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本发明提供一种式(I)的化合物：其中X＝CH2或S或其药物学可接受的盐。该化合物与其相应的药物学可接受的酸加成盐形式可用于治疗由DPIV或DPIV样酶介导的病症，如关节炎、肥胖症、免疫和自身免疫疾病、同种异体移植、癌症、神经元疾病和皮肤病的疾病或病症。

1.  一种下式的化合物或其酸加成盐：

其中X＝CH₂或S。

2.  一种药物组合物，其包括药物学可接受的载体和/或稀释剂以及如权利要求1所述的化合物。

3.  如权利要求1所述的化合物或如权利要求书2所述的药物组合物在制备药剂中的应用，其中该药剂用于抑制二肽基肽酶IV或二肽基肽酶IV样酶活性以预防或治疗与二肽基肽酶IV或二肽基肽酶IV样酶相关的疾病或紊乱。

4.  如权利要求3所述的应用，其是用于降低哺乳动物由摄入食物引起的血糖水平提高。

5.  如权利要求3或4所述的应用，其是用于预防或治疗非胰岛素依赖性糖尿病、关节炎、肥胖症、免疫和自身免疫疾病、同种异体移植、癌症、神经元疾病和皮肤病。

6.  一种抑制二肽基肽酶IV或二肽基肽酶IV样酶活性以预防或治疗与二肽基肽酶IV或二肽基肽酶IV样酶相关的疾病或紊乱的方法，其包括向需要该治疗的哺乳动物给药治疗有效量的如权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的组合物。

7.  如权利要求6所述的方法，其是用于降低哺乳动物由摄入食物引起的血糖水平提高。

8.  如权利要求6或7所述的方法，其是用于预防或治疗选自非胰岛素依赖性糖尿病、关节炎、肥胖症、免疫和自身免疫疾病、同种异体移植、癌症、神经元疾病和皮肤病的疾病或病症。

基于谷氨酰胺酰基的DPIV抑制剂
技术领域
本发明涉及二肽基肽酶抑制领域，更具体而言，涉及谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷、含有上述化合物的药物组合物以及上述化合物在抑制二肽基肽酶IV及二肽基肽酶IV样酶活性中的应用。
背景技术
二肽基肽酶IV(DPIV)是一种丝氨酸蛋白酶，它催化N-端二肽从肽链断裂，该肽链优选在次末端位置含有脯氨酸残基。尽管DPIV在哺乳动物系统内的生物作用尚未完全确定，但相信它在神经肽代谢、T-细胞激活作用、癌细胞附着于内皮以及HIV进入淋巴样细胞中起重要作用。
同样地，发现胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和也称为抑胃肽(GIP)的葡萄糖依赖性胰岛素释放肽的灭活归因于DPIV。由于GLP-1是胰腺胰岛素分泌的主要刺激物，并且对葡萄糖的消除具有直接有益的作用，在WO 97/40832和US 6,303,661中公开了DPIV和DPIV样酶活性的抑制作用，从而提供了诱人的如治疗非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)的方法。
本发明的一方面提供了例如对治疗由DPIV或DPIV样酶的抑制作用介导的疾病有效的新型DPIV抑制剂、可用于如抑制DPIV或DPIV样酶的药物组合物以及一种抑制上述酶活性的方法。
本发明的另一方面涉及一种治疗方法和用于该方法的组合物。上述方法具体而言为一种治疗糖尿病，特别是非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)或2型糖尿病以及与糖尿病有关疾病的方法。
二肽基肽酶IV(DPIV)是一种脯氨酸后(较少意义上为丙氨酸后、丝氨酸后、甘氨酸后)断裂丝氨酸蛋白酶，其可在体内许多组织如肾、肝和肠中发现。
众所周知DPIV抑制剂可用于治疗糖耐量降低和糖尿病(国际专利申请，公开号WO99/61431，Pederson RA等，Diabetes.1998 Aug；47(8)：1253-8；以及Pauly RP等，Metabolism 1999 Mar；48(3)：385-9)。具体而言，WO99/61431公开了包括氨基酸残基和噻唑烷或吡咯烷基的DPIV抑制剂以及其盐，特别是L-苏-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-苏-异亮氨酰吡咯烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰吡咯烷以及它们的盐。
低分子量二肽基肽酶IV抑制剂更多的例子为如四氢异喹啉-3-氨甲酰衍生物、N-取代2-氰基吡咯和吡咯烷、N-(N’-取代甘氨酰)-2-氰基吡咯、N-(取代甘氨酰)-噻唑烷、N-(取代甘氨酰)-4-氰基噻唑烷、硼抑制剂以及环丙基稠合吡咯烷。US 6,011,155；US 6,107,317；US 6,110,949；US 6,124,305；US 6,172,081；WO 99/61431，WO 99/67278，WO 99/67279，DE 198 34 591，WO 97/40832，DE 196 16 486 C 2，WO 98/19998，WO00/07617，WO 99/38501，WO 99/46272，WO 99/38501，WO 01/68603，WO01/40180，WO 01/81337，WO 01/81304，WO 01/55105和WO 02/02560中记载了二肽基肽酶IV抑制剂，本文引入其中所有关于抑制剂、其产品及其应用的内容作为参考。
发明内容
本发明提供如下式的化合物或其药物学可接受的盐：

其中X＝CH₂或S。
该化合物及其对应的药物学可接受的酸加成盐形式可用于治疗由DPIV或DPIV样酶介导的疾病，如关节炎、肥胖症、免疫和自身免疫疾病、同种异体移植、癌症、神经元疾病和皮肤病。
在更优选的实施方案中，本发明化合物降低了由口服葡萄糖激发引起的血糖水平升高，由此可改善葡萄糖耐受量，并因此可用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病。
可参照附图进一步理解本发明，其中：
图1显示口服和血管内给药100mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基吡咯烷后Wistar大鼠血清中的血浆DPIV活性；
图2显示口服和血管内给药100mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基噻唑烷后Wister大鼠血清中的血浆DPIV活性；
图3显示分别口服给药5mg/kg、15mg/kg、50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基吡咯烷和安慰剂后糖尿病性Zucker大鼠的剂量依赖性血糖水平降低；
图4显示分别口服给药5mg/kg、15mg/kg、50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基噻唑烷和安慰剂后糖尿病性Zucker大鼠的剂量依赖性血糖水平降低；
