatt 1000caaattgatt tcccagcaaa tgaacttcaa aagaagtctt tggttccgat ttaaaaaaaa 1060aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1085<210>4<211>267<212>PRT<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<400>4Met Asp Thr Ala Gly Leu Val Gln His Ala Thr Ser Ser Ser Ser Thr1 5 10 15Ser Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Glu Gln Gln Ser Arg Lys Ala
20 25 30Ala Trp Pro Pro Ser Thr Ala Ser Ser Pro Gln Gln Pro Pro Lys Lys
35 40 45Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Phe
50 55 60Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Ala Ala Gly Arg Trp Val Cys Glu Val65 70 75 80Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Ala Arg Leu Trp Leu Gly Thr Tyr Leu
85 90 95Ala Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala His Asp Ala Ala Ile Leu Ala Leu
100 105 110Gln Gly Arg Gly Ala Gly Arg Leu Asn Phe Pro Asp Ser Ala Arg Leu
115 120 125Leu Ala Val Pro Pro Pro Ser Ala Leu Pro Gly Leu Asp Asp Ala Arg
130 135 140Arg Ala Ala Leu Glu Ala Val Ala Glu Phe Gln Arg Arg Ser Gly Ser145 150 155 160Gly Ser Gly Ala Ala Asp Glu Ala Thr Ser Gly Ala Ser Pro Pro Ser
165 170 175Ser Ser Pro Ser Leu Pro Asp Val Ser Ala Ala Gly Ser Pro Ala Ala
180 185 190Ala Leu Glu His Val Pro Val Lys Ala Asp Glu Ala Val Ala Leu Asp
195 200 205Leu Asp Gly Asp Val Phe Gly Pro Asp Trp Phe Gly Asp Met Gly Leu
210 215 220Glu Leu Asp Ala Tyr Tyr Ala Ser Leu Ala Glu Gly Leu Leu Val Glu225 230 235 240Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala Trp Asp His Gly Asp Cys Cys Asp Ser
245 250 255Gly Ala Ala Asp Val Ala Leu Trp Ser Tyr Tyr
260 265