脂族氨基取代的脱甲氧竹红菌素及其合成 【技术领域】
本发明公开了一种具有光动力学活性的新型光敏剂，即脂族氨基取代的脱甲氧竹红菌素及其合成。
背景技术
光动力学疗法(PDT)是一种联合采用光和感光剂以在癌组织或其它不需要的组织中产生细胞毒素效应的医学疗法。与常规的化学疗法相比，它具有较高的效力和安全性。被广泛公认的PDT机理是，照射时，光敏剂连续产生能杀死靶分子的高反应性的活性氧类。与每次仅仅可杀死一种靶分子的传统的化学药物对比，PDT具有显著的高效能。另一方面，PDT具有药物定向性和光定向性双重选择性，这避免或减少了对正常组织的损害，从而增加药物的安全性。这对于癌症和AIDS的治疗很重要。
光动力学疗法(PDT)包括将光敏药物引入体内，随后通过可见光或近红外光照射肿瘤组织。在氧存在时，照射激活该药物并反过来产生导致组织损伤的反应性氧类。缘于该疗法的优点，例如在大多数部位的相对选择性，与其它疗法的相容性，可重复性，易于给药等，PDT正慢慢地找到其作为癌症的有效治疗方法在对于治疗癌症或临床疾病的某些类型中地位置，例如肺癌、食道癌、胃癌、子宫颈癌和子宫颈发育异常等。[1]
随着激光和光纤维技术的快速发展，PDT中的光源问题得到了解决，选择PDT治疗中的光敏剂变得更为关键。目前，最普及的光动力学剂photofrin对治疗早期的恶性肿瘤例如膀胱癌、肺癌和胃癌等具有显著疗效。Lipson等采用血卟啉衍生物(HPD)检测和控制癌生长，并在1966年第一次用于治疗乳腺癌。在《泌尿学杂志》(1976，115，150)中，Kelly和Snell报道了HPD对膀胱癌具有显著的光动力学疗效。在《NATO癌症研究所杂志》(1975，55，115)中，Dougherty等报道了他们采用HPD作为光敏剂用于研究其对抗数千例脑瘤、咽喉癌和眼肿瘤的光动力学活性，并取得了显著的疗效。1978年，Dougherty用HPD作为光敏剂治疗恶性皮肤癌和皮下肿瘤，结果显示在113例病变中，有111处全部治愈或部分治愈。卟啉类光敏剂是一种包括四个吡咯环和四个次甲基桥的n-共轭体系。HPD和二血卟啉醚或酯(DHE)是用于临床治疗中的综合药剂。当HPD达到某一浓度时，体内外迅速出现聚集，这降低了HPD的光动力学活性。在《细胞生物化血作用》(1985，3，15)中，EI-Far等报道了HPD是脂性的，并表现出具有一定程度的癌细胞定位能力。在癌组织中，可使它们选择性地增加，其定位作用和光敏活性主要依赖于其疏水性、聚集态和电荷分布。
迄今，只有Photofrin已得到加拿大、日本、荷兰和美国的健康委员会的批准[2]。尽管获得了有关Photofrin的许多好的结果，但一些重要的因素仍然限制了PDT的效能，包括它的复合组分、在红光谱区的低消光系数和长时间的皮肤射线损害性等[3]。这无疑促进了对更适合的理想光敏剂的进一步研究。
虽然使用HPD作为光敏剂的PDT已经引起了极大的关注，但仍然存在一些严重的缺陷，即，组分复杂、在光动力学的范围内(600-900nm)的吸收很少、代谢缓慢，以及毒性和副作用等。
为了克服这些缺陷，近年探究了各种新的光敏剂。天然存在的多环醌，竹红菌素，是从真菌hypocrella bambuase(B.Et Br)sacc中分离出来的，其在中国的西南部生长丰富。在过去的20年，它们在真菌中的高含量(3-4％)和易于分离和纯化的性质已受到了极大的关注。竹红菌素的名称源于Hypocrellabambusae sacc.，一种箭竹属的寄生真菌，它在云南省(中国)的西北部地区、西藏的东南部和斯里兰卡的某些地方生长丰富。竹红菌素属于苝醌(PQP)颜料的常见种类，包括竹红菌甲素(HA)和竹红菌乙素(HB)。
在中国，一些医院已用竹红菌素作为光动力学剂来治疗某些皮肤病，例如阴部漂白(pudendum bleaching)、白癜风和牛皮癣。1980年，在《科学通报》(1980，25，1148)(中国)和《云南医药》(1980，1，20)(中国)中，Xiang-yi Wan和Zi-hua Luo分别报道了竹红菌素可用于治疗阴部漂白(pudendumbleaching)和皮肤斑疹。人们逐渐将竹红菌素用于治疗苔癣化、白癜风，以及牛皮癣和头癣。在Liebigs Ann.Chem.(1981，1880)中，Yuan-teng Chen等确定了竹红菌甲素的一种有效组分竹红菌甲素(HA)。在《科学通报》(1988，33，518)(中国)中，Manhua Zhang和Li Liang等确定了竹红菌素的另一有效组分，竹红菌乙素(HB)。Manhua Zhang等花了十多年研究了竹红菌素的结构、光化学、光物理、光生物学和细胞学特性。我们观察到竹红菌素由HA{3，10-二羟基-4，9-二酮-1，12-(2′-羟基-2′-甲基-3′-酰基)亚丙基(1′，3′)-2，6，7，11-四甲氧基-苝}(见结构I)和HB{3，10-二羟基-4，9-二酮-1，12-(2′-甲基-3′-酰基-2′，3′-脱氢)亚丙基(1′，3′)-2，6，7，11-四甲氧基-苝}(见结构II)组成。