图5显示向Wistar大鼠口服给药谷氨酰胺酰基噻唑烷后发现的降解产物焦谷氨酰胺酰基噻唑烷的化学结构；以及
图6显示脂肪性Zucker大鼠口服给药谷氨酰胺酰基噻唑烷后大鼠血浆提取物的色谱图。2.95分钟处的峰代表谷氨酰胺酰基噻唑烷，6.75分钟处的峰代表焦谷氨酰胺酰基噻唑烷。
本发明涉及二肽基肽酶抑制领域，更具体而言，本发明涉及谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷、含有上述化合物的药物组合物以及上述化合物在抑制二肽基肽酶IV及二肽基肽酶IV样酶活性中的应用。
本发明提供了例如对治疗由DPIV或DPIV样酶的抑制作用介导的疾病有效的新型DPIV抑制剂、可用于例如抑制DPIV或DPIV样酶活性的药物组合物以及一种抑制DPIV或DPIV样酶活性的方法。
本发明提供如下式的化合物：

特别是式(I)的化合物或其药物学可接受的盐：

本发明进一步优选的化合物为式(II)的化合物或其药物学可接受的盐：

本发明化合物可以与酸成盐，特别是药物学可接受的酸加成盐。药物学可接受的盐通常为氨基酸碱性侧链被无机或有机酸质子化的形式。典型的有机或无机酸包括盐酸、氢溴酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲基磺酸、羟乙基磺酸、苯磺酸、草酸、双羟萘酸(pamoic acid)、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷磺酸、水杨酸、己糖酸或三氟乙酸。本发明化合物所有的药物学可接受的酸加成盐形式都包含在本发明范围内。
考虑到游离化合物与成盐形式的化合物间的密切关系，凡本文中提到化合物时，如果在当时的环境下可能或适合，也包括相应的盐。
本发明的范围进一步包括本发明化合物的前药。通常，该前药为化合物的功能衍生物，它们在体内易于转化为所需的治疗活性化合物。因此，在这些情况下，本发明的治疗方法，“给药”一词包括用一种或多种本发明化合物的前药形式治疗上述种种疾病，该前药形式在患者服用后在体内转化成上述化合物。筛选和制备合适的前药衍生物的常规方法记载于如“Design of Prodrugs”，H.Bundgaard编辑，Elsevier，1985和专利申请DE 198 28 113、DE 198 28 114、WO 99/67228和WO 99/67279中，此处全文引用作为参考。
在本发明化合物具有至少一个手性中心的情况下，它们可相应地以对映异构体的形式存在。当化合物具有两个或多个手性中心的情况下，它们还可以以非对映异构体的形式存在。应该懂得，所有这些异构体或其混合物都包括在本发明的范围之内。而且，化合物的一些晶体形式可以多晶型形式存在，并且它们同样包括在本发明之内。此外，一些化合物可以与水(即水合物)或通用有机溶剂形成溶剂化物，这些溶剂化物同样包括在本发明范围之内。
化合物，包括其盐，可以它们的水合物、或包括用于其重结晶地其他溶剂的溶剂化物的形式获得。
如前所述，本发明化合物且特别是式I和式II的化合物，以及其对应的药物学可接受的酸加成盐形式，可用于抑制DPIV和DPIV样酶的活性。如实施例4和5所述，可通过用DPIV活性分析测定体外及人血浆内的K_i值来证明本发明化合物及其对应的药物学可接受的酸加成盐形式抑制DPIV和DPIV样酶活性的能力。本发明化合物的K_i值测定为：对猪肾DPIV，谷氨酰胺酰基噻唑烷K_i＝3.12*10^-7M±5.11*10^-10M，谷氨酰胺酰基吡咯烷K_i＝1.30*10^-6M±8.49*10^-8M。本发明化合物人血浆K_i-值测定为：谷氨酰胺酰基噻唑烷预保温5分钟后K_i＝4.03*10^-7M±2.19*10^-10M，预保温22小时后K_i＝5.13*10^-7M±1.26*10^-8M；谷氨酰胺酰基吡咯烷预保温5分钟后K_i＝1.30*10^-6M±4.89*10^-8M，预保温22小时后K_i＝1.36*10^-6±3.21*10^-8M。
如实施例9所述，本发明化合物及其对应的药物学可接受的酸加成盐形式体内抑制DPIV活性的能力可以通过向Wister大鼠口服或血管内给药证明。本发明化合物在向Wister大鼠口服和血管内给药后均在体内抑制DPIV活性。
DPIV存在于许多种哺乳动物的器官和组织中，如肠刷状缘(Gutschmidt S.等，“In situ”-measurements of protein contents in the brushborder region along rat jejunal villi and their correlations with four enzymeactivities.Histochemistry 1981，72(3)，467-79)、外分泌上皮细胞、肝细胞、肾小管、内皮、成肌纤维细胞(Feller A.C.等，A monoclonal antibodydetecting dipeptidylpeptidase IV in human tissue.Virchows Arch.A.Pathol.Anat.Histopathol.1986；409(2)：263-73)、神经细胞、某些表面上皮细胞的侧膜(如输卵管、子宫和精囊)、(如精囊上皮细胞、十二指肠腺的粘液细胞的)鲁米那细胞质中(Hartel S.等，Dipeptidyl peptidase(DPP)IV inrat organs.Comparison of immunohistochemistry and activity histochemistry.Histochemistry 1998；89(2)：151-61)，生殖系统(如附睾尾和壶腹、精囊)以及它们的分泌物(Agrawal & Vanhaperttula，Dipeptidyl peptidases inbovine reproductive organs and secretions.Int.J.Androl.1986.9(6)：435：52)。在人血清中，存在二肽基肽酶的双分子形式(Krepela E.等，Demonstration of two molecular forms of dipeptidyl peptidase IV in normalhuman serum.Physiol.Bohemoslov.1983，32(6)：486-96)。DPIV血清高分子量形式于活性T细胞表面上表达(Duke-Cohan J.S.等，Serum highmolecular weight dipeptidyl peptidase IV(CD26)is similar to a novel antigenDPPT-L released from activated T cells.J.Immunol.1996，156(5)：1714-21)。
