新型化合物 【发明领域】
本发明涉及噻吩羧酰胺衍生物，制备其过程中所用的方法和中间体，含有它们的药物组合物及其在治疗方面的用途。
【发明背景】
NF-κB(核因子κB)家族由转录因子的Rel家族的同源和异源二聚体组成。这些转录因子的关键作用在于诱导和协调促炎症反应基因的广谱表达，促炎症反应基因包括细胞因子类、趋化学因子、干扰素类、MHC蛋白、生长因子和细胞粘附分子(参见文献Verma等，Genes Dev.9：2723-35，1995；Siebenlist等，Ann.Rev.Cell.Biol.10：405-455，1994；Bauerle和Henkel，Ann.Rev.Immunol.，12：141-179，1994；Barnes和Karin，New Engl.J.Med.，336：1066-1071，1997)。
最常见的Rel家族二聚物复合体由p50 NFkB和p65 RelA组成(Baeuerle和Baltimore，Cell 53：211-217，1988；Baeuerle和Baltimore，Genes Dev.3：1689-1698，1989)。在静息状况下，NF-κB二聚物被抑制性蛋白IκB家族成员保留于细胞质中(Beg等，Genes Dev.，7：2064-2070，1993；Gilmore andMorin，Trends Genet.9：427-433，1993；Haskil等，Cell 65：1281-1289，1991)。然而，当大量细胞因子或其它的外部刺激导致细胞活化时，IκB蛋白在其两个关键丝氨酸残基上发生磷酸化作用(Traenckner等，EMBO J.，14：2876，1995)并且然后被泛素化作用以及发生被蛋白酶体-介导的降解(Chen，Z.J.等，Genes and Dev.9：1586-1597，1995；Scherer，D.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：11259-11263，1996；Alkalay，I.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：10599-10603，1995)。释放的NF-κB然后可转位到细胞核并激活基因转录(Beg等，Genes Dev.，6：1899-1913，1992)。
已有大量的外部刺激显示出能激活NF-κB(Baeuerle，P.A.，以及Baichwal，V.R.，Adv.Immunol.，65：111-136，1997)。尽管大多数的NF-κB激活因子可导致IκB磷酸化，但很清楚有多个途径可得到此关键结果。受体-介导的NF-κB激活作用依赖于受体和衔接子/信号分子(例如，TRADD、RIP、TRAF、MyD88)和相关激酶(IRAK、NIK)之间的特异性相互作用(Song等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：9792-9796，1997；Natoli等，JBC 272：26079-26082，1997)。环境应激如紫外线和γ-射线似乎可通过另一种较少定义的机制刺激NF-κB。
最近的出版物已部分地阐明了NF-κB的激活过程。已经识别出了三种调节特异性IκB/NF-κB相互作用的关键酶：NF-κB诱导激酶(NIK)(Boldin等，Cell 85：803-815，1996)、IκB激酶-1(IKK-1)(Didonato等，Nature 388：548，1997；Regnier等，Cell 90：373 1997)和IκB激酶-2(IKK-2)(Woronicz等，Science278：866，1997；Zandi等，Cell 91：243，1997)。
NIK似乎代表由肿瘤坏死因子和白介素-1所引发的NF-κB信号级联的通用调节因子，并是kB磷酸化的强效诱导因子。然而MK不能直接使IκB磷酸化。
IKK-1和IKK-2被认为直接位于NIK地下游并能直接使所有的三种IκB亚型磷酸化。IKK-1和IKK-2在氨基酸水平上有52％是相同的但表现出相似的底物特异性；然而，表现出来的酶活性是不同：IKK-2比IKK-1强数倍。诱变研究以及表达数据，暗示IKK-1同IKK-2能通过其C-末端亮氨酸拉链基列来形成同源和异源二聚体，以异源二聚体的形式为优选(Mercurio等，Mol.Cell Biol.，19：1526，1999；Zandi等，Science；281：1360，1998；Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：9319，1998)。