作为一种新的光敏剂，它们具有一些优点，包括易于制备和纯化、毒性低、稳定性强、无聚集、代谢快、副作用少以及在癌组织中的选择性定位。这些特性使得它们成为有前景的第二代光敏剂。在《光化学与光生物学》(1997，65，352)中，Lown等报道了HB具有明显的抗AIDS作用。然而它们在光动力学范围内吸收很少限制了它在PDT中的应用。竹红菌素，由于其纯的组分、有利的红光吸收光谱、单线态氧的高量子产率，以及间接化学改性的功能，已被选为PDT的潜在光敏剂[4]。人们已经合成和研究了许多源于竹红菌乙素(HB)的衍生物，其中一些已显示了有前景的抗癌特性(5-11)。为了克服这些缺陷，人们对竹红菌素进行了许多结构修饰。1994-1995年，我们和Lown几乎同时制备了氨基取代的竹红菌素。这种氨基取代的竹红菌素在光动力学范围内显示出很强的吸收。借助于激光，它们较其亲本竹红菌素具有更强的光动力学活性。在《光化学和光生物学》(1997，65，714)中Lown详细报道了氨基取代的竹红菌素对癌细胞的光损伤。在Dr.Lown制备的氨基取代的衍生物中，竹红菌素中最初的近位羟基化苝醌结构发生了变化(见结构III和IV，III和IV的亲本化合物为异构体)，这改变了竹红菌素的光敏位置。由于步骤太多，Lown报道的氨基取代的HB的方法不受欢迎。
Manhua Zhang等报道，由于其不合乎要求的光敏位置，使得巯基取代的竹红菌素在光动力学范围内吸收很少。
【附图说明】
图1展示了HB和2-BA-2-DMHB的吸收数据。
图2展示了HB(左)和2-BA-2-DMHB(右)的定位。
图3展示了HB和2-BA-2-DMHB的细胞毒性(图3A)和光毒性(分别为图#B和3C)。
图4为Hoechst 33342-染色的HeLa细胞的荧光图。细胞在4μM2-BA-2-DMHB中培养6小时并用LD70照射。图4A展示了未经处理的对照细胞；图4B为深色的对照细胞(光剂量＝0)；图4C为照射后24小时。
图5展示了HeLa细胞中的PDT-诱导的DNA裂解：第1道，HB单独培养(4μM，15分钟)；第2和3道，分别在LD70和LD90时HB光敏作用后24小时；第4道，2-BA-2-DMHB单独培养(4μM，6小时)；第5和6道，分别在LD70和LD90时2-BA-2-DMHB光敏作用后24小时；第7道，标记(PUC-Mspl消化)。
图6展示了用PDT处理的HeLa细胞的DNA直方图。图6A展示了2-BA-2-DMHB的培养；图6B，LD90时2-BA-2-DMHB光敏作用后6小时；图6C，HB单独培养；图6D，LD90时HB光敏作用后24小时。
图7展示了在照射(LD90)后不同培养时期编程的(apoptic)HeLa细胞的百分比。
【发明内容】
本发明提供一种新的脂族氨基(含脂肪环和芳香环)-取代的脱甲氧基化竹红菌素及其制备方法。这些竹红菌素衍生物在光动力学范围内表现出强吸收，保留了近位羟基化苝醌结构的光动力学特性。在用激光照射时，它们可产生活性氧类，包括单线态氧(1O2)、过氧化物阴离子基团(O2-)和羟基基团(HO-)，并具有强的光动力学活性，可用于治疗癌症和抗AIDS病毒。
本发明的竹红菌素衍生物由氨基取代的脱甲氧基竹红菌甲素和乙素组成，其结构如V和VI所示：
其中R1、R2、R3、R4为OCH3、NHCH2Ar(Ar为苯基或吡啶基)或NHCH(CH2)n(其中-CH(CH2)n为脂环基，且n＝3、4、5、6)。2-BA-2-DMHB为，其中R1、R2、R3为OCH3，R4为NH(CH2)3CH3。或者，R1、R2、R3、R4为OCH3或NHCH2(CH2)nAr，其中Ar为苯基、萘基、多环芳香部分或杂环部分，n为0-12。
本发明的竹红菌素衍生物也包括2-丁基氨基-2-脱甲氧基-竹红菌乙素(2-BA-2-DMHB)。2-BA-2-DMHB在红色光谱区域具有很强的吸收。与其亲本化合物HB相比，它的吸收谱带延伸至更长的波长。在583nm时的消光系数(6)为548nm时HB的2.5倍，621nm时为580nm时HB的3.8倍以上(表1)。这对于临床使用的光源的组织穿透更为有利。
2-BA-2-DMHB具有极好的细胞损害的光电位。MTT比色测定结果显示，2-BA-2-DMHB甚至在最高试验浓度(100μM)时也不会引起50％致死率。这意味着在暗处的2-BA-2-DMHB的LD50大于100μM，这可与任何前面报道的HB衍生物的LD50相比[8-10]。然而，HB在大约20μM时导致50％致死率。换言之，2-BA-2-DMHB的细胞毒性远低于HB的细胞毒性。另一方面，在24Jcm-2的小剂量时，2-BA-2-DMHB的LD50约为0.4μM，而HB的LD50为2μM。因此，2-BA-2DMHB的体外光电位为HB的25倍，这将对给药带来广泛的安全范围。