本发明化合物及其相应的药物学可接受的酸加成盐形式能够于体内抑制DPIV。在本发明的一个实施方案中，所有哺乳动物组织和器官DPIV的所有的分子形式、同系物和表位以及那些尚未被发现的，都包括在本
发明范围之内。
在稀有的脯氨酸特异性蛋白酶中，DPIV起初被认为是唯一的膜结合多肽链氨基端次末端脯氨酸特异性酶。然而，近来确定了其它分子，虽然在结构上不是DPIV的同系物，却具有同等的酶活性。迄今为止已被确定的DPIV样酶为例如成纤维细胞活化蛋白α、二肽基肽酶IVβ、二肽基氨基肽酶样蛋白、N-乙酰化α连接酸性二肽酶、静息细胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶II、吸诱素(attractin)和二肽基肽酶IV相关的蛋白质(DPP8)，它们记述于Sedo & Malik的综述中(Sedo & Malik，Dipeptidylpeptidase IV-like molecules：homologous proteins or homologous activities？Biochimica et Biophysica Acta 2001，36506：1-10)。
更多DPIV样酶公开于WO 01/19866、WO 02/04610、WO 02/34900和WO 02/31134中。WO 01/19866公开了新型的同DPIV和成纤维活化蛋白(FAP)结构和功能相似的人二肽基氨基肽酶(DPP8)。WO 02/04610提供调节人二肽基肽酶IV样酶的试剂以及与人二肽基肽酶IV样酶基因产品结合的试剂。这些试剂可用于抑制、改善或纠正功能紊乱或疾病包括但不限于癌症和包括疼痛及神经变性病的外周和中枢神经系统疾病。WO 02/04610中公开的二肽基肽酶IV样酶在本领域众所周知。该酶在Gene Bank数据库中注册为KIAA1492(注册于2001年2月，提交于2000年4月4日，AB040925)。WO 02/34900公开一种与DPIV和DPP8氨基酸序列具有显著同源性的二肽基肽酶9(DPP9)。WO 02/31134公开3种DPIV样酶：DPRP1、DPRP2和DPRP3。序列分析显示如WO 01/19866所公开，DPRP1与DPP8相同；如WO 02/04610所公开，DPRP2与DPP9相同且DPRP3与KIAA1492相同。
在本发明另一优选实施方案中，所有哺乳动物组织和器官中的DPIV的所有分子形式、同系物和表位以及那些尚未被发现的，都包括在本发明范围之内。
如实施例6所述，本发明化合物及其对应的药物学可接受的酸加成盐形式抑制DPIV样酶的能力可以通过使用酶活性分析法测定体外K_i值证明。本发明化合物对猪二肽基肽酶II的K_i值测定为谷氨酰胺酰基吡咯烷K_i＝8.52*10^-5M±6.33*10^-6M，谷氨酰胺酰基噻唑烷K_i＝1.07*10^-5M±3.81*10^-7M。所有化合物均可抑制猪二肽基肽酶II。
在本发明另一实施方案中，本发明化合物以及其相应的药物学可接受的酸加成盐形式对非DPIV和非DPIV样脯氨酸特异性酶若有也仅有微弱的抑制作用。如实施例7所述，未发现谷氨酰胺酰基噻唑烷和谷氨酰胺酰基吡咯烷对二肽基肽酶I和脯氨酰寡聚肽酶的抑制。对氨酰基脯氨酸二肽酶，与DPIV相比两种化合物都显示出非常微弱的作用。对氨酰基脯氨酸二肽酶的IC₅₀值测定为谷氨酰胺酰基噻唑烷IC₅₀＞3mM和谷氨酰胺酰基吡咯烷IC₅₀＝3.4*10^-4M±5.63*10^-5。
从其抑制DPIV和DPIV样酶活性的能力看，本发明化合物，特别是式I和II的化合物，以及它们相应的药物学可接受的酸加成盐形式可用于治疗由所述酶活性介导的疾病。因此，本发明公开的化合物可用于治疗如非胰岛素依赖性糖尿病、关节炎、肥胖症、免疫和自身免疫疾病、同种异体移植、癌症、神经元疾病如多发性硬化和皮肤病。
在本发明一个更为优选的实施方案中，本发明化合物以及其相应的药物学可接受的酸加成盐形式可通过降低由口服葡萄糖激发引起的血糖水平升高而改善葡萄糖耐受量，并因此可用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病。本发明化合物以及其相应的药物学可接受的酸加成盐形式改善葡萄糖耐受量的能力可用糖尿病性Zucker大鼠测量。该方法在实施例10和11中记述。口服给药5mg/kg b.w.、15mg/kg和50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基噻唑烷或谷氨酰胺酰基吡咯烷导致高血糖水平的剂量依赖性降低并因此改善了糖尿病性Zucker大鼠的葡萄糖耐受量。
根据实施例5，本发明化合物在人血浆内稳定。令人惊奇的是，在本发明另一优选的实施方案中，本发明化合物以及其相应的药物学可接受的酸加成盐形式在向哺乳动物给药后可能在体内降解。本发明化合物以及其相应的药物学可接受的酸加成盐形式在体内降解的能力可以采用Wistar大鼠然后LC/MS分析加以测定。研究发现谷氨酰胺酰基噻唑烷在向Wistar大鼠口服给药后降解为各自的焦谷氨酰胺酰基噻唑烷。
因此，本发明提供了一种治疗需要治疗的患者中由DPIV或DPIV样酶活性调变介导的疾病的方法，该方法包含给药治疗疾病有效的量或剂量方案的任意本发明化合物或其药物组合物。此外，本发明包括本发明化合物以及其相应的药物学可接受的酸加成盐形式在制备用于预防或治疗患者DPIV或DPIV样酶活性调变介导的疾病的药物中的应用。该化合物可由任何常规给药途径给药，包括但不限于静脉、口服、皮下、肌肉、皮内和非胃肠道给药。
在一个进一步的实施方案中，本发明提供了本发明化合物以及其相应的药物学可接受的酸加成盐形式的药物组合物制剂。
本文所用“患者”一词指作为治疗、观测或实验的对象的动物，优选为哺乳动物，最优选为人类。
本文所用“治疗有效量”一词指活性化合物或药物的剂量，该剂量引起组织系统、动物或人发生研究人员、兽医、医生或其他临床医生所努力达到的生物学或医学反应，包括减轻所治疗疾病或紊乱的症状。
本文所用“组合物”一词包括含有治疗有效量的本发明化合物的产品以及任意由联用本发明化合物直接或间接得到的产品。
将一种或多种本发明化合物、特别是式I和II的化合物，以及其相应的药物学可接受的酸加成盐形式作为活性成分，按照常规的药剂配伍技术与药物载体直接混合以制备本发明组合物。根据如口服或如肌肉等非胃肠道给药等所需给药的剂型，该载体具有非常多的形式。制备口服剂型的组合物时，可使用任意常见的药物介质。例如，对于液体口服制剂，例如混悬剂、酏剂和溶液剂，可优先采用的适宜的载体和添加剂包括水、二醇类、油类、醇类、芳香剂、防腐剂、着色剂等；对于固体口服制剂，例如散剂、胶囊剂、gelcaps和片剂，适宜的载体和添加剂包括淀粉、糖类、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于易于服用，采用固体药物载体的片剂和胶囊剂成为最有利的口服剂量单位形式。若需要，片剂可通过通用的技术包糖衣或肠衣。对于非胃肠道给药，载体通常包括无菌水在可能加入的其它成分中。该成分例如是为了增加溶解度或为防腐的目的。
