一种具有抗癌活性的紫杉烷溴代类似物及其制备方法 【技术领域】
本发明属医药技术领域，具体涉及一种具有抗癌活性的紫杉烷溴代类似物及其制备方法。
背景技术
Wall等1971年首次报道从红豆杉的树皮中分离到紫杉醇(I)，并确认其具有抗癌活性(J.Am.Chem.Soc.，93，2325，1971)。1983年美国国立癌症研究所(NCI)报告紫杉醇对人乳腺癌、结肠癌等实体癌具有抗肿瘤作用。1993年，美国FDA批准该药用于治疗卵巢癌和乳腺癌。紫杉醇被认为是近三十年来天然抗癌药物研究领域最重大的发现，为广大癌症患者带来了福音。
三尖杉宁碱(II)与紫杉醇结构相似，唯一的区别在于它的C13侧链末端是不饱和烯基而不是紫杉醇结构式中的苯环，紫杉醇和三尖杉宁碱的结构式示如下：
I：紫杉醇
II：三尖杉宁碱
这种结构上的细微差别导致了三尖杉宁碱与紫杉醇的色谱行为的相似性，很难通过常规色谱法进行分离，但同时也提供了选择性氧化C13侧链末端的双键，将三尖杉宁碱转化为色谱行为与紫杉醇差异较大的化合物，从而实现色谱分离的可能。在这种策略的指导下，Kingston等(J.Nat.Prod.，55，259，1992)用OsO4处理紫杉醇与三尖杉宁碱的混和物，发现OsO4能选择性地氧化三尖杉宁碱C13侧链末端的双键，使之形成二元醇，而紫杉醇却不受影响。Murray等(US5334732，1994)用含1～10％O3的气体氧化三尖杉宁碱中的烯键，而对紫杉醇不起反应。反应混和物经过硅胶柱层析可以使其中地紫杉醇得到有效的纯化。之后，Murray对上述方法又进行了进一步的改善(US5364747，1994)，在经O3氧化后处理，再加入吉拉德氏酞肼-AcOH的混合物，使得被O3氧化后的产物转变成中间体-吉拉德氏腙复合物，最后通过选择性沉淀或乙酸乙酯-水等萃取把紫杉醇分离出来。
1996年Kingston等(J.Nat.Prod.，59，167，1996)用液溴或吡啶鎓过溴化物、四丁基三溴铵作为氧化剂，室温下在氯仿中反应，可以使紫杉醇和三尖杉宁碱混合物中的三尖杉宁碱转化为2”，3”-二溴化三尖杉宁碱，而紫杉醇却不受影响。反应混合物用二氯甲烷稀释后，依次用10％的Na2S2O3水溶液、蒸馏水和盐水洗涤，经过硅胶层析柱纯化，从而可以分别得到纯度高达95％的紫杉醇以及2”，3”-二溴化三尖杉宁碱。
潘德伊(Pandy)等(US5807888，1998；CN 1190964A，1998)用0.01-0.1M的溴溶液对紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物的氯代溶液(10克粗提物溶于1000ml氯代溶液中)进行溴化，产物经Na2S2O3水溶液、NaHCO3水溶液洗涤后蒸干，连续使用正相硅胶层析柱和反相半制备高效液相色谱纯化反应产物得分别得到了三尖杉宁碱和7-表-三尖杉宁碱溴化反应后的反应产物，抗肿瘤体外和体内实验结果显示，三尖杉宁碱和7-表-三尖杉宁碱的溴化反应产物均具有与紫杉醇相类似的抗癌活性。
7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱(III)是另一种紫杉烷类化合物，广泛存在于云南红豆杉等红豆杉科植物中，其母环结构与三尖杉宁碱的差异主要是C7位的构型变化和C10位的羟基化，而侧链结构则与三尖杉宁碱完全相同，研究发现其反相色谱行为与紫杉醇和三尖杉宁碱非常相似。7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱的结构如下：
III：7-表10-去乙酰基-三尖杉宁碱
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种可替代紫杉醇和紫杉醇衍生物的具有抗癌活性的紫杉烷溴代类似物及其制备方法。
本发明提出的具有抗癌活性的紫杉烷，是一种分离并纯化的2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱的两个非对映异构体，它们在许多肿瘤细胞系中显示出强的体外类紫杉醇抗肿瘤活性。2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱的结构式如下：
其中
为V：(2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱
为VI：(2”S，3”R)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱
2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱的两个非对映异构体是由含有紫杉醇、7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱、三尖杉宁碱、7-表-10-去乙酰基紫杉醇以及其他紫杉烷化合物的未纯化的复杂混合物制得。其制备方法是选择性的溴化7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱C13侧链上的不饱和双键，同时留下分子的其他部分和混合物中的其他重要的紫杉烷化合物(如紫杉醇、7-表-10-去乙酰基紫杉醇)不受触动。
