一种商品型亲和层析柱的制备及使用方式.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200310115050.6

申请日:

2003.11.24

公开号:

CN1621122A

公开日:

2005.06.01

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

IPC分类号:

B01D15/08; C07K1/22

主分类号:

B01D15/08; C07K1/22

申请人:

北京中天康泰生物科技有限公司;

发明人:

韩苏

地址:

100029北京市朝阳区惠新东街8号院2号楼801室

优先权:

专利代理机构:

代理人:

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内容摘要

本发明涉及应用可特异性地识别热休克蛋白的抗体来制备一种商品型亲和树脂和亲和层析柱,其目的是为了方便从蛋白混杂的液体中快速、简便、高效、特异性地提取出热休克蛋白(heat shock protein简写HSP)及与热休克蛋白(HSP)非共价结合的多肽抗原分子群所形成的热休克蛋白-多肽复合体(heat shock protein peptide complexes简称HSPPC)。

权利要求书

1.  制备一种可从杂蛋白溶液中快速、简便和特异性地提取出人HSP-60蛋白的亲和层析柱所使用的树脂填料及其成品柱。

2.
  制备本亲和层析柱的树脂填料可为任何可特异性地识别和结合HSP-60蛋白的树脂。

3.
  本亲和层析柱填料使用的树脂可以是偶联了可识别和结合HSP-60蛋白的一种或多种抗体,它们可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

4.
  本亲和层析柱填料使用的树脂可不仅偶联了抗人或哺乳类动物HSP-60蛋白抗体,还可同时偶联识别和结合人或哺乳类动物热休克蛋白家族中其它蛋白的抗体,如HSP-27、HSP-40、HSP-70、HSP-90、HSP-110、gp-96等蛋白的抗体。它们可以是单克隆或多克隆抗体。

5.
  亲和层析柱填料使用的树脂可以是偶联了可识别和结合人或哺乳类动物热休克蛋白家族中任意单一的一种或不同的几种蛋白的抗体,所用抗体可以是单克隆或多克隆抗体。

6.
  制备完成了的亲和树脂可直接使用不易破损、防干燥、避光的容器或薄膜密封包装并保存在低温环境中,它们将以商品的形式提供给使用者直接填充到柱中,方便他们制备亲和层析柱。

7.
  制备完成了的亲和树脂可填充在底部可阻隔树脂但溶液可流出的容器中。该容器可为任何材料制成,也可使用注射器的外管、移液管、层析柱等制成。

8.
  制备而成的亲和层析柱应使用防潮、避光、不易破损的薄膜或盒子密封包装以防干燥、污染。包装好的亲和层析柱应放置在4℃低温的环境中保藏并将以商品的形式直接提供给使用者使用。