同样，可制备可注射混悬剂，这时，可加入适宜的液体载体、助悬剂等。此处该药物组合物每剂量单位，如每片、每粒胶囊、每剂散剂、每针注射剂、每茶匙量等将包含释放上述有效剂量所必需量的活性成分。此处该药物组合物每剂量单位，如每片、每粒胶囊、每剂散剂、每针注射剂、每茶匙量等将包含约0.01mg到约1000mg(优选约5mg到500mg)，且可以每天约0.1到约300mg/kg体重(优选1到50mg/kg每天)的剂量给药。该剂量还可基于患者、所治疗疾病的病情及所应用的化合物的需要而改变。可采用每日给药或周期后定量给药。一般地，剂量可由医生基于患者的特异性、他/她的病情以及所希望的治疗效果加以调节。
这些组合物优选为单元剂型的，如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、无菌非胃肠道给药(注射)溶液或混悬液、定量气雾剂或液体喷雾剂、滴剂、安瓿剂、自我注射装置或栓剂；用于口腔的非胃肠道给药、鼻腔给药、舌下给药或直肠给药，或者吸入给药或吹入给药。作为选择，该组合物可采取适宜每周或每月一次给药的形式；例如活性化合物的不溶盐如癸酸盐可用来提供一种用于肌肉注射的长效制剂。对于制备固体组合物如片剂，理论上主要有效成分与药物载体例如常规的成片辅料如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶类、以及其他例如水的药物稀释剂相混合，形成含有均一混合物的固体预制剂组合物，该混合物含有本发明化合物或其药物学可接受的盐。当提到这些预制剂组合物为均一时，意思是说活性成分理想地均匀分散于组合物中，从而该组合物易于分为等效的剂型如片剂、丸剂和胶囊剂。该固体预制剂组合物就可分为含有约0.1到1000mg、优选约5到500mg本发明活性成分的上述类型的单位剂型。
该新型组合物的片剂或丸剂可优先包衣或以其他方式配制以提供具有持久作用的剂型。例如，片剂或丸剂可以由内部剂量和外部剂量成分组成，后者包裹前者。这两种成分由抵制在胃中崩解且可使内层成分完整无缺地进入十二指肠或延缓释放的肠衣隔开。许多材料可用于形成类似肠衣或包衣，如包括许多聚合酸及虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素等的材料。
优先含有本发明的新型组合物用于口服或注射给药的液体形式包括水溶液、适当加香的糖浆、水或油性混悬液和含有如棉子油、芝麻油、椰子油或花生油的加香乳剂，以及酏剂和类似的药物传递系统。适宜用于水混悬液的分散或助悬剂包括合成和天然树胶，如西黄蓍胶、阿拉伯胶、藻酸盐、右旋糖酐、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。
如果制备本发明化合物的过程生成立体异构体，该异构体可由常规方法如制备色谱法分离。该化合物可以外消旋形式制备，或者由对映体特异性合成法或通过拆分制备单个的对映异构体。该化合物例如可由通用的方法拆分为其对映异构体成分。如通过与如(-)-二-p-甲苯酰-d-酒石酸和/或(+)-二-p-甲苯酰-1-酒石酸的旋光性酸成盐，然后分步结晶、用游离碱再生生成非对映对。该化合物还可以通过生成非对映酯或酰胺、然后用色谱法分离和除去手性助剂拆分。作为选择，该化合物可使用手性HPLC色谱柱拆分。
在任一本发明化合物的制备过程中，可能需要和/或希望保护任一有关分子的敏感或活性基团。可以使用常规保护基达到这一目的，该常规基团如下述文献所述Protective Groups in Organic Chemistry，J.F.W.McOmie编辑，Plenum Press，1973；和T.W.Greene & P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley & Sons，1991，此处全文引用作为参考。保护基可在之后方便的阶段使用本领域周知的方法除去。
本发明所述的治疗由二肽基肽酶IV和DPIV样酶介导的疾病的方法同样可以使用由一种或多种本文所述的化合物以及药物学可接受的载体组成的药物组合物而实施。该药物组合物含有约0.01mg到1000mg，优选为约5到500mg化合物，可构成任意适于所选给药方式的形式。载体包括必要的和惰性药物赋形剂，包括但不限于粘合剂、助悬剂、润滑剂、食用香料、甜味剂、防腐剂、染料和包衣。适于口服给药的组合物包括固体形式如丸剂、片剂、胶囊药片、胶囊剂(每种都包括速释、定时释放和缓释剂型)、颗粒剂、和散剂，以及液体形式如溶液剂、糖浆剂、酏剂、乳剂和混悬剂。可用于非胃肠道给药的形式包括灭菌溶液、乳剂和混悬剂。
优先地，本发明化合物可以单一的每日剂量或将总剂量分为每日2、3或4次给药。此外，本发明化合物可通过适宜的局部应用鼻腔载体，或者通过本领域普通技术人员熟知的透皮皮肤贴片以鼻腔形式给药。若以透皮传递系统的形式给药，给药剂量将理所当然地在整个给药方案期间连续而不是间断，剂量规格将需要相应调整以获得所需的治疗效果。
更优选地，以片剂或胶囊剂口服给药时，活性药物成分可同口服、无毒的药物学可接受的惰性载体混合，如乙醇、甘油、水等。此外，如果希望或者必需，可向混合物中加入适宜的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。适宜的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖类如葡萄糖或β乳糖、玉米甜味剂、天然和合成的树胶如阿拉伯胶、西黄蓍胶或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
液体形式适于加香助悬剂或分散剂如合成和天然树胶，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等。如果用于非胃肠道给药，需要为灭菌混悬液和溶液。当需要血管内给药时，通常采用含有适宜的防腐剂的等渗制剂。
本发明化合物还可以脂质体传递系统的形式给药，如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体。脂质体可采用本领域所述的方法由多种磷脂制成，如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱。
本发明化合物还可结合使用可溶性聚合物作为靶向药物载体。该聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬氨酰胺苯酚或棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。此外本发明化合物可结合使用一类可用于实现药物控释的生物可降解聚合物，如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯类、聚缩醛类、聚二氢吡喃类、聚氰基丙烯酸酯类以及水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。