由反应混合物中分离纯化单个的2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和2”，3”-二溴三尖杉宁碱是用高效液相色谱法完成。这些化合物显示出很强的抗肿瘤体外活性。
进行选择性溴化的方法是使7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和/或三尖杉宁碱在一定条件下反应，包括能有效地使这些化合物的2”、3”侧链部分选择性溴化的温度和时间，然后将所形成的极性较小的2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和2”，3”-二溴三尖杉宁碱非对映异构体混合物与紫杉醇和其他紫杉烷类化合物分离。单个的非对映异构体可以通过高效液相色谱法分离得到。
本发明方法的具体步骤如下：
1 溴化反应，所使用的原料为含有紫杉醇、7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱、三尖杉宁碱、7-表-10-去乙酰基紫杉醇以及其它紫杉烷类化合物的混合物，反应溶剂为氯代溶剂，如氯仿、CHCl2(二氯甲烷)、CHCl3(三氯甲烷)和CCl4(四氯化碳)中的任意一种，反应在避光的冰水浴中进行，反应时间为30～80分钟。
2 色谱分离，包括正相制备色谱分离和反相半制备色谱分离两个过程。首先使用正相制备色谱系统，用乙酸乙酯和正己烷按1∶1～1∶1.5体积比的混合物作为流动相，分离步骤(1)中得到的反应混合物，正相分离的产物为2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和2”，3”-二溴-三尖杉宁碱的混合物。再使用水和乙腈按55∶45～65～35体积比的混合物为流动相，在反相C18半制备柱上实现2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱的两个非对映异构体的分离。分离得到的新的2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱的两个非对映异构体的化学结构用常规的分析和物理化学方法阐明。上述制备方法的流程图如下：
其中
为VII：(2”R，3”S)-二溴三尖杉宁碱
为VIII：(2”S，3”R)-二溴三尖杉宁碱
其中
为V：(2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱
为VI：(2”S，3”R)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱
在本发明的一项实施例中，将主要含有紫杉醇、7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱、三尖杉宁碱、7-表-10-去乙酰基紫杉醇(IV)的紫杉烷混合物溶于惰性溶剂(如四氯化碳、氯仿、二氯甲烷)中，然后用超过化学计量数量的溴处理。例如，在一种典型的处理方法中，用溴处理溶于氯仿中的含大约14.8％重量的紫杉醇、36％重量的7-表-10-去乙酰基紫杉醇、25％重量的7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和大约16％重量的三尖杉宁碱的混合物，结果以定量产率形成了2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和2”，3”-二溴三尖杉宁碱非对映异构体的混合物。
所用的主要设备：
(1)反相分析型高效液相色谱。美国惠普公司的Agilent 1100系列液相色谱，包括溶剂箱、四元梯度泵、真空脱气机、标准微量自动进样器、恒温柱温箱、可变波长检测器(VWD)。赛洋1.2G台式计算机(Agilent ChemStation 4.09.01色谱工作站)。反相分析型HPLC条件使用两种不同的色谱柱及相应的流动相体系，分别为：日本Shiseido公司CAPCELL PAK C18分析色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇∶乙腈∶水(32∶32∶36)，柱温为35℃，流速为1.0ml/min，检测波长227nm； Metachem Taxsil-3紫杉醇专用柱(4.6×250mm，5μm)流动相为水∶乙腈(54∶46)，柱温为40℃，流速为0.8ml/min，检测波长为227nm，每次进样量为10μl。
(2)正相制备型高效液相色谱。大连Elite公司制备型HPLC，主要包括两个P280高压恒流泵和一台UV200II型紫外可变波长检测器。Merck自装C18柱(50×250mm，7μm)，流动相为乙酸乙酯∶正己烷(1∶1～1∶1.5，体积比)，流速为50ml/min，检测波长为254nm。
(3)反相半制备型高效液相色谱。由Agilent 1100系列分析型高效液相色谱系统改装而成，加装一个1500μl的Seat。Kromasil KR100-5 C18半制备柱(250×10mm，5μm)，流动相为水∶乙腈(55∶45～65∶35，体积比)，流速5ml/min，柱温为35℃，检测波长为227nm。