本发明的竹红菌素衍生物也可与结合剂缀合，该结合剂在体内或体外结合预定的细胞或结构。与单克隆抗体缀合(例如，免疫缀合)可提供与各种疾病的治疗相关的专一性，包括卵巢癌和乳腺癌。竹红菌素的荧光特性、或者它们被强烈染色的事实，有利于用于肿瘤和转移性疾病的诊断，它们的光谱指纹有利于对恶性的、正常的、发炎的、或实际被损坏的组织之间的鉴别。此外，可通过各种光学检测手段检测这些荧光特性。
与单克隆抗体缀合也可提供对各种疾病的光照疗法的高度专一性，包括卵巢癌和乳腺癌。此缀合通过编程细胞死亡调节光毒性，首先通过II型与细胞内靶和膜靶的光化学反应来调节。在完全缺氧时，通过I型光化学反应调节光毒性，其特点在于对低氧肿瘤细胞的处理很关键。在688nm时它们保持有严重的光毒性，而在光疗范围内很好[Estey等，Cancer Chemother.Pharmacol.，37：343(1996)]。
本发明包括苝醌(PQP)衍生物作为光动力学剂的用途，以及竹红菌素衍生物在光动力学治疗(PDT)中的用途。
本发明也包括一种治疗方法，其通过给予治疗足够量的至少一种本发明的竹红菌素衍生物，以及使衍生物光活化来实现。尤其是，竹红菌素衍生物可通过将衍生物暴露于预定波长光而得以活化。
本发明也包括一种光动力学治疗的方法，包括给予一种含本发明的一种或多种竹红菌素化合物的组合物。
本发明也包括一种治疗癌症的方法，其在大约400nm-大约850nm光波长存在时得以改善。本发明也包括采用一种或多种PQP衍生物以产生单线态氧和各种毒性自由基。尤其是，能产生单线态氧和/或各种毒性自由基的化合物也可用于治疗某些疾病，等等。
本发明也包括使用具有抗癌和/或抗病毒活性的竹红菌素衍生物，以及通过使衍生物光活化来增强这些衍生物的活性。本发明也包括使用竹红菌素衍生物优先破坏或优先导向靶癌细胞。
本发明也包括一种制备例如竹红菌素的天然苝醌的方法；合成苝醌衍生物，例如竹红菌甲素和竹红菌乙素、放射性标记的竹红菌乙素和放射性标记的竹红菌乙素衍生物。本发明也包括含苝醌衍生物、竹红菌素衍生物、放射性标记的竹红菌乙素和放射性标记的竹红菌乙素衍生物、苝醌缀合物、以及竹红菌素缀合物的组合物。
本发明也包括将本发明的PQP衍生物与一种或多种结合剂例如抗体或抗体片段缀合。本发明也包括与一种或多种结合剂例如抗体或抗体片段缀合的PQP衍生物。本发明还包括将PQP衍生物例如竹红菌素衍生物与DNA小沟结合剂缀合以在细胞结构例如细胞核中产生光毒性。
本文中，苝醌衍生物或衍生物是指所有来源于自然的或天然的苝醌的脱甲氧基化合物，其可被预定波长的光激活。在本发明的优选的实施方式中，衍生物为一种源自天然存在的竹红菌甲素或竹红菌乙素、以及竹红菌素样化合物的化合物。本文中的竹红菌素衍生物可被光激活、也可用作光动力学剂。本发明的衍生物也可与其它活性试剂复合或包括其它活性试剂，该试剂包括但不限于化疗剂或烷基化剂。
可以用任何可产生纯化或基本上纯化的化合物、或产生用作光动力学剂的化合物的方法来制备本发明化合物。本发明化合物也可形成包含化合物的混合物如一种以上化合物的组合物。这些方法在本领域是众所周知的，例如Liu等，“新的竹红菌乙素衍生物的合成研究，《四面体》，49：10785(1993)；和Diwu等，《抗癌药物设计》，8：129-143(1993)。由亲本化合物竹红菌乙素(HB)也很容易合成竹红菌素衍生物，竹红菌乙素是真菌Hypocrellabambusae sacc.，竹子的植物病原体的天然产物。本发明的化合物也可按如下合成。在实施例中还对制备化合物的典型方法进行了更详细的描述。其意在于本发明并不限于制备、分离或纯化竹红菌素衍生物的方法。
本发明中的竹红菌素衍生物的制备方法如下：将竹红菌素例如竹红菌甲素或乙素溶解在新鲜的含过量的脂族胺的蒸馏溶剂中，搅拌所得到的溶液6-24小时。在减压下除去溶剂。用氯仿冲洗残余物3-4次，再用水冲洗氯仿层3-4次。蒸发氯仿、然后将薄层色谱法(TLC)用于分离残余物、其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)环己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脱剂。重复TLC纯化两次，得到纯的氨基取代的脱甲氧基化竹红菌素。竹红菌甲素和乙素均可使用于反应。
脂族胺可包括但不限于环戊胺、环己胺、苄胺、3-吡啶基-甲胺和4-吡啶基-甲胺。胺也可包括环丁胺、组胺、2-噻吩甲胺、2-吡咯甲胺、或色胺。