在需要治疗任意所述疾病的情况下，本发明化合物可以任意前述组合物的形式根据本领域所确定剂量方案给药。
产品的每日剂量可在成年人每人每天0.01mg到1.000mg范围内变动。对于口服给药，组合物优选采用片剂形式含有0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，50.0，100，150，200，250，500和1000毫克活性物质以根据所治疗患者的症状调节剂量。有效量的药物通常以每天约0.1mg/kg到约300mg/kg体重的剂量水平供给。优选地，该范围从约1到50mg/kg体重每天。该组合物可以每天1到4次的方案给药。
最优的给药剂量易于由本领域技术人员确定，并随所应用的特定化合物、给药方式、制剂的规格、给药方式的生物利用度以及疾病病情的发展程度而变化。此外，调整剂量通常需要考虑到与所治疗特定患者相关的因素，包括患者年龄、重量、饮食和给药时间。
本发明化合物或组合物可在餐前、就餐时或餐后服用。
如果在餐前服用，本发明化合物或组合物可在就餐前1小时、优选30甚至15或5分钟时服用。
如果在就餐时服用，本发明化合物或组合物可同膳食混合或以上述独立的剂型服用。
如果在餐后服用，本发明化合物或组合物可在结束就餐5、15分钟甚至1小时后服用。
实施例
实施例1：谷氨酰胺酰基吡咯烷游离碱的合成
酰化：
N-苯甲基-氧基羰基谷氨酰胺(2.02g，7.21mmol)溶于35ml THF，降温至-15℃。向该混合物中加入CAIBE(氯甲酸异丁基酯)(0.937ml，7.21mmol)和4-甲基吗啉(0.795ml，7.21mmol)，搅拌15分钟。所得混合酸酐用TLC(展开剂：氯仿/甲醇：9/1)检查。升温至-10℃后加入吡咯烷(0.596ml，7.21mmol)。将混合物升至室温，搅拌过夜。
提纯：
滤去所生成沉淀并蒸发溶剂。所得油用乙酸乙酯(20ml)吸收，且依次用饱和硫酸氢钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，干燥、蒸发。所得产品用TLC检验纯度(展开剂：氯仿/甲醇：9/1)。
产量：1.18g，蜡状固体
断裂：
所得1.18克固体Z-保护的化合物溶于40mg无水乙醇。向溶液中加入约20mg钯碳催化剂(10％，FLUKA)，在氢气环境下振摇混悬液3小时。反应过程用TLC(展开剂：氯仿/甲醇：9/1)监测。反应结束后除去溶剂，得到游离碱。
产率：99％
用TLC法检测纯度：正丁醇/乙醇/水/乙酸乙酯：1/1/1/1，R_f＝0.4。
反应产物用NMR分析鉴定。
实施例2：盐酸谷氨酰胺酰基噻唑烷的合成
酰化：
N-叔丁基-氧基羰基谷氨酰胺(2.0g，8.12mmol)溶于5ml THF中并降温至-15℃。向该混合物中加入CAIBE(氯甲酸异丁基酯)(1.06ml，8.12mmol)和4-甲基吗啉(0.895ml，8.12mmol)，搅拌15分钟。所得混合酸酐用TLC法(展开剂：氯仿/甲醇：9/1)检查。升温至-10℃后再加入等量的4-甲基吗啉(0.895ml，8.12mmol)与盐酸噻唑烷(1.02ml，8.12mmol)。将混合物升至室温，搅拌过夜。
提纯：
滤去所生成沉淀并蒸发溶剂。所得油用氯仿(20ml)吸收，且依次用饱和硫酸氢钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，干燥、蒸发。所得产品用TLC检验纯度(展开剂：氯仿/甲醇：9/1)。
产量：1.64g，固体
断裂：
640mg所得固体Boc-保护的化合物在二氧六环(12.98M，20当量)中溶于3.1ml冰HCl，并置于冰上。反应过程用TLC(展开剂：氯仿/甲醇：9/1)监测。反应结束后除去溶剂，所得油用甲醇吸收并再次蒸发。所得油在五氧化磷上干燥后并用二乙醚研磨2次。用HPLC检验纯度。
产量：0.265g
用HPLC检测纯度。
反应产物用NMR分析鉴定。
实施例3：盐酸谷氨酰胺酰基吡咯烷的合成
酰化
N-叔丁基-氧基羰基谷氨酰胺(3.0g，12.18mmol)溶于7mlTHF中并降温至-15℃。向该混合物中加入CAIBE(氯甲酸异丁基酯)(1.6ml，12.18mmol)和4-甲基吗啉(1.3ml，12.18mmol)，搅拌15分钟。所得混合酸酐用TLC法(展开剂：氯仿/甲醇：9/1)检查。升温至-10℃后加入1当量的吡咯烷(1.0ml，12.18mmol)。将混合物升至室温，搅拌过夜。
提纯：
滤去所生成沉淀并蒸发溶剂。所得油用氯仿(20ml)吸收，且依次用饱和硫酸氢钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，干燥、蒸发。所得产品用TLC检验纯度(展开剂：氯仿/甲醇：9/1)。
产量：2.7g，固体
断裂：
所得2.7g固体在二氧六环(12.98M，20当量)中溶于13.0ml冰HCl，并置于冰上。反应过程用TLC(展开剂：氯仿/甲醇：9/1)监测。反应结束后除去溶剂，所得油用甲醇吸收并再次蒸发。所得油在五氧化磷上干燥后并用二乙醚研磨2次。
产量：980mg
用HPLC检测纯度。
反应产物用NMR分析鉴定。
实施例4：K_i值的测定
使用37.5U/mg对甘氨酰基脯氨酰基-4-硝基苯胺有特异活性的猪肾二肽基肽酶IV与储备液中1.41mg/ml浓度的酶测定谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷的K_i值。
试验混合物：
100μl浓度为1*10^-5M到1*10^-7M(谷氨酰胺酰基吡咯烷)和1*10^-6M到1*10^-8M(谷氨酰胺酰基噻唑烷)的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷分别与50μl不同浓度(0.4mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM)的甘氨酰基脯氨酰基-4-硝基苯胺及100μl HEPES(40mM，pH7.6；离子强度＝0.125)混合。该试验混合物在30℃预热30分钟。预热后，加入20μl DPIV(1∶600稀释)并在30℃及λ＝405nm处用读板器(plate reader)(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)测定10分钟由4-硝基苯胺释放引起的黄色显色。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)基于谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷对DPIV竞争性抑制计算K_i值。K_i值计算为谷氨酰胺酰基噻唑烷K_i＝3.12*10^-7M±5.11*10^-10M，谷氨酰胺酰基吡咯烷K_i＝1.30*10^-6M±8.49*10^-8M。
