一种建立草地早熟禾基因转化体系的方法 【发明领域】
本发明涉及农业生物技术领域或植物基因工程领域，更具体地说，本发明涉及一种建立草地早熟禾基因转化体系的方法，包括灭菌和萌发，胚性愈伤组织诱导继代分化培养和小苗生根及试管苗移栽等步骤；应用该方转化体系在建立转基因抗旱草地早熟禾中的用途和应用该转化体系得到的转基因抗旱草地早熟禾。发明背景
草地早熟禾(Poa pratensis L.)为禾本科早熟禾属多年生草坪草，是重要的经济作物。据统计，我国城镇人口户均拥有草坪面积不足10平方米，而美国九十年代已拥有草坪2亿公顷，包括5000多万块草坪，1.5万个高尔夫球场，6442个草坪公园，美国户均拥有草坪800平方米，草坪业已成为与电子技术、生物技术、航天技术等并列的全美十大支柱产业之一。随着我国人民生活水平的日益提高，对城市环境的要求标准也越来越高，草坪业在我国将会有很好的发展前景。草地早熟禾作为草坪应用的主要草种第一批进入了《中华人民共和国农业植物新品种保护名录》。由此可见通过遗传工程技术改良草地早熟禾具有重大的意义。草地早熟禾属于冷季型草种，虽然它具有绿期长的优良特性，但抗逆性差。因而在草坪养护和管理中需投入大量肥料，经常施药，喷灌大量水分。我国的大中城市普遍缺水，并且大量使用肥料及除草剂等农药也使城市的环境遭到破坏。所以迫切需要提高草地早熟禾的抗逆性以减少肥料、农药的使用，节省宝贵的水资源。这样才能既美化环境，又不以破坏环境为代价。随着生物技术的发展，利用外源基因改造植物抗逆性的技术已经成熟，而要得到转基因抗逆草地早熟禾的关键就是要建立起高效草地早熟禾转化体系。
国内外早熟禾转化体系虽有报道，但大多体系转化效率较低。1999年复旦大学马忠华等将抗除草剂基因转入草地早熟禾其愈伤组织诱导频率为89.0％，再生频率为50.0％(复旦大学学报，38卷第5期1999)。韩国东国大学LEE，Jae Sin(Korean J.Plant Tissue Culture，2001)等做了Kentucky Blue胚性愈伤组织的诱导和分化的工作，其方法较复杂且重复性差。
七十年代末转基因技术飞速的发展起来，至今相继通过农杆菌，基因枪，PEG，电击法，激光离子束等方法都得到了转化地植物细胞。Sanford等于1987年用基因枪轰击法转化洋葱表皮细胞获得成功。此后基因枪轰击法得到广泛的应用，该方法受体广泛，可以是外植体(幼穗、幼胚或成熟胚)、愈伤组织或悬浮细胞等，操作相对简单，效果较好。1999年复旦大学马忠华等应用此方法将抗除草剂基因PPT转入草地早熟禾。但该方法成本高，转化频率欠佳，转基因后代发生基因沉默的频率高。
农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，1907年人们发现它是植物致瘤的起因，植物细胞被侵染后，形成肿瘤。能够诱发冠瘿瘤的称为根癌农杆菌，诱导毛发状根的称为发根农杆菌。受感染的细胞可产生正常细胞所不能产生的生物碱-冠瘿碱，被农杆菌利用作为碳源和氮源。经过持续不断的基础研究，直到1974年，发现在根癌和发根农杆菌中分别有一种环型的Ti或Ri质粒，质粒上的一段T-DNA(转移DNA)包含有生长素基因和细胞分裂素基因，它可以插入植物基因组从而引起细胞特性的变化。由于T-DNA能够进行高频率转移，而且Ti质粒上可插入大到50kb的外源DNA，因此可以利用这种天然的遗传转化体系，将外源DNA转移到植物细胞，并利用植物细胞的全能性，经过细胞或组织培养，由一个转化细胞再生成完整的转基因植物。在迄今发展起来的转基因技术中，农杆菌介导的遗传转化占据主导地位，应用最为广泛，特别是在双子叶植物上尤其普遍。近几年来农杆菌转化在水稻等谷类作物上取得成功，其应用范围将进一步扩大。农杆菌介导的优点是转化频率高，可转移较大的DNA片段，所转移DNA很明确地为T-DNA左右边界之间的序列，并可直接用不同的植物组织进行基因转移，不需要原生质体培养再生植株的技术，从而缩短转育周期。发明内容