(4)LC/MS(液质联用)。Thermo Finnigan公司的LCQ ADVANTAGE MS SYSTERM，包括TSP高效液相色谱系统和LCQ ADVANTAGE质谱检测仪，Xcalibur 1.0.01，MetaChem公司的Taxsil-3柱(4.6mm I.D.×250mm，5μm)。流动相为ACN∶H2O(体积比49∶51)，流速0.8ml/min，柱箱温度40℃，检测波长为227nm。质谱(MS)检测条件：ESI(电喷雾化学解离)，全范围扫描150-2000，壳气70单位，辅助气15单位，源电压6KV，加热毛细管温度250℃，蒸发器温度465℃。
(5)NMR(核磁共振)。Bruker DM-500MHz核磁共振仪，采用CDCl3为内标。
根据本发明，发现7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱的溴化产物，即2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱，在许多肿瘤中显示出很强的体外类紫杉醇功效，从而为紫杉醇和紫杉醇衍生物(如Taxotere)提供了一种可能的替代物。实验证明，它们可用于制备抗肿瘤药物，如抗人乳腺癌、人肺癌、人卵巢癌等的药物。
【附图说明】
图1 溴化反应进程的HPLC图
图2 溴化反应产物的正相分离HPLC图
图3 正相分离过程中合并所得部分馏分的反相HPLC分析图
图4 二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱的两个非对映异构体的反相半
制备HPLC图
图5 二溴三尖杉宁碱的两个非对映异构体的反相半制备HPLC图
图6 四种溴化产物的反相HPLC分析图
图7 (2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(V)的ESI-MS图
图8 (2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(VI)的ESI-MS图
图9 (2”R，3”S)-二溴-三尖杉宁碱(VII)的ESI-MS图
图10 (2”S，3”R)-二溴-三尖杉宁碱(VIII)的ESI-MS图
图11 (2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(V)的1H核磁共振谱
图
图12 (2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(V)的13C核磁共振谱
图
图13 (2”S，3”R)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(VI)的1H核磁共振谱
图
图14 (2”S，3”R)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(VI)的13C核磁共振谱
图
【具体实施方式】
实施例1
含有7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱、三尖杉宁碱和其它紫杉烷类化合物的部分纯化混合物的溴化
将3g红豆杉粗提物在磁力搅拌器的作用下溶解于30ml氯仿中，冰水浴中冷却0.50小时。向三个反应容器中分别缓慢滴加100μl液溴，在0℃冰水浴中、避光、搅拌的条件下反应。从滴加液溴反应开始，每隔10min，从反应容器中定量移取1ml反应液至分液漏斗中，再加入5ml 10％Na2S2O3溶液还原其中过量的溴。用干燥的5ml小试管收集下层有机相，从分离出的有机相中移取0.50ml溶液放入干燥的茄形瓶中，分别在室温下蒸干后，溶解于2.50ml甲醇中，用HPLC检测。TLC跟踪检测显示反应进行到第50min时基本结束，此时分别以30ml 10％Na2S2O3溶液和蒸馏水洗涤反应混合液，分离有机相，水相用氯仿再次萃取，合并有机相，有机相经蒸馏水洗涤三次，室温下减压旋转蒸发至干，再进行真空干燥，得到3.21g干燥的淡黄色固体。反应过程的HPLC监测图如图1所示，反应开始后，7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和三尖杉宁碱的色谱峰逐渐减小，新生成了两队双峰，反应进行到50分钟时，7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和三尖杉宁碱的色谱峰完全消失，说明7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和三尖杉宁碱已经被完全反应。
实施例2
溴化反应产物的正相制备色谱分离
将上述反应混合物3g溶解于50ml 1∶1的乙酸乙酯和正己烷中，用P280高压恒流泵进样，乙酸乙酯∶正己烷(1∶1～1∶1.5)为流动相等度淋洗，共收集馏分30瓶，100ml/瓶。将各馏份分别减压蒸干，用反相HPLC检测。所有的馏分分成3份分别合并，其中馏分1～10主要为2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱的两个非对映异构体，馏分11～22主要为7-表10-去乙酰基紫杉醇和2”，3”-二溴三尖杉宁碱的两个非对映异构体，馏分23～30为高纯度的紫杉醇。将各个馏分分别减压蒸干。正相制备过程色谱图和反相分析结果分别见图2和图3。
