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1、10申请公布号CN102086220A43申请公布日20110608CN102086220ACN102086220A21申请号201010617724222申请日20101231C07H15/203200601C07H1/0820060171申请人广州市天吻娇颜化妆品有限公司地址510665广东省广州市天河区科韵路16号广州信息港A栋10楼72发明人赖维74专利代理机构广州市一新专利商标事务所有限公司44220代理人马丽丽54发明名称一种荔枝果皮中根皮苷的提取和纯化方法57摘要本发明公开了一种荔枝果皮中根皮苷的提取和纯化方法，属于天然植物中化妆品原料开发领域，它包括以下步骤粉碎提取粗提液富集荔。
2、枝皮粗提液固相萃取纯化。本发明突破性的发现了荔枝中存在根皮苷，并将其从荔枝果皮中提纯出来作为一种具有美白和抗衰老活性的天然原料应用于化妆品中，荔枝果皮在中国岭南地区不仅来源广泛，而且变废为宝。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图2页CN102086223A1/1页21一种荔枝果皮中根皮苷的提取和纯化方法，其特征在于它包括以下步骤粉碎新鲜荔枝果皮（连衣）阴干后，粉碎过40目筛；提取粗提液准确称取荔枝果皮粉末100G，加入70乙醇150ML，超声处理30分钟，功率100；过滤后重复提取一次，合并滤液；滤液经旋转蒸发仪减压浓缩至70ML，加入18。
3、0ML无水乙醇静置，16H后以滤纸过滤；滤液减压浓缩至乙醇全部挥发，然后加入双蒸水150ML，并以超声辅助溶解，最后过滤后得到粗提液；富集荔枝皮粗提液将上述粗提液上样至大孔树脂柱16G，上样速度1ML/MIN，然后以450ML双蒸水淋洗至无色，再以70乙醇50ML解吸附，流速1ML/MIN，得到荔枝皮提取液，并予4避光保存；固相萃取取上述荔枝皮提取液5ML以1ML/MIN流速通过活化后的固相萃取小柱，前3ML流出液弃去，其余流出液收集；所述固相萃取小柱的活化需要先用10ML甲醇通过固相萃取小柱，再以10ML双蒸水洗去甲醇，速度均为1ML/MIN；纯化所述纯化采用高效液相色谱法进行，包括以下步骤。
4、高效液相色谱检测根皮苷标准品精密称取根皮苷标准品00050G，溶于甲醇中，配制成浓度0002MG/ML标准品溶液，经045M微孔滤膜过滤后作高效液相色谱，得到根皮苷标准品保留时间21444MIN；高效液相色谱检测固相萃取后的收集液精密称取固相萃取后的收集液00050G，溶于甲醇中，配制成浓度0002MG/ML溶液，经045M微孔滤膜过滤后作高效液相色谱，得到该收集液保留时间21518MIN，收集21518MIN流出液；将步骤B）收集到的流出液用氮吹仪浓缩至120L，经045M微孔滤膜过滤后作高效液相色谱，显示保留时间为21758MIN的单个波峰为纯化后的单体化合物根皮苷。权利要求书CN1020。
5、86220ACN102086223A1/4页3一种荔枝果皮中根皮苷的提取和纯化方法技术领域0001本发明涉及一种根皮苷的提取和纯化方法，特别是涉及一种荔枝果皮中根皮苷的提取和纯化方法，属于天然植物中化妆品原料开发领域。背景技术0002根皮素及其糖苷根皮苷属于黄酮类中的二氢查耳酮，是国内外新近研究开发的一种新型皮肤美白剂和抗氧化剂。二氢查耳酮在自然界分布较少，根皮素及根皮苷存在于一些植物的根茎和根皮中，据文献报道在苹果中含量较多，且多以根皮苷的形式存在12。荔枝LITCHICHINENSISSONN是中国岭南地区盛产的特色水果，对荔枝果皮的研究初步推断其含有黄酮类物质3。但在本课题研究前国内外尚。
6、没有从荔枝中发现根皮苷的文献报道。目前，国内外在天然植物中提取根皮苷的方法主要是有机溶剂提取法、超声波浸提法和微波辅助法，分离纯化的方法主要是高效液相色谱法、硅胶柱层析法和薄层层析法。发明内容0003荔枝是中国岭南地区产量较大的季节性特色水果，深受人们喜爱。如能从荔枝果皮中提取根皮苷并作为一种具有美白和抗衰老活性的天然原料应用于化妆品中，不仅来源广泛，而且变废为宝，既可以带来巨大的经济效益，又可以促进本地化妆品产业核心技术的发展。0004本发明的目的在于提供一种荔枝果皮中根皮苷的提取和纯化方法。0005本发明的目的通过以下技术方案予以实现。0006一种荔枝果皮中根皮苷的提取和纯化方法，它包括以。