本发明的目的是提供一套建立草地早熟禾转基因转化体系的方法，它可有效地克服草地早熟禾基因型的制约，而从绝大多数基因型的培养细胞再生出转基因植株，且诱导和再生频率高，再生植株性状变异小，取材不受季节限制。
因此，在本发明的一方面，提供了一种建立草地早熟禾基因转化体系的方法，包括灭菌和萌发，胚性愈伤组织诱导继代分化培养和小苗生根及试管苗移栽等步骤。
在本发明的另一方面，提供了一种上述草地早熟禾转化体系在建立转基因抗旱草地早熟禾中的用途。
在本发明的另一方面，提供了一种转基因抗旱草地早熟禾，其是通过应用该草地早熟禾转化体系而得到的。
另外，需要指出的是，在本申请说明书的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和其它具有创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。附图简要说明
图1是本发明的胚性愈伤组织的照片。
图2是本发明的愈伤组织分化成苗的照片。
图3是本发明的转基因植株的总DNA的PCR产物电泳照片，其中A：阳性植株，B：阴性植株，C：质粒。
图4是本发明的PCR检测为阳性的转基因植株的DNA的Southern Blot结果的照片，其中A：质粒，B：阳性植株，C：阴性植株。具体实施方式
本发明建立草地早熟禾转基因转化体系的方法包括以下步骤：
①灭菌和萌发；②愈伤组织诱导继代分化培养；以及③小苗生根及试管苗移栽。
以上相关培养中采用的培养基包括：基本培养基MS培养基、愈伤组织诱导培养基、分化培养基、生根培养基、壮苗培养基。
基本培养基为MS培养基：KNO31900mg/l，NH4NO31650mg/l，CaCl2·2H2O440mg/l，MgSO4·7H2O370mg/l，KH2PO4170mg/l，KI0.83mg/l，H3BO36.2mg/l，MnSO4·4H2O22.3mg/l，ZnSO4·7H2O8.6mg/l，Na2MoO4·2H2O0.25mg/l，CoCl2·6H2O0.025mg/l，Na2-EDTA37.3mg/l，FeSO4·7H2O27.8mg/l，CuSO4·5H2O0.025mg/l，蔗糖30g/l，肌醇100mg/l，烟酸0.5mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，甘氨酸2.0mg/l，盐酸硫铵等0.4mg/l，卡拉胶6g/l，ph＝5.8。
愈伤组织诱导培养基是指基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1-5mg/l用于诱导胚性愈伤组织。
分化培养基是指基本培养基附加激动素(KT)1-3mg/l，用于促使愈伤组织分化出苗。
生根培养基是指基本培养基附加吲哚丁酸(IBA)0.1-0.2mg/l用于促进小苗生根。
壮苗培养基是指基本培养基的大量元素(KNO3，NH4NO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4)减半，其它成分不变，用来使试管苗强壮。
灭菌和萌发技术是指将草地早熟禾种子用纱布包好放入70％的乙醇溶液浸泡30秒，取出放入0.1％氯化汞溶液中消毒5-15分钟，然后用无菌水冲洗3遍，其中第一遍和第二遍要快速振荡冲洗以除去大部分残留的氯化汞，第三遍要将种子浸泡在无菌水中5-15分钟左右，这样才能彻底清除残留的氯化汞，避免种子发芽点受损影响发芽率。通过在MS基本培养基上进行发芽实验，得到的结果是：经过这种严格的灭菌和冲洗污染率为0.001％，发芽率高达90.4％。