实施例3
单个的2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和2”，3”-二溴三尖杉宁碱的非对映异构体的分离
单个的2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱和2”，3”-二溴三尖杉宁碱的非对映异构体的分离是由反相半制备高效液相色谱系统完成的。将100mg干燥的主要含有2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱的两个非对映异构体的固体溶于1.5ml甲醇中，然后进样并使用水∶乙腈(60∶40)的流动相淋洗，两个非对映异构体分别在27.3min和29.1min出峰。单个的2”，3”-二溴三尖杉宁碱的非对映异构体的分离过程与上述过程基本一致，进样后使用水∶乙腈(62∶38)的流动相淋洗，两个非对映异构体在28.4min和29.6min出峰。将上述分离所得四种单个的非对映异构体分别减压蒸干，分别得到。分离过程和四种单个的非对映异构体的结构见流程式1所示。反相半制备分离过程色谱图分别见图4和图5。分离后四个单个非对映异构体的反相HPLC分析图如图6所示，纯度分别都达到了98％以上。质谱图见图7-10。新制备的紫杉烷溴代类似物，即2”，3”-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱的两个非对映异构体的1H和13C核磁共振归属分别见表1和表2。核磁共振谱图见图11-14。
实施例4
体外抗肿瘤活性实验
体外抗肿瘤活性实验由上海医药工业研究院协助进行测定。MCF-7(人乳腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、A2780(人卵巢癌细胞)和P388(小鼠白血病细胞)等三种肿瘤细胞被用于测定新的紫杉烷溴代类似物即：(2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱和(2”S，3”R)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱的单体以及两个非对映异构体的等比例(重量)混合物的体外抗肿瘤活性。三种肿瘤细胞分别于RPMI1640+15％NBS+双抗的无菌培养液中，在37℃下培养1～2周，然后用于实验。药品用DMSO(Merck)助溶后，用PBS(-)配成10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001μg/ml的溶液。肿瘤细胞与药品作用72小时后用MTT法分析抗肿瘤活性。为了和新制备的紫杉烷溴代类似物的抗肿瘤活性进行比较，紫杉醇、2”，3”-二溴三尖杉宁碱的两个非对映异构体的单体以及它们按照等比例(重量)混合的混合物也按上述方法进行抗体肿瘤活性实验。体外抗肿瘤活性实验结果见表3。如表3所示，对于MCF-7(人乳腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、A2780(人卵巢癌细胞)这三种人体肿瘤细胞，(2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(V)和(2”S，3”R)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(VI)在10μg/ml时的IC％值均略大于同样浓度下紫杉醇的IC％值，且对于A2780(人卵巢癌细胞)，(2”S，3”R)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(VI)的IC50仅为紫杉醇的IC50的27％。表3中的实验结果充分说明本发明中的(2”S，3”R)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(VI)具有比紫杉醇更强的体外抗癌活性，(2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(V)的体外抗肿瘤活性也与紫杉醇相似；而它们按一定比例的混合物具有比紫杉醇相似的体外抗癌活性。
续流程式1
V(2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱VI (2”S，3”R)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱
VII (2”R，3”S)-二溴三尖杉宁碱 VIII (2”S，3”R)-二溴三尖杉宁碱
表1 (2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(V)和(2”S，3”R)
-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱(VI)的1H核磁共振归属