7、下步骤1、粉碎新鲜荔枝果皮（连衣）阴干后，粉碎过40目筛；2、提取粗提液准确称取荔枝果皮粉末100G，加入70乙醇150ML，超声处理30分钟，功率100；过滤后重复提取一次，合并滤液；滤液经旋转蒸发仪减压浓缩至70ML，加入180ML无水乙醇静置，16H后以滤纸过滤；滤液减压浓缩至乙醇全部挥发，然后加入双蒸水150ML，并以超声辅助溶解，最后过滤后得到粗提液；3、富集荔枝皮粗提液将上述粗提液上样至大孔树脂柱16G，上样速度1ML/MIN，然后以450ML双蒸水淋洗至无色，再以70乙醇50ML解吸附，流速1ML/MIN，得到荔枝皮提取液，并予4避光保存；4、固相萃取取上述荔枝皮提取液5ML以1。
8、ML/MIN流速通过活化后的固相萃取小柱，前3ML流出液弃去，其余流出液收集；所述固相萃取小柱的活化需要先用10ML甲醇通过固相萃取小柱，再以10ML双蒸水洗去甲醇，速度均为1ML/MIN；5、纯化所述纯化采用高效液相色谱法进行，它包括以下步骤（1）高效液相色谱检测根皮苷标准品精密称取根皮苷标准品00050G，溶于甲醇中，配制成浓度0002MG/ML标准品溶液，经045M微孔滤膜过滤后作高效液相色谱，得到根皮苷标准品保留时间21444MIN，见图1；说明书CN102086220ACN102086223A2/4页4（2）高效液相色谱检测固相萃取后的收集液精密称取固相萃取后的收集液00050G，溶。
9、于甲醇中，配制成浓度0002MG/ML溶液，经045M微孔滤膜过滤后作高效液相色谱，得到该收集液保留时间21518MIN，见图2。收集21518MIN流出液，由于此保留时间与标准品的保留时间大致相同，所以此波峰很可能为目标物质根皮苷；（3）将步骤（2）收集到的流出液用氮吹仪浓缩至120L，经045M微孔滤膜过滤后作高效液相色谱，显示保留时间为21758MIN的单个波峰为纯化后的单体化合物根皮苷；结构鉴定精密称取根皮苷标准品00050G，溶于甲醇中，配制成浓度0005MG/ML标准品溶液。将此标准品溶液和纯化后的单体化合物分别作质谱检测。根皮苷标准品主要质谱峰（见图4）和荔枝果皮提取液纯化后的单。
10、体化合物主要质谱峰（见图5）一致。0007高效液相色谱是在经典的液体柱色谱法基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，引入气相色谱理论后发展起来的色谱技术。其原理是利用每种物质在固定相中的保留时间不同而达到分离的目的。高效液相色谱法具有以下特点（1）色谱柱可反复使用，流动相选择范围宽，流出组分容易收集；（2）分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化。植物的萃取液进样后，很快就可以在检测器上看到在不同保留时间点上出现的不同波峰，每一种波峰为一种化合物，波峰下面积即为此化合物的含量，因此，这是一种既可以纯化物质又可以进行定量分析的方法。另外，高效液相色谱不仅能够分离复杂样品，并在定量分析。
11、方面具有优越性，而且本实验中使用的AGILENT1100高效液相色谱仪带有光电二极管阵列（PDAD）紫外光度检测器，可以提供紫外波谱扫描，初步鉴定流出组分的化学结构。0008即使同一样物质和同一个色谱条件，每次通过高效液相色谱仪后的保留时间也不可能完全一致，允许有一定误差。0009本发明的方法突破性的发现了荔枝中存在根皮苷，并将其从荔枝果皮中提纯出来作为一种具有美白和抗衰老活性的天然原料应用于化妆品中，荔枝果皮在中国岭南地区不仅来源广泛，而且变废为宝，既可以带来巨大的经济效益，又可以促进本地化妆品产业核心技术的发展。附图说明0010图1是根皮苷标准品（浓度0002MG/ML）HPLC图谱，保留。
