冰植物的乙烯应答结合蛋白转录因子及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明涉及植物转录因子及其编码基因与应用，特别是来源于冰植物的转录因子及其编码基因与应用。背景技术
病原、干旱、盐碱、低温等生物与非生物环境胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响。在逆境胁迫环境下，植物体内通常会发生一系列的生理生化特性变化。植物先是通过多种途径感受外界环境的变化，并将细胞外的信号转移到细胞内部，经过一系列磷酸化级链式反应将信号传递给转录因子，转录因子再通过其特异性功能氨基酸与目的基因相互作用，启动对逆境胁迫产生应答的目的基因表达，从而提高植物的抗性。例如，含有ERF功能保守域的ERF类转录因子地某些基因能接受环境胁迫信号并启动逆境应答基因，使得植物抗性提高。已经证实，乙烯是胁迫应答的调节因子之一，胁迫因子诱导乙烯在植物体内的合成，一些受乙烯诱导的与防卫有关的基因能够与一个抗病原基因表达所需要的GCC合子核心序列结合，并启动抗病基因的表达以达到作物的抗逆效果，尤其是在抗植物菌斑病方面有着良好的特性表现。
冰叶松叶菊属的冰叶日中花，简称冰植物(Mesembryanthemum crystallinum)，是一种来源于非洲的草本植物，具有储存汁液的功能，从分子生物学的角度研究冰植物的抗逆特性，具有重要的理论及现实意义。发明内容
本发明的目的是提供来源于冰植物的乙烯应答结合蛋白转录因子及其编码基因，该转录因子具有较强的抗逆以及抗病效果。
本发明所提供的乙烯应答结合蛋白转录因子的名称为McEREB，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由282个氨基酸残基组成的蛋白质。所述序列2中自碳端到氮端第137-195个氨基酸残基是转录因子McEREB的ERF功能保守域。
乙烯应答结合蛋白转录因子McEREB的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中序列1的DNA序列；
2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1205个碱基组成，该基因的读码框为第113到第959位碱基，其表达主要受乙烯、干旱、低温以及高盐的瞬时诱导。
用本发明所提供的编码转录因子McEREB的基因，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体转化植株，可获得对干旱、低温和高盐胁迫耐受力得到增强的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记。携带有本发明McEREB基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。
可使用包括本发明McEREB基因的植物表达载体转化植物宿主，既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，培育抗旱、抗寒和抗盐的植物品种。本发明的基因对培育抗逆植物品种，进而改善生态环境条件，普及城乡绿化具有重要意义。附图说明
图1为McEREB基因在大肠杆菌中的体外表达。
图2为Southern杂交分析结果。
图3为不同胁迫条件下Northern杂交检测的McEREB基因表达特征。具体实施方式
实施例1、冰植物McEREB转录因子cDNA的克隆与序列结构分析
长10天的冰植物幼苗经洗净后在室温下置于足够厚度的滤纸上脱水5小时，收集植株于液氮中研磨至精细程度，置于4mol/L异硫氰酸胍中，再用酸性苯酚/氯仿抽提混合物，取上清液，用异丙醇沉淀总RNA，再重复上述步骤一次，将RNA溶于DEPC水中，保存于-80℃(Davis等编著，分子生物学的基本方法：[Basic Methods inMolecular Biology]，pp.777，APPLETON & LANCE，Norwalk，Connecticut，USA，1994)。
取1微克总RNA通过12对特异简并性引物进行PCR扩增反应(引物中I代表次黄苷)。4条对应于AP2/REBP保守域N-端的5’-YRGVR-3’正向引物(Forward primers)是：
DF1：5’-TA(C/T)CGIGGIGTICGI-3’
DF2：5’-TA(C/T)AG(A/G)GGIGTICGI-3’
DF3：5’-TA(C/T)AG(A/G)GGIGTIAG(A/G)-3’
DF4：5’-TA(C/T)CGIGGIGTIAG(A/G)-3’
4条对应于AtERF-1和AtERF-2的AP2/EREBP保守域C-端的反向引物5’-ALLNFP-3’Reverse primers)是：
DR1：5’-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAGICGIGC-3’
DR2：5’-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAG(C/T)CTIGC-3’