V VI
H
δH J(Hz) 1H×1H-COSY δH J(Hz) 1H×1H-COSY
2 5.73(d，1H) 7.37 3H 5.72(d，1H) 7.30 3H
3 3.91(d，1H) 7.37 2H 3.91(d，1H) 7.30 2H
5 4.90(dd，1H) 3.92，3.76 6H 4.89(dd，1H) 3.81，3.76 6H
6 2.29(m，2H) 5H，7H 2.29(m，2H) 5H，7H
7 3.68(dd，1H) 2.27，2.35 6H，7-OH 3.68(dd，1H) 2.18，2.60 6H，7-OH
10 5.42(s，1H) 5.43(s，1H) 10-OH
13 6.22(t，1H) 8.45 14H 6.24(t，1H) 8.95 14H
14 2.32(m，2H) 13H 2.31(m，2H) 13H
16 1.09(s，3H) 1.09(s，3H)
17 1.24(s，3H) 1.23(s，3H)
18 1.75(s，3H) 1.74(s，3H)
19 1.72(s，3H) 1.72(s，3H)
20 4.39(t，2H) 9.39 4.39(t，2H) 8.93
23 2.44(s，3H) 2.46(s，3H)
2’ 4.71(d，1H) 3’H， 4.72(d，1H) 3’H，2’-OH
3’ 5.56(dd，1H) 1.76，1.95 2’H，1aH 5.58(dd，1H) 1.79，1.96 2’H，1aH
3” 4.60(q，1H) 4”H 4.60(q，1H) 4”H
4” 1.74(m，3H) 3”H 1.73(m，3H) 3”H
5” 1.99(s，3H) 1.94(s，3H)
1-OH not observed not observed
7-OH 4.58(two s，1H) 7H 4.58(two s，1H) 7H
10-OH not observed 4.13(s，1H) 10H
2’-OH not observed 3.27(d，1H) 2’H
ArH and NH 7.36-8.12(m，11H) 7.36-8.11(m，11H)
表2 (2”R，3”S)-二溴-7-表-10-去乙酰基-三尖杉宁碱(V)和(2”S，3”R)-二溴
-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(VI)的13C核磁共振归属
VII VIII
C DEPT
δC 1H×13C-COSY δC 1H×13C-COSY
1 C 79.2 79.3
2 CH 75.5 2H 75.5 2H
3 CH 40.2 3H 40.2 3H
4 C 82.1 82.1
5 CH 82.6 5H 82.6 5H
6 CH2 35.3 6H 35.3 6H
7 CH 75.8 7H 75.9 7H
8 C 57.3 57.2
9 C 214.9 214.9
10 CH 77.2 10H 77.3 10H
11 C 135.8 135.7
12 C 137.7 137.7
13 CH 72.7 13H 72.6 13H
14 CH2 36.3 14H 36.3 14H
15 C 42.5 42.5
16 CH3 20.5 16H 20.6 16H
17 CH3 26.0 17H 26.0 17H
18 CH3 14.3 18H 14.4 18H
19 CH3 16.7 19H 16.7 19H
20 CH2 77.0 20H 77.0 20H
21 C 167.0 167.1
22 C 172.2 172.2
23 CH3 22.5 23H 22.5 23H
1’ C 172.3 172.3
2’ CH 72.8 2’H 72.7 2’H
3’ CH 55.2 3’H 54.9 3’H
1” C 168.7 168.8
2” C 76.7 76.8
3” CH 54.3 3”H 54.1 3”H
4” CH3 22.6 4”H 22.7 4”H
5” CH3 26.7 5”H 27.1 5”H
1a 137.3 137.2
2a 126.5 126.7
3a 128.3 128.4
4a 128.7 128.7
1b 129.3 129.3
2b 130.1 130.2
3b 129.0 129.0
4b 133.7 133.7
表3 体外抗肿瘤活性实验结果
MCF-7 A549 A2780
样品
IC50(μg/ml) 10μg/ml时 IC50(μg/ml) 10μg/ml时 IC50(μg/ml) 10μg/ml时
号
IC％ IC％ IC％
Taxol ＞10 30.53 ＞10 27.37 0.22 60.89
V ＞10 44.23 ＞10 32.56 0.16 72.94
VI ＞10 45.27 ＞10 36.18 0.0599 64.19
VII ＞10 44.99 ＞10 36.61 0.445 61.55
VIII 1.63 55.01 ＞10 36.01 0.052 74.92
V+VI 8.51 50.57 ＞10 37.48 1.35 66.01
VII+VIII 3.19 51.98 ＞10 34.72 0.0001 64.36