实施例5：人血浆K_i值的测定
人血浆包含N-端Xaa-Pro释放活性
70μl浓度为1*10^-5M到1*10^-7M(谷氨酰胺酰基吡咯烷)和1*10^-6M到1*10^-8M(谷氨酰胺酰基噻唑烷)的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷分别与50μl不同浓度(0.4mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM)的甘氨酰基脯氨酰基-4-硝基苯胺及100μl HEPES(40mM，pH7.6)混合。试验混合物在30℃分别预热5分钟和22小时。预热后，加入50μl人血浆并在30℃及λ＝405nm处用读板器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)测定10分钟由4-硝基苯胺释放引起的黄色显色。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)基于谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷对DPIV竞争性抑制计算K_i值。K_i值计算为谷氨酰胺酰基噻唑烷预热5分钟后K_i＝4.03*10^-7M±2.19*10^-10M、预热22小时后K_i＝5.13*10^-7M±1.26*10^-8M，谷氨酰胺酰基吡咯烷预热5分钟后K_i＝1.30*10^-6M±4.89*10^-8M、预热22小时后K_i＝1.36*10^-6M±3.21*10^-8M。
实施例6：DPIV样酶-二肽基肽酶II的抑制
若N-端未质子化，DPII(3.4.14.2)由寡肽释放N-端二肽(McDonald，J.K.，Ellis，S.& Reilly，T.J.，1966，J.Biol.Chem.，241，1494-1501)。P₁-位的脯氨酸与丙氨酸为优选的残基。酶活性由DPIV样酶活性表征，而DPII具有酸性的最适pH值。所使用的酶由猪肾纯化而来。
测定：
100μl浓度为1*10^-4M到5*10^-8M的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷与100μl缓冲溶液(40mM HEPES，pH7.6，0.015％Brjj，1mMDTT)、50μl赖氨酰丙氨酰氨基甲基香豆素溶液(5mM)以及20μl猪DPII(以缓冲液稀释250倍)相混合。在30℃、λ_激发＝380nm及λ_发射＝465nm处用读板器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)进行荧光测定。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)计算K_i值。K_i值计算为谷氨酰胺酰基吡咯烷K_i＝8.52*10^-5M±6.33*10^-6M，谷氨酰胺酰基噻唑烷K_i＝1.07*10^-5M±3.81*10^-7M。
实施例7：交叉反应酶
测定谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷对二肽基肽酶I、脯氨酰寡肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶的交叉反应能力。
二肽基肽酶I(DPI，组织蛋白酶C)
DPI或组织蛋白酶C是溶酶体半胱氨酸蛋白酶，它从其底物的N-端断裂二肽(Gutman，H.R.& Fruton，J.S.，1948，J.Biol：Chem.，174，851-858)。其为半胱氨酸蛋白酶类。
所用酶购自Qiagen(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)。为了使酶活性完全，将酶在MES pH5.6(40mM MES，4mM DTT，4mM KCl，2mMEDTA，0.015％ Brjj)缓冲液中稀释1000倍并在30℃保温30分钟。
测定：
50μl浓度为1*10^-5M到1*10^-7M的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷与110μl缓冲液-酶混合物相混合。试验混合物在30℃下预热15分钟。预热后，加入100μl组氨酰丝氨酰-β-硝基苯胺(2*10^-5M)并在30℃、λ_激发＝380nm及λ_发射＝465nm处用读板器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)测定10分钟由β-硝基苯胺释放引起的黄色显色。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)计算IC₅₀值。未发现谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷对DPI酶活性的抑制。
脯氨酰寡肽酶(POP)
脯氨酰寡肽酶(EC 3.4.21.26)是从Xaa-Pro键的N-端部分断裂下肽的丝氨酸型内蛋白酶(Walter，R.，Shalank，H.，Glass，J.D.，Schwartz，I.L.&Kerenyi，T.D.，1971，Science，173，827-829)。底物是分子量最高为3000Da的肽。
所用酶为重组人脯氨酰寡肽酶。重组表达在E.coli中于本领域别处所述的标准条件下进行。
测定：
100μl浓度为1*10^-4M到5*10^-8M的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷与100μl缓冲溶液(40mM HEPES，pH7.6，0.015％Brjj，1mMDTT)以及20μl POP溶液相混合。试验混合物在30℃下预热15分钟。预热后，加入50μl甘氨酰脯氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺溶液(0.29mM)并在30℃及λ＝405nm处用读板器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)测定10分钟由4-硝基苯胺释放引起的黄色显色。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)计算IC₅₀值。未发现谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷对POP活性的抑制。
氨酰基脯氨酸二肽酶(X-Pro二肽酶)
氨酰基脯氨酸二肽酶(EC 3.4.13.9)首先由Bergmann & Fruton进行描述(Bergmann，M.& Fruton，JS，1937，J.Biol.Chem.189-202)。氨酰基脯氨酸二肽酶从Xaa-Pro二肽酶释放N-端氨基酸且最适pH为6到9。