愈伤组织诱导继代分化技术是指将消毒后的种子接入愈伤组织诱导培养基上，暗培养，20天左右从种子根部膨大出白或淡黄色的愈伤组织，直径约为1-2mm。每20天用愈伤组织诱导培养基继代培养一次，注意培养基中不能有多余的水，如果有，应用无菌滤纸将水分吸干，以保持培养基表面干燥，否则易形成粘液化的愈伤组织，这种愈伤组织难以分化。在此后的60天中愈伤组织外表逐渐干燥并变成致密的黄色颗粒状，用镊子将其压碎后可见葡萄状排列的直径0.2-0.5mm的小颗粒，这种状态的愈伤组织为胚性愈伤组织。一般在此时进行转基因。将转基因的胚性愈伤组织接入到愈伤组织分化培养基上，25℃光照培养10-20天左右愈伤组织上出现绿色芽点，并进而分化出小芽，本发明中愈伤组织诱导率为91％(本发明中愈伤组织诱导率＝愈伤组织数/接种种子数)，分化率约为80％(本发明中愈伤组织分化率＝出现绿色芽点的愈伤组织数/接种的愈伤组织数)。
小苗生根技术是指将分化出来小芽的愈伤组织切成小块，每块愈伤组织上有2-3个芽，接入生根培养基中。光照培养2000-3000LX，14-20小时/天。三周左右大部分小苗开始生根，未生根的小苗将根部切伤接入新的生根培养基中，大部分会生根。
试管苗移栽技术是指的是根长到2-3cm时，接入壮苗培养基中培养至出现3-4个分蘖，洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中，植株在自然光下生长，日温22-28℃夜温15-21℃，隔天浇灌1/2MS培养基无机盐成分KNO3，NH4NO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。
以上所限定的早熟禾转基因转化体系可选用基因枪轰击法、农杆菌介导法进行遗传转化，通过筛选获得转基因细胞进而再生出转基因植株。
本发明利用草地早熟禾转基因转化体系进行转基因的应用：
(一)以农杆菌为中介进行遗传转化
将带有双元载体(Ti质粒带有卡那霉素抗性基因)的根癌农杆菌(如LB4404，EHA101)在附加抗生素卡那霉素150mg/l，利福平20mg/l的YEP培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物10g NaCl10g pH7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110转/分，使其处于对数生长期。用MS培养基稀释5-10倍，添加乙酰基丁香酮50-200μmol/l，用于转化。
取在愈伤组织诱导培养基培养60天左右的胚性愈伤组织放入含乙酰基丁香酮100mg/l的农杆菌菌液(OD值0.5)中浸染10-60分钟。
浸染后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于基本培养基上黑暗恢复培养2天。
将愈伤组织转入附加头孢霉素250mg/l的愈伤组织分化培养基上，抑制细菌生长。将抑菌后的愈伤组织转入加有卡那霉素(150mg/l)的愈伤组织分化培养基上，每2周继代一次，选择存活材料转移。筛选3代后只有少数存活。将其转入无选择剂的愈伤组织分化培养基中，长出健壮小苗。
小苗长到3-4片叶子时转入生根培养基中生根，根系发达后的植株移栽到花盆成活后，取叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。
(二)采用基因枪轰击法转化愈伤组织
1、DNA包裹微弹和基因枪轰击
(1)从宿主中提取带有目的基因的质粒，提取和纯化采用标准程序和方法(参见《分子克隆》第二版)。质粒质量为OD260 1.7-1.8之间。质粒DNA浓度稀释为1μg/μl，于-20℃保存备用。
(2)60mg钨粉放在离心管中加无水乙醇，用超声波粉碎机超声至手感温度发烫。
(3)离心，弃掉上清液。加1ml无水乙醇，旋涡振荡3-5分钟。静置1分钟。离心弃掉上清液。
(4)加入1ml消毒蒸馏水，旋涡振荡，离心沉淀，弃尽上清液(重复3次)。
(5)在沉淀的钨粉中加入50％的甘油，浓度为60mg/ml。
(6)振荡在50％甘油中的钨粉，使之成为悬浮液。取50μl悬浮液于离心管中(可打6枪)。