12、时间21444MIN；图2是荔枝果皮提取液HPLC图谱，保留时间21518MIN处可见色谱峰；图3是荔枝果皮提取液经纯化后的单体化合物HPLC图谱，保留时间21758MIN；图4是根皮苷标准品（浓度0005MG/ML）质谱图；图5是荔枝果皮提取液纯化后的单体化合物质谱图。具体实施方式0011下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。0012一、准备主要仪器、试剂和材料AGILENT1100高效液相色谱仪（光电二极管阵列检测器）、ULTIMATEC18柱（25046MM，5M），DIKMAC18固相萃取小柱（500MG，3ML）。说明书CN102086220ACN102086223A3/4页50。
13、013API4000QTRAP液相色谱三重四极杆/线性离子质谱联用仪（美国应用生物系统公司），数据自动关联增强子离子扫描，锁定4354M/Z，碰撞能量15V、30V、45V三者叠加，扫描范围50500M/Z。0014KQ5200DA型数控超声波清洗器，功率100W。0015HGC12氮吹仪天津恒奥公司，温度50。0016D101大孔树脂（天津南开和成公司）。0017根皮苷标准品购自美国SIGMA公司，纯度990。0018流动相所用甲醇为色谱纯（DIKMA公司），实验用水为去离子水。其余试剂均为分析纯。0019荔枝品种为桂味，采自广州增城船坑果园。0020二、高效液相色谱条件流动相A为甲醇，流动。
14、相B为01乙酸（VV，PH320），进样量20L，柱温35，检测波长286NM。流动相梯度及流速见表1。0021表1流动相比例及流速三、本实施例的一种荔枝果皮中根皮苷的提取和纯化方法，它包括以下步骤一种荔枝果皮中根皮苷的提取和纯化方法，它包括以下步骤1、粉碎新鲜荔枝果皮（连衣）阴干后，粉碎过40目筛；2、提取粗提液准确称取荔枝果皮粉末100G，加入70乙醇150ML，超声处理30分钟，功率100；过滤后重复提取一次，合并滤液；滤液经旋转蒸发仪减压浓缩至70ML，加入180ML无水乙醇静置，16H后以滤纸过滤；滤液减压浓缩至乙醇全部挥发，然后加入双蒸水150ML，并以超声辅助溶解，最后过滤后得到。
15、粗提液；3、富集荔枝皮粗提液将上述粗提液上样至大孔树脂柱16G，上样速度1ML/MIN，然后以450ML双蒸水淋洗至无色，再以70乙醇50ML解吸附，流速1ML/MIN，得到荔枝皮提取液，并予4避光保存；4、固相萃取取上述荔枝皮提取液5ML以1ML/MIN流速通过活化后的固相萃取小柱，前3ML流出液弃去，其余流出液收集；所述固相萃取小柱的活化需要先用10ML甲醇通过固相萃取小柱，再以10ML双蒸水洗去甲醇，速度均为1ML/MIN；5、纯化所述纯化采用高效液相色谱法进行，它包括以下步骤A高效液相色谱检测根皮苷标准品精密称取根皮苷标准品00050G，溶于甲醇中，配制成浓度0002MG/ML标准品溶。
16、液，经045M微孔滤膜过滤后作高效液相色谱，得到根皮苷标准品保留时间21444MIN，见图1；B高效液相色谱检测固相萃取后的收集液精密称取固相萃取后的收集液00050G，溶于甲醇中，配制成浓度0002MG/ML溶液，经045M微孔滤膜过滤后作高效液相色谱，得到该收集液保留时间21518MIN，见图2。收集21518MIN流出液，由于此保留时间与标说明书CN102086220ACN102086223A4/4页6准品的保留时间大致相同，所以此波峰很可能为目标物质根皮苷；C将步骤B）收集到的流出液用氮吹仪浓缩至120L，经045M微孔滤膜过滤后作高效液相色谱，显示保留时间为21758MIN的单个波峰为纯化后的单体化合物根皮苷；6、结构鉴定精密称取根皮苷标准品00050G，溶于甲醇中，配制成浓度0005MG/ML标准品溶液。将此标准品溶液和纯化后的单体化合物分别作质谱检测。根皮苷标准品主要质谱峰（见图4）和荔枝果皮提取液纯化后的单体化合物主要质谱峰（见图5）一致，证实了用本发明的方法提取和纯化后的物质就是根皮苷。说明书CN102086220ACN102086223A1/2页7图1图2图3说明书附图CN102086220ACN102086223A2/2页8图4图5说明书附图CN102086220A。