从猪肾获得的氨酰基脯氨酸二肽酶(ICN Biomedicals，Eschwege，Germany)溶于(1mg/ml)试验缓冲液(20mM NH₄(CH₃COO)₂，3mMMnCl₂，pH7.6)中。为使酶活性完全，将溶液在室温下保温60分钟。
测定：
450μl浓度为5*10^-3M到5*10^-7M的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷与500μl缓冲液(20mM NH₄(CH₃COO)₂，pH7.6)以及250μl Ile-Pro-OH(在试验混合物中浓度为0.5mM)。试验混合物在30℃下预热5分钟。预热后，加入75μl氨酰基脯氨酸二肽酶(在试验缓冲液中稀释为1∶10)，并在30℃及λ＝220nm处用紫外/可见分光光度计UV1(Thermo Spectronic，Cambridge，UK)测定20分钟。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)计算IC₅₀值。测定结果为谷氨酰胺酰基噻唑烷IC₅₀＞3mM，谷氨酰胺酰基吡咯烷IC₅₀＝3.4*10^-4M±5.63*10^-5M。
实施例8：血浆稳定性
为研究谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷在人血浆中的稳定性，在限定时间测定DPIV的活性。在人血浆中DPIV的平均活性测定为43.69U/ml。在工作溶液中，血浆用0.9％NaCl稀释以固定DPIV活性水平在25U/ml。
血浆与不同浓度(血浆中浓度为5*10^-5、2.5*10^-5和1.25*10^-5M)的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷在37℃下保温。在限定时间点用自动移液器(pipette roboter)(Gilson 215，Liquid handler，Gilson)取样，并转移至微量滴定板中。微量滴定板每孔含有5*10^-5M于0.9％NaCl+0.15％Brjj中的甘氨酰脯氨酰氨基甲基香豆素。反应6分钟后加入异亮氨酰噻唑烷(0.9％NaCl溶液中浓度为5*10^-5M)。
用读板器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)对血浆中0.9％NaCl(参考标准)进行荧光测定。谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷抑制活性的半衰期通过以酶活性对反应时间作图求算。
两种化合物的半衰期都不能够测定。认为该物质在人血浆内可稳定22小时以上。
实施例9：谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷向Wistar大鼠血管内和口服给药后的DPIV抑制活性
动物
雄性Wistar大鼠(Shoe：Wist(Sho))，体重为250到350g，购自TierzuchtSchonwalde(Schonwalde，Germany)。
饲养条件
在通常条件下每笼一只饲养，控制温度(22±2℃)，光照/黑暗周期为12/12小时(光照自上午06:00始)。自由饮食丸状固体食物(ssniff^Soest，Germany)和HCl酸化自来水。
颈总动脉插管
适应饲养条件≥1周后，对Wistar大鼠全身麻醉(i.p.注射0.25ml/kg b.w.Rompun^[2％]，BayerVital，Germany和0.5mg/kg b.w.Ketamin 10，AtarostGmbH & Co.，Twistringen，Germany)，颈总动脉插管。使动物恢复一周。导管用肝素-生理盐水(100IU/ml)每周冲洗3次。如果导管失效，在相应大鼠的相反一侧的颈总动脉再次插管。术后恢复一周后，该动物参与试验。若第二支管无效，该动物退出试验。采用一只新的动物且试验按照计划的顺序进行，在管埋植最少7天后开始试验。
试验设计
口服或血管内途径向导管功能完好的大鼠给药安慰剂(1ml生理盐水，0.154mol/l)或100mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基吡咯烷或100mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基噻唑烷。
整夜禁食后，在-30、-5和0分钟采集100ml加入肝素的动脉血样。试验物质刚溶解于1.0ml盐水(0.154mol/l)即在0分钟通过使用饲管(75mm；Fine Science tools，Heidelberg，Germany)口服或血管内途径给药。如果口服给药，再次向颈总动脉注射1ml生理盐水。如果动脉给药，导管直接用30μl生理盐水冲洗，再通过饲管口服1ml生理盐水。
在应用安慰剂或试验物质后，从清醒无约束大鼠动脉插管中在2.5、5、7.5、10、15、20、40、60和120分钟时采集动脉血样。所有血样收集在装有用于测定血浆DPIV活性的10μl 1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)的Eppendorf管(Eppendorf-Netheler-Hinz，Hamburg，Germany)中。将Eppendorf管马上离心(12000rpm，2分钟，Hettich Zentrifuge EBA 12，Tuttlingen；Germany)。血浆部分在分析前储藏于冰上或在-20℃冰冻。所有的血浆样品都贴上具有下列信息的标签：
●编码
●动物号码
●取样日期
●取样时间
分析方法
用于测定血浆DPIV活性的试验混合物含有80μl试剂和20μl血浆样品。30℃预热2分钟后，在309nm、30℃测定1分钟黄色产物4-硝基苯胺由底物甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺生成的动力学。DPIV活性用mU/ml表示。
统计方法
统计学评价及统计图表由PRISM^3.02(GraphPad Software，Inc)制作。所有的参数以说明性形式包括平均值和标准差进行分析。
结果
与安慰剂参比，100mg/kg b.w.剂量的化合物谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷在口服和血管内给药后抑制血浆DPIV活性(见图1和2)。
实施例10：脂肪性Zucker鼠口服谷氨酰胺酰基吡咯烷的剂量扩大试验动物
30只雄性Zucker大鼠(fa/fa)，平均年龄为11周(5-12周)，平均体重为350克(150-400g)，购自Charles River(Sulzfeld，Germany)。在交付之后，保存12周以上直至所有的脂肪性大鼠都表现出明显的糖尿病特征。每组8只动物用于考查3种谷氨酰胺酰基吡咯烷对安慰剂(生理盐水)的扩大剂量。