(7)取一个小管在液体上的壁处加入5-10μl质粒DNA(浓度为lμg/μl)振荡30秒，再在小管壁上加入20μl亚精胺(0.1M)，振荡30秒边振荡边加入50μl旋涡振荡30秒-1分钟，静置一分钟，离心沉淀，弃掉上清液。加入150μl 70％乙醇吹打沉淀使沉淀均匀分开，离心(3000转10秒)，去掉上清加入150μl无水乙醇，不破坏沉淀，静置1分钟，弃上清液。
(8)加入60μl无水乙醇振荡使其成悬浮液，加样器取样10μl分别滴在钢膜上，制成子弹。
用基因枪轰击愈伤组织，每皿轰击一次轰击参数：可裂膜与载体距离2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离7cm，其他参数见宁波新芝科器研究所产品型号为GJ-1000的说明书。
2、转化后材料的筛选和培养
(1)轰击后的材料在黑暗中恢复培养2-3天，然后将材料转入成分相同的新培养基中培养3周以使转入的基因表达。
(2)将愈伤组织转入加有卡那霉素的愈伤组织分化培养基上，每2周继代一次，选择存活材料转移。筛选3代后只有少数存活。将其转入无选择剂的愈伤组织分化培养基中，长出健壮小苗。
小苗长到3-4片叶子时转入生根培养基中生根，根系发达后的植株移栽到花盆成活后，取叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。
本发明农杆菌转染法基本同石田(Ishida)等报道的(Nat Biotechnol.1996 Jun；14(6)：745-50)。在转染液添加乙酰基丁香酮，浸染10-60分钟。要在黑暗中进行恢复培养，然后才能进行筛选。
本发明中基因枪轰击法(particle bombardment)是借助高速度的金属微粒将核酸分子引入活细胞的一种遗传转化技术。本发明所用的基因枪为宁波新芝科器研究所产品，型号为GJ-1000。除特殊说明外操作参数基本同本仪器说明书。
本发明中胚性愈伤组织是指愈伤组织生长到一定阶段所形成的易分化状态，草地早熟禾的愈伤组织为淡黄或黄色，表面呈颗粒状突起。胚性愈伤组织转入分化培养基能再生出大量植株。
本发明所提供的草地早熟禾转化体系高效可靠，可重复性强，具有广泛的应用前景，是利用基因改造草地早熟禾的关键技术。
下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例实施例1用农杆菌转染法将SacB基因转化草地早熟禾中得到抗旱草地早熟禾
1.目的基因及载体的构建：含有SacB基因的pKP质粒(见专利申请号98101336.8)由章银梅教授惠赠。pKP质粒含有水稻CAMV35S启动子，液泡定位引导序列CPY基因，卡那霉素抗性基因和来自枯草杆菌的SacB基因。
2.转化草地早熟禾：草地早熟禾种子用纱布包好放入70％的乙醇溶液浸泡30秒，取出放入0.1％氯化汞溶液中消毒5-15分钟，然后用无菌水振荡冲洗3-6遍。将消毒后的种子接入愈伤组织诱导培养基上，暗培养，20天左右从种子根部膨大出白或淡黄色的愈伤组织(见图1)。每20天用愈伤组织诱导培养基继代培养一次，得到胚性愈伤组织。接入种子200粒得到愈伤组织182块，愈伤组织诱导率为91％，出现绿色芽点的愈伤组织165块，分化率约为80％。
3.基因转化：取在愈伤组织诱导培养基培养60天左右的胚性愈伤组织放入含乙酰基丁香酮(100mg/l)的农杆菌菌液(OD值0.5)中浸染20分钟。浸染后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于基本培养基上黑暗恢复培养2天；将愈伤组织转入附加头孢霉素250mg/l的愈伤组织分化培养基上，抑制细菌生长。将抑菌后的愈伤组织转入加有卡那霉素(150mg/l)的愈伤组织分化培养基上，每2周继代一次，选择存活材料转移。
4.转基因苗的获得：筛选3代后只有少数存活。将其转入无卡那霉素的愈伤组织分化培养基中，长出健壮小苗(见图2)。小苗长到3-4片叶子时转入生根培养基中生根，根系发达后的植株移栽到花盆成活后，取叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。