DR3：5’-IGG(A/G)AA(A/G)TT(T/C)AA(T/C)CTIG C-3’
DR4：5’-IGG(A/G)AA(A/G)TT(T/C)AAICGIGC-3’
PCR条件为：4℃，3分；94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1.5分，30循环；72℃，10分；4℃保存。PCR产物连接到pMD18-T载体上用于测序，再以阳性克隆为模板利用一对特异性引物DFR：5’-CCGGACACCGCGGTAGTG-3’和DRF：5’-GCATTGTTGAAC TTTCCG-3’通过逆转录PCR反应扩增目的基因的5’端以及3’端。然后体外包装Invitro-McEREB基因序列，再设计一对特异性引物McF：5’-ATGAGCTTAATCG CCAAT-3’McR：5’-AGTAACTAATAACTGATC-3’扩增McEREB-cDNA，PCR产物连接于pMD18-T载体进行测序，得到了一个与体外包装序列完全一致的cDNA克隆，命名为McEREB，为序列表中的序列1。该基因插入片段为1205bp，含有846bp的开放阅读框架(113起始-959终止)，编码282个氨基酸残基组成的多肽(序列表中的序列2)，其5’端为112bp，3’端非编码区为282bp。该基因含有一个典型的AP2/EREBP保守结构域，该结构域能够与乙烯应答元件GCC合子核心的顺式作用元件相互作用而启动目的抗逆基因的表达。
实施例2、冰植物McEREB基因在大场杆菌中的体外表达鉴定
根据克隆出的McEREB基因序列，利用一对特异性引物McF：377 5’-AAAAGAATTCCAATCCGGGTCAGAATCC-3’394和McR：895 5’-AAAACTCGAGTTGCATTCCCTCCACCAC-3’878，通过PCR得到一段包含AP2/EREBP保守域的cDNA片段(519bp)，并将其插入到蛋白表达载体pGEX-4T-1的相应EcoRI和XhoI位点，转化该融合表达载体于大肠杆菌中，经IPTG在大肠杆菌中诱导，SDS-PAGE检测表明该基因能够在大肠杆菌中进行体外翻译表达，聚丙烯凝胶电泳谱带如图1所示，M是Marker；1、2是经诱导的菌株；3是未经诱导的菌株。从图1中可以看出，经诱导的菌株有蛋白条带出现，未经诱导的菌株没有蛋白条带出现。
实施例3、McEREB基因在冰植物中的拷贝数量分析
利用经同位素磷-32标记的McEREB cDNA编码区为探针与经不同限制性内切酶(EcoRV、PstI、XhoI、SalI)消化的冰植物基因组DNA进行Southern杂交分析，并经高严谨度洗膜，结果如图2所示，除了EcoRV外每一种消化的DNA出现一条杂交带，表明McEREB基因是一个单拷贝基因或者在基因组中有低拷贝的同源基因。
实施例4、冰植物McEREB基因在逆境胁迫条件下的表达特征。
生长2个星期的冰植物幼苗分别置于4℃水、250mM NaCl的水溶液以及2mM的乙烯溶液中进行光照培养，干旱处理是将生长2个星期的冰植物幼苗经水洗净后置于足以吸干水分的滤纸上在室温下脱水，并分别在1小时，5小时，12小时以及24小时取样，提取总RNA与McEREB cDNA探针进行Northern杂交检测分析。结果如图3所示，其中A是干旱处理的结果，B是4℃低温处理的结果，C是250mM NaCl处理的结果，D是2mM乙烯处理的结果，从图3中可以看出，基因McEREB的转录主要受乙烯与盐诱导，并不同程度受干旱以及低温的瞬时诱导。
序列表<160>2<210>1<211>1205<212>DNA<213>冰叶松叶菊属冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)<400>1cttacgtgaa acaaaattca attcaaattc aacggcttta agctgaaatt tgcgatacgc 60aattcaaaat ttacattttt gagctgaatt cgccaatact cagttggtaa agatgagctt 120aatcgccaat ttcgagtctg attttgctgt tcttgagtcg attcgacgac acttgttaga 180agattgggac ccacgagccg gagctccggc gataaccacc ggatccggcc cggtttatca 240ccggaattcg agcttcagca gcttataccc ttgtttgact gataactggg gtgagttgcc 300attgaaagaa gatgattcag aggatatggt tctttttggt gtgctccgag acgccgttca 360taccgggtgg tcgccgcaat ccgggtcaga atccgggtcc gggtctccgg cgccggtgac 420ggtcaagcct gagccggtcg attctccggt gagttcgccg gcgccggtta gggtcgccgg 480cggtgaggct ccggtggccg cagctccggc gagggggaag cactaccgcg gtgtccggag 540gaggccgtgg