说明书

一种商品型亲和层析柱的制备及使用方式
                    技术领域
本发明属于生物技术领域
                    技术背景
通过分子之间的各种理化特性的差异达到把单一蛋白从组织提取液或蛋白混杂的溶液中纯化出来需要经历一系列很复杂和繁琐的操作过程,耗费时间长而最终收率却很低。随着生化技术的发展,出现一种操作简便、分离特异性高的分离纯化生物大分子的方法——亲和层析法。它的原理是利用抗原-抗体之间的特异性识别和结合的特性来“一步法”纯化目标蛋白。它的具体实施方式是将能够识别和结合目标蛋白的抗体偶联到固相树脂上,常用的树脂有溴化氰活化的琼脂糖凝胶,如Sepharose 4B等。当使用偶联了抗体的树脂和杂蛋白溶液接触时,溶液中只有被抗体特异性地识别和结合了的蛋白才会滞留在树脂上,经过冲洗去除未被结合的非特异性杂蛋白,最后使用洗脱液解离被抗体结合的蛋白就可以将与抗体结合的目标蛋白与其它杂蛋白分离。利用此原理和方法可以“一步法”从组织提取液或杂蛋白溶液中分离纯化出所需要的目标蛋白。利用亲和层析来纯化生物大分子的优点是操作简便,特异性高、分离效果好,是一种即省力又省时的高效分离方法。亲和层析技术现已成为生化实验室里一种用来分离纯化蛋白的常用方法。
                     发明内容
本发明涉及制备的商品型亲和层析柱用填料和成品柱是为了解决从组织提取液或杂蛋白溶液中“一步法”提取人热休克蛋白(Heatshock protein,简称HSP)。热休克蛋白是一类同源性极高、序列非常保守的存在于细胞内的家族蛋白,根据其分子大小和结构特性可分为多个成员,如HSP-27、HSP-40、HSP-60、HSP-70、HSP-90、HSP-110、主要存在于胞浆内,gp96蛋白主要存在于内质网腔内等。它们平时处于低水平的表达状态,一旦细胞出现生理性、病理性或环境的突发性变化时HSP的表达便会急剧提高,因此热休克蛋白又被称为“应激蛋白”。HSP通过参与蛋白质的结合、折叠、亚单位的装配、跨膜转运及抗原递呈对细胞的生长、分化、基因转录和自我保护发挥重要作用。HSP的另一个重要特性是其具有结合细胞内变异蛋白质和多肽的能力。它们与细胞内变异蛋白、多肽结合、参与抗原递呈而其HSP本身并不产生抗原性,因此HSP又被称为“分子伴侣”。制备出一种能使生物学实验室和临床医学中心快速、便捷和高效的分离纯化出HSP蛋白的亲和层析柱用填料或亲和层析成品柱在实际应用中有着十分重要的意义。
                   具体实施方式
1.制备亲和层析柱用填料:
购买已活化的琼脂糖凝胶树脂,如CNBr-Sepharose 4B。
偶联前处理:
称取1g CNBr-Sepharose 4B用1mMo/L盐酸充分浸洗膨胀凝胶树脂再用偶联缓冲液(0.1Mol/L NaHCO3,0.1Mol/L Na2CO3和0.5Mol/LNaCl,pH8.5)洗2次。
偶联:
处理完毕的凝胶树脂与等体积的偶联缓冲液含有10μMol/LHSP-60抗体混合,在室温下温和摇动混合2小时后,弃去溶液保留凝胶树脂。
封闭多余结合位点:
向凝胶树脂中加入0.2Mol/L甘氨酸溶液10ml,室温下旋转混合1小时以封闭Sepharose 4B上未与抗体结合的位点。用偶联缓冲液和醋酸盐缓冲液(0.1Mol/L NaCH2COOH和0.5Mol/L NaCl,pH4.0)交替洗2次,再用100ml 0.15Mol/L PBS缓冲液(pH7.2)轻轻地清洗凝胶树脂2次。亲和树脂可供上样做亲和反应。
防腐处理:
制备好的亲和树脂如需放置一段时间,树脂应使用含有1/10000叠氮钠的PBS浸泡在并沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃中密闭保存。
亲和层析柱填料的包装:
将与HSP-60偶联的琼脂糖凝胶树脂每5克封入铝塑包装袋内封口或装入棕色的玻璃瓶中用氨基胶塞塞紧并用铝薄压盖密封瓶口。
保存:
偶联好抗体的琼脂糖凝胶树脂切勿冷冻,保存在4℃的冰箱内,1年之内性能稳定。
2.制备亲和层析柱:
将5g与抗人HSP-60的抗体偶联的琼脂糖凝胶用100ml 0.15Mol/LPBS缓冲液(pH7.2)浸泡并装到尺寸适宜的层析柱中,防止柱床内含有气泡。使用0.15Mol/L PBS缓冲液(pH7.2)平衡层析柱。该柱可供亲和上样。
层析柱的保存:
使用含有1/10000叠氮钠的防腐PBS缓冲液过柱。保留适当防腐液在柱内浸泡树脂并使用薄膜密封层析柱的上下两端以防止树脂污染和干燥。将制备好的亲和层析柱单独装入铝塑薄膜或塑料薄膜袋内密封之后保存在4℃冰箱内,有效期为1年。包装好的亲和层析柱切勿冷冻。
                    实施例1:
亲和层析柱的准备:
取1包5g已偶联HSP-60抗体的Sepharose 4B亲和层析柱填料放入有盖的瓶中,用50ml 0.15Mol/L PBS(pH7.2)PBS缓冲液(简称PBS缓冲液)浸泡清洗后吸出多余的溶液,树脂可供待进行亲和反应。