溶剂可包括但不限于，苯、吡啶、环己烷、或1，4-二氧六环。溶剂也可包括氯苯、甲苯、己烷、石油醚、四氢呋喃、或N，N-二甲基甲酰胺。
本发明的竹红菌素衍生物在光动力学范围内(600-900nm)具有很强的吸收。在用激光照射时，它们可产生活性氧类，包括单线态氧(1O2)、过氧化物阴离子基团(O2-)和羟基基团(HO-)。它们具有几大优点，即，强的光动力学活性和低的暗毒性，这使得它们成为有前景的抗癌剂和抗AIDS剂。
对本发明的这些氨基取代的脱甲氧基化竹红菌素衍生物的光化学和光物理学的研究表明它们保存有光敏部位(正如它们的亲本竹红菌素)，可有效地产生活性氧类例如单线态氧(1O2)(1O2的量子产率为0.5-0.8，这可与HA、HB和HPD相比)和过氧化物阴离子基团(O2-)(氨基取代的脱甲氧基化竹红菌素衍生物的O2-的量子产率大于HB的2-5倍)。它们在光动力学范围内具有很强的吸收(在光动力学范围内它们的消光系数大于HA、HB和HPD的10-100倍)。所有这些结果表明本发明的氨基取代的脱甲氧基化竹红菌素衍生物的具有作为新一代光敏剂的理想活性。
前面的动物实验显示竹红菌甲素和乙素毒性低。Lown′s小组已证实了引入氨基增强了竹红菌素的碱性，这使得它们在溶酶体中定位更佳。溶酶体中的光损伤可诱导癌细胞降解。
本发明的氨基取代的竹红菌素具有光动力学范围内的强吸收(λmax＞104L·moI-1·cm-1)、高的单线态氧的量子产率(可与其亲本竹红菌素相比)、强的电荷传递活性(氧化电位从1.3V减至0.8V，O2-的量子产率较亲本竹红菌素大3倍)，表明它们具有强的光动力学作用。本发明中提供的制备方法简便、适度、成本低，易于大规模生产。
在这里，发现另一种新的竹红菌素同类物，2-丁基氨基-2-脱甲氧基-竹红菌乙素(2-BA-2-DMHB)[12]是有效的光敏剂。报道了其对HeLa细胞的光毒性和其引起的编程细胞死亡。
在本文中，给药是指任何导致本发明的一种或多种竹红菌素衍生物与预定的一个细胞、多个细胞、或组织(尤其是哺乳动物)暴露或接触的作用。本文中，给药可在体内、体外或间接体内进行。例如，一种组合物可以通过注射或内窥镜给药。给药也包括将本发明的组合物直接用于细胞。例如，在手术过程中，肿瘤细胞可能会暴露。根据本发明的一个实施方式，可将这些暴露的细胞(或肿瘤)直接暴露于本发明的组合物，例如通过洗涤或冲洗手术部位和/或细胞。
本文中，结合剂是指任何与承载在靶部位的受体形成特异结合的试剂或类似物，例如，与癌细胞的表位结合的抗体或抗体片段，或对准细胞的某一区域或结构的试剂。在本发明的一个优选实施方式中，结合剂是一种与癌细胞特异性结合的抗体或抗体片段。在本发明的另一个优选实施方式中，结合剂结合卵巢癌、乳腺癌或胃肠癌的抗原表位。
本文中，生理学上可接受的流体是指任何适于与含竹红菌素衍生物的组合物结合的流体或添加剂。典型的是这些流体用作稀释剂或载体。生理学上可接受的流体的例子包括但不限于防腐剂溶液、盐水溶液、等渗的(约0.9％)盐水溶液、或大约5％白蛋白溶液或悬浮液。其目的在于表明，本发明并不是局限于所使用的生理学上可接受的流体类型。本组合物也可包括药学上可接受的载体。药学上接受的载体包括但不限于盐水、无菌水、磷酸盐缓冲液等。在本发明组合物中也可包括其它适于对患者给药的缓冲剂、分散剂、和无毒的惰性物质。该组合物可以是溶液、悬浮液或任何适于给药的适合制剂，特别是无菌的和不含不需要的微粒物质的制剂。该组合物可通过常规的灭菌技术来进行灭菌。
也可将本发明化合物与许多其它化合物、信号剂、增强剂、和/或导向剂联合和缀合。例如，可以将本发明化合物与抗体、优选单克隆抗体缀合。根据本发明，结合剂包括任何DNA小沟导向剂，例如来红菌素(lexitropsin)或纺锤菌素(netropsin)，优选为了增强对细胞核中的光毒性的定向。
适合的增强剂包括但不限于pKa改性剂、低氧细胞放射致敏剂、和生物还原激活的抗肿瘤剂，例如丝裂霉素C(优选用于影响或加强化合物在低氧细胞或微生物中的毒性)。适合的信号剂包括但不限于编程细胞死亡或坏死细胞死亡的标记物、或内源于细胞循环调节或延迟的调节剂分子，优选通过诱导编程细胞死亡或坏死细胞死亡、或通过抑制任何方式的致死损伤或潜在致死损伤(PLD)的修复以加强化合物的光毒性。
如上所述，本发明的一个实施方式包括结合剂-竹红菌素缀合物(或免疫缀合物)和这些缀合物的治疗用途。根据本发明，可以使用任何将结合剂与竹红菌素连接的方法。例如，如何将一种抗体或一种抗体片段与光敏剂连接是众所周知的。例如，Goff等，《英国癌症杂志》，74：1194-1198(1996)公开了通过用单克隆抗体OC125培养光敏剂得到的免疫缀合物产品，单克隆抗体OC125是一种与和大多数卵巢癌有关的CA125抗原特异性结合的抗体。