MK、IKK-1和IKK-2都是丝氨酸/苏氨酸激酶。最近的资料显示酪氨酸激酶在调节NF-κB的激活作用方面也发挥作用。许多研究表明TNF-α诱导的NF-κB激活作用可被蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)和酪氨酸激酶调节(Amer等，JBC 273：29417-29423，1998；Hu等，JBC 273：33561-33565，1998；Kaekawa等，Biochem.J.337：179-184，1999；Singh等，JBC 271 31049-31054，1996)。这些酶的作用机理似乎在于调节IκB的磷酸化状态。例如，PTP1B和未确证的酪氨酸激酶似乎直接控制IκB-α上的赖氨酸残基(K42)的磷酸化，其随后对邻近丝氨酸残基的可及性有重要的影响，此丝氨酸残基为通过IKK进行磷酸化作用的靶。
一些小组研究表明IKK-1和IKK-2与其他蛋白一起形成了“信号传导体(signalosome)”结构的一部分，所述其他蛋白包括IKAP(Cohen等，Nature395：292-296，1998；Rothwarf等，Nature 395：297-300，1998)、MEKK-1、推定的MAP激酶磷酸酶(Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：93 19-9324，1998)以及NIK和IκB。目前不但得到的资料暗示尽管IKK-1和IKK-2都同NIK相结合，但它们却被不同地活化，并且因而可能代表了激活NF-κB的信号谱的重要整合点。重要地，已经发现MEKK-1(推定的信号传导体和紫外线的靶，LPS诱导信号分子和小GTP酶成分之一)可激活IKK-2但不能激活IKK-1。类似地，IKK-1的NIK磷酸化导致IKK-1活性的显著增加但对IKK-2只有很小的影响(参见文献Mercurio，F.以及Manning，A.M.，Current Opinionin Cell Biolo gy，11：226-232，1999)。
NF-κB活化的抑制可能在炎性疾病治疗方面有广泛的用途。
不断地有证据表明NF-κB信号传导在癌症和转移的发展方面起了重要的作用。已有记载表明在大量肿瘤型和肿瘤细胞系中有c-Rel、NF-κB2或IκBα的异常表达，并且目前有资料显示通过IKK2的组成性NF-κB信号传导在大量的肿瘤细胞系中发生。此活性与生长因子信号传导例如自分泌环的建立的多种上游缺陷相联系，或癌基因产物如Ras、AKT、Her2的出现有关，后者涉及IKK复合体的活化。组成型NF-κB活性被认为有助于肿瘤发生，其通过一系列抑制细胞凋亡的基因如A1/Bfi-1、IEX-1、XIAP的激活作用，导致细胞死亡途径的抑制，及促进细胞生长的细胞周期蛋白D1的转录上调。其它资料显示此途径也可能涉及细胞黏附和细胞表面蛋白酶的调节。这一结果暗示在转移的发展方面NF-κB活性可能发挥其它的作用。NF-κB活性介入肿瘤发生的有效证据包括肿瘤细胞对修饰形式的IκBα(超阻遏蛋白IκBα)表达的体外和体内抑制。
除了在许多肿瘤型中观察到组成性NF-κB信号传导以外，已有报道指出NF-κB也可响应于某些类型的化学疗法而被活化。通过超阻遏蛋白型IκBα的表达对NF-κB的活化抑制，结合化学疗法治疗，已显示出可提高化学疗法在异种移植模型中的抗肿瘤效果。因而NF-κB活性也与可诱导化疗抗性有关。
【发明内容】
根据本发明，提供了式(I)化合物和其可药用盐，
其中：
R1代表NH2或R1代表甲基，任选被一个或多个独立地选自C1-C4烷基、C3-C6环烷基、卤素、羟基、C1-C4烷氧基、S(O)vCH3和NR4R5的基团取代；
X代表O或S；
R2代表氢、卤素、氰基、硝基、-NR6R7、-CONR6R7、-COOR6、-NR6COR7、-S(O)mR6、-SO2NR6R7、-NR6SO2R7、C1-C2烷基、三氟甲基、C2-C3链烯基、C2-C3炔基、三氟甲氧基、C1-C2烷氧基或C1-C2链烷酰基；
A代表稠合二环体系，其中一个环为苯环或含有1～3个独立地选自O、N和S杂原子的5～7元芳香杂环；并且另一个环为稠合苯环或含有1～3个独立地选自O、N和S杂原子的稠合5～7元芳香杂环；或任选地包含1～3个分别选自氧、氮和硫杂原子的稠合5～7元饱和环；该稠合二环体系可任选地被一个或多个独立地选自卤素、氰基、硝基、-NR8COR9、-S(O)sR8、-SO2NR8R9、-NR8SO2R9和C1-C6烷基的取代基取代；
n代表0、1或2的整数；并且当n代表2时，每个R3基团可以被独立地加以选择；