饲养条件
在通常条件下每笼一只饲养，控制温度(22±2℃)，光照/黑暗周期为12/12小时(光照自上午06:00始)。自由饮食无菌标准的丸状固体食物(ssniff^Soest，Germany)和HCl酸化自来水。
颈总动脉插管
年龄在24-31周(平均25周)脂肪性大鼠，适应饲养条件后，为试验进行充分准备。
对脂肪性Zucker大鼠全身麻醉(i.p.注射0.25ml/kg b.w.Rompun^[2％]，Bayer Vital，Germany和0.5mg/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH & Co.，Twistringen，Germany)，颈总动脉插管。使动物恢复一周。导管用肝素-生理盐水(100IU/ml)每周冲洗3次。
试验设计
向每组8只的脂肪性Zucker大鼠给药安慰剂(1ml生理盐水，0.154mol/l)或扩大剂量的谷氨酰胺酰基吡咯烷(5、15和50mg/kg b.w.)。将375mg谷氨酰胺酰基吡咯烷溶于1000μl DMSO(E.Merck，Darmstadt；Germany[二甲基亚砜p.a.])。加入10mg生理盐水，1ml含有34.09mg谷氨酰胺酰基吡咯烷的每等份储藏于-20℃。为制备试验物质，在生理盐水中稀释由剂量而定的等份。
整夜禁食后，在-10分钟向脂肪性Zucker大鼠通过饲管(15G，75mm；Fine Science Tools，Heidelberg，Germany)口服安慰剂或试验物质。在±0分钟时，通过第二根饲管给药含有2g/kg b.w.葡萄糖(40％溶液，B.Braun Melsungen，Melsungen，Germany)的口服葡萄糖耐受量试剂(OGTT)。用20μl玻璃毛细管在-30、-15、±0、5、10、15、20、30、40、60、90及120分钟从尾静脉采集静脉血样。将玻璃毛细管置于装有1ml用于测定血糖的溶液的标准试管中。
所有的血样都贴上标有下列信息的标签：
●编码
●动物号码
●取样日期
●取样时间
分析方法
葡萄糖水平用葡萄糖氧化酶法测定(Super G Glucose analyzer；Dr.Müller Gertebau，Freital，Germany)。
统计方法
统计学评价及统计图表由PRISM^3.02(GraphPad Software，Inc)制作。所有的参数以说明性形式包括平均值和标准差进行分析。
药剂对葡萄糖耐受量的作用
给药安慰剂的糖尿病Zucker大鼠显示出显著的高血糖偏移，说明具有明显糖尿病葡萄糖耐受性不良。给药5mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基吡咯烷可有限改善糖尿病Zucker大鼠的葡萄糖耐受量。给药15和50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基吡咯烷后实现了升高的血糖水平的显著降低以及葡萄糖耐受量的显著改善(见图3)。
实施例11：脂肪性Zucker鼠口服谷氨酰胺酰基噻唑烷的剂量扩大试验动物
30只雄性Zucker大鼠(fa/fa)，平均年龄为11周(5-12周)，平均体重为350克(150-400g)，购自Charles River(Sulzfeld，Germany)。在交付之后，保存12周以上直至所有的脂肪性大鼠都表现出明显的糖尿病特征。每组8只动物用于考查3种谷氨酰胺酰基吡咯烷对安慰剂(生理盐水)的扩大剂量。
饲养条件
在通常条件下每笼一只饲养，控制温度(22±2℃)，光照/黑暗周期为12/12小时(光照自上午06:00始)。自由饮食无菌标准的丸状固体食物(ssniff^Soest，Germany)和HCl酸化自来水。
颈总动脉插管
年龄在24-31周(平均25周)脂肪性大鼠，适应饲养条件后，为试验进行充分准备。
对脂肪性Zucker大鼠全身麻醉(i.p.注射0.25ml/kg b.w.Rompun^[2％]，Bayer Vital，Germany和0.5mg/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH & Co.，Twistringen，Germany)，颈总动脉插管。使动物恢复一周。导管用肝素-生理盐水(100IU/ml)每周冲洗3次。
试验设计
向每组8只的脂肪性Zucker大鼠给药安慰剂(1ml生理盐水，0.154mol/l)或扩大剂量的谷氨酰胺酰基噻唑烷(5、15和50mg/kg b.w.)。相应量的谷氨酰胺酰基噻唑烷溶于1000μl生理盐水中。整夜禁食后，在-10分钟向脂肪性Zucker大鼠通过饲管(15G，75mm；Fine ScienceTools，Heidelberg，Germany)口服安慰剂或试验物质。在±0分钟时，通过第二根饲管给药含有2g/kg b.w.葡萄糖(40％溶液，B.BraunMelsungen，Melsungen，Germany)的口服葡萄糖耐受量试剂(OGTT)。用20μl玻璃毛细管在-30、-15、±0、5、10、15、20、30、40、60、90及120分钟从尾静脉采集静脉血样。将玻璃毛细管置于装有1ml用于测定血糖的溶液的标准试管中。
所有的血样都贴上标有下列信息的标签：
●编码
●动物号码
●取样日期
●取样时间
分析方法
葡萄糖水平用葡萄糖氧化酶法测定(Super G Glucose analyzer；Dr.Müller Gertebau，Freital，Germany)。
统计方法
统计学评价及统计图表由PRISM^3.02(GraphPad Software，Inc)制作。所有的参数以说明性形式包括平均值和标准差进行分析。
药剂对葡萄糖耐受量的作用
给药安慰剂的糖尿病Zucker大鼠显示出显著的高血糖偏移，说明具有明显糖尿病葡萄糖耐受性不良。给药5mg/kg b.w.、15mg/ml以及50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基噻唑烷可剂量依赖性降低糖尿病Zucker大鼠升高的血糖水平以及改善葡萄糖耐受量(见图4)。
实施例12：Wistar大鼠口服给药谷氨酰胺酰基噻唑烷后的体内灭活
动物/试验设计
如实施例9所述，向Wistar大鼠口服给药谷氨酰胺酰基噻唑烷。
分析方法
在应用安慰剂或谷氨酰胺酰基噻唑烷后，从清醒无约束的大鼠的颈动脉插管中在2.5、5、7.5、10、15、20、40、60和120分钟时采集动脉血样，用以测定谷氨酰胺酰基噻唑烷降解产物的生成。
采用C18盒(cartridge)以简单固相萃取法由血浆中分离所需的化合物用于分析。萃取物用Lichrospher 60 RP Select B柱以反相液相色谱法串连APCI正状态下工作的质谱分析进行分析。采用内标法定量。
结果
Wistar大鼠口服给药谷氨酰胺酰基噻唑烷后，发现化合物的降解产物。采用LC/MS法可确定该降解产物为焦谷氨酰胺酰基噻唑烷。见图5和6。