实施本发明的最佳方式
通过下列实施例对本发明进行进一步举例说明：
实施例1
将150mg竹红菌乙素(0.28mmol)溶解在100mL含过量环戊胺的新鲜的蒸馏苯中，搅拌所得到的溶液18小时。在减压下除去溶剂。用氯仿冲洗残余物3-4次，再用水冲洗氯仿层3-4次。蒸发氯仿、然后用薄层色谱法(TLC)纯化残余物，其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)环己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脱剂。重复TLC两次以进一步纯化，得到氨基取代的脱甲氧基化竹红菌乙素。
产品特征：
UV-vis光谱(λmax)：466nm，577nm，641nm；
IR光谱(Vmax)：3419cm-1，2922cm-1，1680cm-1，1608cm-1；
1HNMR(δ)：6.32(s)，6.80(s)，3.08(s)，2.55(s)，1.79(s)，1.91(s)，4.01(s)，4.08(s)，4.24(s)，1.86(m)，1.68(m)，1.49(m)，1.00(m)，16.07，15.78ppm；
质谱(m/z)：583(M+)
实施例2
将150mg竹红菌乙素(0.28mmol)溶解在100mL含过量环己胺的新鲜的蒸馏苯中，搅拌所得到的溶液16小时。在减压下除去溶剂。用氯仿冲洗残余物3-4次，再用水冲洗氯仿层3-4次。蒸发氯仿，然后用薄层色谱法(TLC)纯化残余物，其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)环己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脱剂。重复TLC两次以进一步纯化，得到氨基取代的脱甲氧基化竹红菌乙素。
产品特征：
UV-vis光谱(λmax)：468nm，579nm，642nm；
IR光谱(Vmax)：3421cm-1，2920cm-1，1678cm-1，1605cm-1；1HNMR(δ)：6.12(s)，6.79(s)，3.05(s)，2.54(s)，1.76(s)，1.89(s)，4.05(s)，4.10(s)，4.21(s)，1.84(m)，1.40(m)，1.26(m)，1.01(m)，16.08，15.79ppm；
质谱(m/z)：597(M+)
实施例3
将150mg竹红菌乙素(0.28mmol)溶解在100mL含过量苄胺的新鲜的蒸馏吡啶中，搅拌所得到的溶液15小时。在减压下除去溶剂。用氯仿冲洗残余物3-4次，再用水冲洗氯仿层3-4次。蒸发氯仿，然后用薄层色谱法(TLC)纯化残余物，其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)环己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脱剂。重复TLC两次以进一步纯化，得到氨基取代的脱甲氧基化竹红菌乙素。
产品特征：
UV-vis光谱(λmax)：468nm，623nm；
IR光谱(Vmax)：3438cm-1，2942cm-1，1683cm-1，1605cm-1；
1HNMR(δ)：7.53(m)，7.34(m)，6.32(s)，6.80(s)，3.08(s)，2.55(s)，1.79(s)，1.91(s)，4.01(s)，4.08(s)，4.24(s)，1.86(m)，16.07，15.78ppm；
质谱(m/z)：603(M+)
实施例4
将150mg竹红菌乙素(0.28mmol)溶解在100mL含过量3-吡啶甲胺的新鲜的蒸馏吡啶中，搅拌所得到的溶液21小时。在减压下除去溶剂。用氯仿冲洗残余物3-4次，再用水冲洗氯仿层3-4次。蒸发氯仿，然后用薄层色谱法(TLC)纯化残余物，其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)环己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脱剂。重复TLC两次以进一步纯化，得到氨基取代的脱甲氧基化竹红菌乙素。
产品特征：
UV-vis光谱(λmax)：471nm，625nm；
IR光谱(Vmax)：3435cm-1，2940cm-1，1682cm-1，1604cm-1；
1HNMR(δ)：8.53(s)，8.29(d)，7.77(m)，7.36(d)，6.37(s)，6.59(s)，3.98(s)，2.63(s)，1.78(s)，2.28(s)，4.04(s)，4.06(s)，4.13(s)，1.90(m)，1.62(m)，1.42(m)，1.27(m)，1.00(m)，16.59，16.80ppm；