组织液的制备:
从大鼠身上取出肿瘤块,修去正常组织,将切割成小碎块的肿瘤组织放入-20℃冰箱中冷冻2小时后将其置入匀浆器中研磨。向研磨器中逐渐加入20ml预冷的PBS缓冲液并继续研磨。研磨液经过冷冻离心机8000rpm 10分钟离心后取上清液做亲和反应。
亲和反应:
将离心后的研磨上清液移送到装有亲和层析树脂填料的瓶中,拧紧瓶盖防止瓶内溶液泄露,将亲和树脂与肿瘤组织研磨液在瓶中混合并放置在摇动器或震荡器上在4℃的环境中温和地摇动震荡过夜,达到使亲和树脂上的抗体与溶液中的抗原充分结合的目的。
装柱:
次日将瓶中的树脂及溶液全部装填到干净的空层析柱中,让液体流经树脂从层析柱底部流出,待液面刚抵树脂面时出再加入PBS缓冲液充分冲洗亲和层析柱直至流出液地紫外吸收值OD280<0.02,达到将非特异性蛋白冲洗去除的目的。
洗脱亲和物:
用0.1Mol/L的甘氨酸-盐酸溶液(pH2.4)洗脱亲和层析柱中与HSP-60抗体结合的目标蛋白,即HSP-60蛋白。收集的洗脱组分迅速用0.1Mol/L Tris-Cl缓冲液(pH8.0)中和以免蛋白变性。
分离物的鉴定:
利用亲和层析的方法纯化出的HSP-60蛋白可用高效液相色谱(HPLC)或聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析洗脱产物的纯度,可用紫外分光光度法做蛋白含量的测定。
柱的再生:
用10个柱床体积的0.1Mol/L Tris-HCl含0.5Mol/L NaCl(pH8.5)缓冲液,和pH4.5,0.1mol/L醋酸钠缓冲液轮流清洗亲和层析柱2次,再用PBS缓冲液充分平衡层析柱后可保存在4℃冰箱内供下次使用。
亲和层析柱经过再生后可再次使用,每根亲和层析柱可反复再生使用多次。
                  实施例2:
取用1根已偶联HSP-60抗体的Sepherose 4B亲和层析柱用0.15Mol/L PBS缓冲液(pH7.2)流洗平衡以供上样。
样品的预处理:
将含有HSP-60分子的杂蛋白混合液在4℃的环境中用PBS缓冲液透析过夜。
亲和反应:
次日将透析好的杂蛋白溶液加到平衡好了的亲和层析柱上,保持流速在0.5ml/min。待样品流完后用大量PBS流洗亲和柱直至流出液的紫外吸收值OD280<0.02。
洗脱亲和物:
使用0.1Mol/L甘氨酸-HCl(pH2.4)洗脱与树脂偶联抗体结合的目标蛋白,即HSP-60蛋白。收集含有洗脱物的流份并立即在4℃的环境中对PBS缓冲液透析过夜。其中换PBS缓冲液1至2次。
鉴定纯化产物:
次日将透析袋内的溶液转移到瓶中。利用亲和层析的方法分离纯化出来的产物可根据需要进行蛋白浓度、纯度和活性的测定。
亲和层析柱的再生:
用10个柱床体积的0.1Mol/L Tris-HCl含0.5Mol/L NaCl(pH8.5)缓冲液,和pH4.5,0.1mol/L醋酸钠缓冲液轮流清洗亲和层析柱2次,再用pH7.2,0.15mol/L PBS充分平衡层析柱。
贮存:
使用加入1/万的叠氮钠的PBS缓冲液浸泡树脂并贮存于4℃冰箱内。
分离产物鉴定:
收集分离纯化出的HSP-60蛋白可采用SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、Western Blot、紫外分光等方法检测分离出来的蛋白纯度和含量。
结论:
在杂蛋白溶液中含有低含量的HSP-60蛋白,经过亲和层析柱的“一步法”提取可将杂蛋白溶液中的HSP-60蛋白特异性地富集分离出来。此制备偶联了HSP抗体的亲和层析柱的方法将可用于制备商品化的提取HSP蛋白的亲和层析柱,达到有效地从含有少量HSP蛋白的杂蛋白溶液中特异性地分离纯化出HSP蛋白的目的。此商品型的HSP亲和层析柱可极大地方便和缩短生物学实验室和医疗单位的使用者分离提取HSP蛋白的程序。
在使用操作时可按照但不必拘泥于以上的实验条件和方法进行亲和层析的样品预处理、偶联、封闭、上样、清洗、洗脱等。
可以将可识别和结合单一HSP蛋白或多种HSP蛋白的单一或多种单克隆或多克隆抗体偶联到树脂上,如将HSP-70的单克隆抗体和gp96的单克隆抗体混合在一起偶联到Sepharose 4B树脂上。根据需要使用不同的HSP抗体偶联到亲和树脂上可制备成适合各种需要的商品型亲和层析柱填料或亲和层析柱。

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本发明涉及应用可特异性地识别热休克蛋白的抗体来制备一种商品型亲和树脂和亲和层析柱,其目的是为了方便从蛋白混杂的液体中快速、简便、高效、特异性地提取出热休克蛋白(heat shock protein简写HSP)及与热休克蛋白(HSP)非共价结合的多肽抗原分子群所形成的热休克蛋白多肽复合体(heat shock protein peptide complexes简称HSPPC)。。

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