5.转基因植株的鉴定：提取植物总DNA进行PCR检测，PCR引物为根据SacB基因设计的两个引物：
5’-gatctagAAAGAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG，
3’-cagtcgaccTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC。
PCR结果参见附图3。
对PCR检测为阳性植株的DNA进行适当的内切酶切割、电泳、转膜，然后进行Southern杂交，杂交探针为同位素标记的卡那霉素抗性NPT II基因(方法见《分子克隆(二)》)。Southern杂交显示阳性信号者(参见附图4)，被确定为转基因植株。其中检测30株显示阳性12株信号，转化频率40％。
转基因植株植入大田繁殖，由于草地早熟禾属无融合生殖，所以转基因植株所得的种子为转基因种子。实施例2采用基因枪轰击法转化愈伤组织
1、DNA包裹微弹和基因枪轰击
(1)从宿主大肠杆菌E.coli DH5α中提取带有SacB的质粒pKP，提取和纯化采用标准程序和方法(参见《分子克隆》第二版)。质粒质量为OD2601.7-1.8之间。质粒DNA浓度稀释为1μg/μl，于-20℃保存备用。
(2)60mg钨粉放在离心管中加无水乙醇，用超声波粉碎机超声至手感温度发烫。
(3)离心，弃掉上清液。加1ml无水乙醇，旋涡振荡3-5分钟。静置1分钟。离心弃掉上清液。
(4)加入1ml消毒蒸馏水，旋涡振荡，离心沉淀，弃尽上清液(重复3次)。
(5)在沉淀的钨粉中加入50％的甘油，浓度为60mg/ml。
(6)振荡在50％甘油中的钨粉，使之成为悬浮液。取50μl悬浮液于离心管中(可打6枪)。
(7)取一个小管在液体上的壁处加入5-10μl质粒DNA(浓度为1μg/μl)振荡30秒，再在小管壁上加入20μl亚精胺(0.1M)，振荡30秒边振荡边加入50μl旋涡振荡30秒-1分钟，静置一分钟，离心沉淀，弃掉上清液。加入150μl 70％乙醇吹打沉淀使沉淀均匀分开，离心(3000转10秒)，去掉上清加入150μl无水乙醇，不破坏沉淀，静置1分钟，弃上清液。
(8)加入60μl无水乙醇振荡使其成悬浮液，加样器取样10μl分别滴在钢膜上，制成子弹。
2、用基因枪轰击愈伤组织，每皿轰击一次轰击参数：可裂膜与载体距离2-2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8-1cm，微弹飞行距离7-10cm，其他参数见宁波新芝科器研究所产品型号为GJ-1000的说明书。
3、转化后材料的筛选和培养
(1)轰击后的材料在MS培养基黑暗中恢复培养2-3天，然后将材料转入成分相同的新培养基中培养3周以使转入的基因表达。
(2)将愈伤组织转入加有卡那霉素150mg/l的愈伤组织分化培养基上，每2周继代一次，选择存活材料转移。筛选3代后只有少数存活。将其转入无选择剂的愈伤组织分化培养基中，长出健壮小苗。
小苗长到3-4片叶子时转入生根培养基中生根，根系发达后的植株移栽到花盆成活后，取叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。
4.转基因植株的鉴定：提取植物总DNA进行PCR检测，PCR引物为根据SacB基因设计的两个引物：
5’-gatctagAAAGAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG，
3’-cagtcgaccTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC。
对PCR检测为阳性植株的DNA进行适当的内切酶切割、电泳、转膜，然后进行Southern杂交，杂交探针为同位素标记的NPT II基因。Southern杂交显示阳性信号者，被确定为转基因植株。检测50株，显示阳性19株，转化效率38％。