质谱(m/z)：603(M+)
实施例5
将150mg竹红菌乙素(0.28mmol)溶解在100mL含过量4-吡啶甲胺的新鲜的蒸馏苯中，搅拌所得到的溶液21小时。在减压下除去溶剂。用氯仿冲洗残余物3-4次，再用水冲洗氯仿层3-4次。蒸发氯仿，然后用薄层色谱法(TLC)纯化残余物，其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)环己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脱剂。重复TLC两次以进一步纯化，得到氨基取代的脱甲氧基化竹红菌乙素。
产品特征：
UV-vis光谱(λmax)：398nm，474nm，596nm；
IR光谱(Vmax)：3433cm-1，2928cm-1，1680cm-1，1600cm-1；
1HNMR(δ)：8.56(s)，8.24(d)，7.72(m)，7.28(m)，6.47(s)，6.50(s)，5.25(s)，2.58(s)，2.80(s)，3.90(s)，3.88(s)，3.89(s)，4.02(t)，4.20(t)，-16.07ppm；
质谱(m/z)：603(M+)
实施例6
材料和方法
化学药品
通过以下方法制备竹红菌乙素(HB)，即用定量的氢氧化钾使竹红菌素A(HA)脱水、然后用Ha中和、氯仿提取，并用苯-石油醚重结晶，通过下列方法制备2-丁基氨基-2-脱甲氧基-竹红菌乙素(2-BA-2-DMHB)，即对HB用吡啶中的正丁胺回流、中和，并用氯仿提取。将该产物进行1％柠檬酸-二氧化硅薄层色谱(TLC)，用6∶1∶1石油醚/醋酸乙酯/乙醇(95％)的混合物作洗脱剂，得到三种化合物。它们是目标化合物(流速(Rr)＝0.64)和两种副产物(分别为Rr＝0.74和0∶40)，它们可通过合适的NMR、质谱和元素分析得以确定[12]。用TLC进一步纯化靶化合物、得到产率54％的所需产物2-BA-2-DMHB。通过高性能液相色谱确定HB和2-BA-2-DMHB的纯度，发现高于95％。2-BA-2-DMHB的化学结构如下所示，其吸收光谱见图1。它们的吸收光谱参数如表1所示。将光敏剂以冻干形式保存直至实验时，届时将它们溶解在DMSO中。
表1
氯仿中光敏剂的吸收光谱参数
化合物 λmax(nm)(log6)
HB 466(4.06)，548(3.70)，580(3.52)
2-BA-2-DMHB 463(4.06)，583(4.09)，621(4.10)
从美国Aldrich化学公司购买5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)和9，10-二苯蒽(DPA)。从美国纽约Gibco BRL(大的岛屿)购买Dulbecco改进的极限必需培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、溴化乙锭(EB)和三-(羟甲基)甲胺(Tris)。从Merck(Rahway.NJ，USA)得到K蛋白酶和十二烷基硫酸钠(SDS)。从Promega(Madison.WI，US A)获得琼脂糖。从Sigma化学公司(St.Lows，MO USA)购得核糖核酸酶A、二甲基亚砜(DMSO)、3-(4，5-二甲噻唑-2-基)-2，5-联苯-2H-四唑翁溴化物(MTT)和碘化丙锭(PI)。从Molecular Probes(Eugene，OR)USA)购得Hoechst染料33342(HO342)。其它试剂为分析级。
测定反应性氧类产率
按前面所报道的通过DPA漂白法测定单线态氧的产率。将DMPO的电子自旋共振(ESR)测定和自旋捕获用于测定竹红菌素产生的O2[13]。
细胞培养
在37℃、潮湿的5％CO2培养箱中，将HeLa细胞在含5％FBS和抗生素PS(80U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的DMEM中保持单层培养。
分配比
将光敏剂的分配比定义为[Sen/g细胞]/[Sen/ml培养基]。按前面所述测定这些值[14]。于37℃将指数生长细胞置于DMEM中与HB培养15分钟或与2-BA-2-DMHB培养6小时，范围在0-5μM。在此期间达到稳定态细胞内的水平。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.2％胰蛋白酶/0.5mM EDTA溶液分离细胞、离心-冲洗以去除无限制的染色。在3mI 10mM氚核X-100洗涤剂中分散洗过的颗粒状物(2×106)。在460nm激发这些溶液、用Hitachi-F4500荧光分光光度计获得荧光发射光谱。测定610nm时的荧光、校正对照(不用药物)样本的荧光、并与用已知浓度的HB和2-BA-2-DMHB溶液得到的标准荧光-强度曲线相比较。