gggaagttcg cggctgagat ccgcgaccct gcgaagaacg gagcgcgtgt 600gtggctcgga acatttgaga cggcggagga cgcggcgttg gcctatgaec gggccgcctt 660ccggatgcgg gggtccaagg cattgttgaa ctttccgctc cgggtcaact cgggcgagcc 720cgacccggtc cggattacgt cgaagcggtc ctcgcccgag aggtccgtgt cgtcttcgtc 780gtcggaaagc gcctcgccta agaggaggaa gaaggaggag gtggtggttg ggccggtggc 840gggccaggcc aggccaggct tacaacaagt gggaaatgtg gtggagggaa tgcaagtggg 900agtgggatgt caagttggtg tggggacaat gccacttggc gatcagttat tagttactta 960agatattata aaaaaacaaa aaaaggaaag ggggtttgaa agaatggaat tctcattggg 1020gggaaaggtg atggccctta taaaaaaaac ctttcctggt ctcttaatga aaggccgctt 1080ttagggcagc acaaatcctc tgctagcaga gaattcggca cgaggctctg ctccatggag 1140tagtaggaat aaacactgtg ctagccggct aggtattggt gcaagtgcaa aaaaaaaaaa 1200aaaaa 1205<210>2<211>282<212>PRT<213>冰叶松叶菊属冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)<400>2Met Ser Leu Ile Ala Asn Phe Glu Ser Asp Phe Ala Val Leu Glu
5 10 15Ser Ile Arg Arg His Leu Leu Glu Asp Trp Asp Pro Arg Ala Gly
20 25 30Ala Pro Ala Ile Thr Thr Gly Ser Gly Pro Val Tyr His Arg Asn
35 40 45Ser Ser Phe Ser Ser Leu Tyr Pro Cys Leu Thr Asp Asn Trp Gly
50 55 60Glu Leu Pro Leu Lys Glu Asp Asp Ser Glu Asp Met Val Leu Phe
65 70 75Gly Val Leu Arg Asp Ala Val His Thr Gly Trp Ser Pro Gln Ser
80 85 90Gly Ser Glu Ser Gly Ser Gly Ser Pro Ala Pro Val Thr Val Lys
95 100 105Pro Glu Pro Val Asp Ser Pro Val Ser Ser Pro Ala Pro Val Arg
110 115 120Val Ala Gly Gly Glu Ala Pro Val Ala Ala Ala Pro Ala Arg Gly
125 130 135Lys His Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Pro Trp Gly Lys Phe Ala
140 145 150Ala Glu Ile Arg Asp Pro Ala Lys Asn Gly Ala Arg Val Trp Leu
155 160 165Gly Thr Phe Glu Thr Ala Glu Asp Ala Ala Leu Ala Tyr Asp Arg
170 175 180Ala Ala Phe Arg Met Arg Gly Ser Lys Ala Leu Leu Asn Phe Pro
185 190 195Leu Arg Val Asn Ser Gly Glu Pro Asp Pro Val Arg Ile Thr Ser
200 205 210Lys Arg Ser Ser Pro Glu Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Ser Glu
215 220 225Ser Ala Ser Pro Lys Arg Arg Lys Lys Glu Glu Val Val Val Gly
230 235 240Pro Val Ala Gly Gln Ala Arg Pro Gly Leu Gln Gln Val Gly Asn
245 250 255Val Val Glu Gly Met Gln Val Gly Val Gly Cys Gln Val Gly Val
260 265 270Gly Thr Met Pro Leu Gly Asp Gln Leu Leu Val Thr
275 280 282