实施例7
光敏剂定位
在37℃将生长于玻璃上的细胞在含4μM HB的DMEM中培养15分钟，或在含4μM 2-BA-2-DMHB的DMEM中培养6小时。通过Nikon FXA显微镜目测检验荧光以确定光敏剂定位的位置(激发波长＝400-450nm，发射波长＝600-650nm)。
培养和照射
用含1％FBS的DMEM稀释储备的光敏剂-DMSO溶液。DMSO的最终浓度不超过1％(v/v)，在37℃将75-cm2烧瓶(Costar，Cambridge，MA，USA)中的指数生长HeLa细胞在黑暗处用2-BA-2-DMHB培养6小时或用HB在黑暗处培养15分钟。用PBS中的0.2％胰蛋白酶/0.5mM EDTA溶液分离细胞，离心-冲洗以去除无限制的染色。然后将细胞转移至35-mm平皿(Costar)，1ml英寸皿含3×10s细胞，用不同剂量的光源照射。光源为红光处理仪(Institute of Electronic Academia Sinica，China)，其在样品处的总功率输出(600-700nm时90％以上)为50mW cm-2，用BTY-8204放射计(中国北京太阳能研究所)测得。照射后立即向每一平皿中加入含7.5％FBS的2mlDMEM。然后按如下确定部分细胞的存活、并将剩余的细胞置于培养基中培养直至它们可进行核染色、DNA裂解和流动血细胞计数分析的检查。
细胞存活研究
通过MTT测定法判断细胞存活[11，15，16]。将PDT-处理的细胞转移至平底96-孔平板(Costar)中，每孔中的100μl含1×104细胞，在37℃将此细胞置于CO2培养箱中培养20小时。通过向每一孔中加入10μl MTT(10mgml-1)测定存活力，再在37℃将该混合物培养4小时。然后用二甲基亚砜代替培养基以溶解甲谮(formazan)晶体。在室温下摇动这些平板10分钟并立即在595nm下，Bio-Rad型3550微板读数器(Richmond，CA.USA)上读数。在12个复制品中测定样品、每一实验至少重复两次。PDT处理的细胞的存活符合正常标准，可与单独用光敏剂培养的细胞抗衡。
分别评定每一化合物的暗毒性，然后进行相似的细胞暴露于1m分级剂量15分钟或暴露于2-BA-2-DMHB 2小时的步骤。当细胞露置光敏剂或含有光敏剂时，要小心谨慎以避免整个过程中细胞见光。
在MTT测定法中，将光电位定义为在暗处达到体外LD50所需的化合物与在24J cm-1红光时达到LD50所需的化合物的摩尔浓度比[8]。
编程核的鉴别
在37℃将处理过的细胞和对照细胞置于含5％FBS的DMEM中培养24小时，然后通过分离和离心收集、并置于含5μM HO342的生长培养基中(不含FBS)培养5分钟。采用Nikon FxA显微镜通过荧光显微镜检查核裂解。在420-450nm时用EM监测得到EX波长为330-380nm[14]。活细胞和死亡的细胞两者都具有荧光；通过出现核的凝聚或裂解的明亮荧光区域可确定编程细胞(17)。
DNA电泳
通过一些改进后，按前面所述的方法提取DNA[18]。用0.2％胰蛋白酶/0.5mM EDTA溶液分离细胞(2×106)、用PBS冲洗并通过离心使成颗粒。将细胞颗粒悬浮于含0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、2mM EDTA、100mg/mlK蛋白酶，和SOmM Tris-HC缓冲剂(pH8.0)的溶解缓冲液中。在37℃溶解24小时后，用等体积的水饱和的苯酚/氯仿/异戊基醇(25∶24∶1)提取DNA。收集含水相，用0.5体积醋酸铵和2.5体积冷的无水乙醇沉淀DNA，并在-20℃储存过夜。将DNA溶解在TE(1M Trls-HCI缓冲液中的0.5M EDTA，pH8.0)并在37℃用不含脱氧核糖核酸酶的核糖核酸酶A(100mg/ml)培养1小时。在60V将样品置于含0.5μg ml-1溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶中电泳3小时，并通过UV透照法进行目测检验。
DNA裂解的流动血细胞计数检测
将碘化丙锭(PI)染色技术用于确定细胞DNA的情况[19]。用冰冷的PBS冲洗细胞两次，然后使渗透并于4℃将其固定在80％乙醇中达24小时。用PBS冲洗细胞两次，并于37℃将其悬浮在含核糖核酸酶A(100mg/ml)的PBS中30分钟。此刻将PI溶液(PBS中的10mg/ml)加入核糖核酸酶溶液中的细胞中，于4℃继续培养30分钟。之后，通过Epics XL流动细胞计数器(Coulter，USA)对细胞进行分析。结果以表现出DNA的亚二倍体量(＜2N)的细胞占所分析的细胞的总数的百分比表示。
实施例8.结果
反应性氧类的产率
通过DPA漂白法测定HB(0.76)和2-BA-2-DMHB(0.44)的单线态氧的产率，如表2所示。
表2
DMSO中光敏剂的量子产率
化合物 量子产率 相对的量子产率
(1O2) (O2-)
HB 0.76 1
2-BA-2-DMHB 0.44 2.7
在此采用DMPO自旋-捕获ESR测量法以证实HB和2-BA-2-DMHB的光敏作用所产生的过氧化物阴离子基团的形成。结果显示2-BA-2-DMHB产生O2的能力强于HB产生O2的能力(表2)。
分配比和定位
采用0-5μM的细胞外的药物浓度，我们观察到HB的分配比为49.1±2.2、2-BA-2-DMHB的分布比为107.2±4.3。这些结果显示，当使用等摩尔水平的药物时，2-BA-2-DMHB的细胞内水平约两倍于HB的细胞内水平。
荧光显微镜检测表明，对于HB，出现了很显著的溶酶体摄取，而内质网(ER)染色也较明显，而2-BA-2-DMHB的分配则主要在ER(图2)。
光细胞毒性和致死剂量
光敏剂的剂量产生50％细胞毒性，从每一光敏剂的存活曲线可判断黑暗或光亮中的LD50。HB和2-BA-2-DMHB的体外暗毒性和光毒性的存活曲线如图3所示。黑暗中HB的LD50约为20μM，而2-BA-2-DMHB的LD50大于100μM(图3a)。因此，2-BA-2-DMHB较HB具有更低的细胞毒性。
在将HeLa细胞单独暴露于红光时未见诱导细胞毒性(图3b，c)，将相应的MTT光密度当作100％细胞存活。为了将我们的结果与Estey的结果相比[8]，我们选择24J cm-2作为试验剂量。在此光剂量时，HB的LD50约为2μM，其光电位系数为10，这与EMT6 Ed小鼠肿瘤细胞上的HB相等[8]。然而在此光剂量时，2-BA-2-DMHB在0.25-0.5μM(约0.04μM)浓度范围内产生了50％光毒性。因此，2-BA-2-DMHB具有大于250倍的光电位系数。
Hoechst 33342核染色
使用核染色Hoechst 33342研究染色细胞的形态学。在缺乏光照射时，2-BA-2-DMHB处理的HeLa细胞的核保持完整，类似于正常细胞的核(图4a，b)。然而，在照射后24小时后的2-BA-2-DMHB-感光的细胞内(LD70)发现了编程核(图4c)。
凝胶电泳
核小体间的连接区域的DNA裂解产生许多大小为180-200碱基对的片段是编程细胞死亡的一个典型证明。采用琼脂糖凝胶电泳以检验编程DNA片段的产生。图5表示分别在LD70和LD90用HB和2-BA-2-DMHB处理后24小时在HeLa细胞内观察到的特征性的DNA梯(图5，2.3道和5，6道)。当将细胞单独暴露于光敏剂时未观察到DNA梯(图5，1和4道)。在照射后3小时和6小时未检测到明显的DNA梯(数据未显示)。
流动细胞计数分析
通过流动细胞计数来分析用HB和2-BA-2-DMHB处理的细胞。结果表明在感光的细胞中出现了亚倍体细胞群(图6)。编程HeLa的百分数随照射后的培养时间而增加(图7)。2-BA-2-DMHB诱导的编程细胞死亡较HB更快。还发现只有当编程HeLa的百分比大于20％时才能检测到明显的DNA梯。
结果
人们认为单线态氧主要引起光动力学作用诱导的细胞死亡[22，23]。然而，有趣的是本研究中单线态氧产率(表2)与光电位没有太大的关联。而2-BA-2-DMHB的单线态氧产率大于HB的一半，2-BA-2-DMHD的O2-产率为HB O2-的2.7倍或许在竹红菌素光敏作用诱导的细胞死亡中起着重要的作用。而且，当使用等摩尔药物时，2-BA-2-DMHB的细胞内水平大约两倍于HB；这或许是为什么2-BA-2-DMHB较HB具有更优越的光敏作用的原因之一。
实施例9
现在认为诱导快速编程反应的能力在PDT成功治疗癌症中很重要[25]。上述实施例证明HB和2-BA-2-DMHB诱导了HeLa细胞中的编程细胞死亡，正如DNA片段的Hoechst 33342核染色、琼脂糖凝胶电泳和流动细胞计数检测所证实的(图4-6)。编程HeLa的百分数随照射后的培养时间而增加。照射后3小时和6小时没有明显的典型DNA梯，但在24小时后很清楚，这提示通过酶的方法导致了DNA裂解而不是通过对DNA的直接光化学损害而产生的[11，26]。这些实施例还表明HB主要定位在溶酶体的网状组织和内质网，而2-BA-2-DMHB主要定位在内质网。内质网和线粒体两者都是细胞中的Ca2+库[27]。细胞中的反应性氧类可损害ER和线粒体中的Ca2+运输系统，导致细胞内的Ca2+内稳态的瓦解和持续的Ca2+增加，最终引起编程细胞死亡[28]。
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