R3代表-W-Y-Z基团，其中：
W代表O、S(O)r，、NR13、CH2、-CH2-O-或化学键；
Y代表化学键或Y代表基团-(CH2)p-X-(CH2)q-，其中p和q独立地代表0、1或2的整数；并且X代表O、-CO-或CR14R15；
R14和R15独立地代表H、CH3和F；
或R14代表H或CH3并且R15代表羟基或OCH3；
或基团CR14R15一起代表C3-C6环烷基；
Z代表：
(a)苯环或含有1～3个独立地选自O、N和S杂原子的5-或6-元芳香杂环；该苯基或芳香杂环任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、氰基、-NR16R17、-CONR16R17、-COOR16、-COR16-NR16COR17、-S(O)uR16、-SO2NR16R17、-NR16SO2R17、羟基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基；该烷基或烷氧基任选进一步被一个或多个选自卤素、氰基、羟基、C1-C4烷氧基和NR18R19的基团取代；或
(b)任选地含有1或2个独立地选自O、N和S杂原子的饱和3～7元环，并且任选地包含羰基；该饱和环任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、氰基、-NR16R17、-CONR16R17、-COOR16、-COR16、-NR16COR17、-S(O)uR16、-SO2NR16R17、-NR16SO2R17、羟基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基；该烷基或烷氧基任选进一步被一个或多个选自卤素、氰基、羟基、C1-C4烷氧基和NR18R19的基团取代；或
(c)Z代表羟基、C1-C6烷氧基、CF3、CHF2、CH2F或NR20R21，其中R20和R21独立地为氢或任选地被C1-C4烷氧基取代的C1-C6烷基；
R4和R5独立地代表H或C1-C4烷基；或基团NR4R5代表5-或6-元饱和的氮杂环，任选地还含有O、S或NR23基团；其中R23为氢或C1-C4烷基；
R6和R7独立地代表H或C1-C2烷基；
R8和R9独立地代表H或C1-C6烷基；
R13代表H或C1-C4烷基；
R16和R17独立地代表H或C1-C6烷基；或基团NR16R17代表5-或6-元饱和的氮杂环，任选地还含有O、S或NR24基团；其中R24为氢或C1-C6烷基；
R18和R19独立地代表H或C1-C4烷基；或基团NR18R19代表5或6元饱和的氮杂环，任选地还含有O、S或NR25基团；其中R25为氢或C1-C4烷基；
m、r、s、u和v独立地代表0、1或2的整数。
某些式(I)化合物能以立体异构的形式存在。应当理解此发明包含式(I)化合物的所有几何异构体和光学异构体以及包括其外消旋体的混合物。互变异构体及其混合物也构成了本发明的一方面。
在一个实施方案中，X代表氧。
在另一个实施方案中，R1代表CH3或NH2。在一个更特定的实施方案中，R1代表NH2。
式(I)化合物和其可药用盐的优点在于它们是酶IKK2的抑制剂。
本发明还提供了一种制备式(I)化合物或其可药用盐、对映异构体或外消旋体的方法。
根据本发明也提供用作药物的式(I)化合物或其可药用盐。
本发明的另一方面提供式(I)化合物或其可药用盐在用于治疗或预防疾病或病症的药物的制备中的用途，在所述的疾病或病症中抑制IKK2的活性是有利的。
本发明的另一方面提供式(I)化合物或其可药用盐在用于治疗或预防炎性疾病的药物的制备中的用途。
根据本发明也提供了一种治疗或降低疾病或病症风险的方法，在所述的疾病或病症中抑制IKK2的活性是有利的，此方法包括给患有或处于该疾病或病症风险中的人施用治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐。
本发明也提供治疗或减少炎性疾病风险的方法，此炎性疾病存在于患有或处于该疾病风险中的人体内，其中该方法包括给患者服用治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐。
在特定的实施方案中，稠合二环体系A代表任选取代的喹啉、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、四氢异喹啉、1，3-苯并二氧环戊烷(亚甲基二氧基苯基)和1，4-苯并二氧杂己烷(亚乙二氧基苯基)。
在一个实施方案中，式(I)中的基团R2代表H、卤素或C1-C2烷基。在另一个实施方案中，基团R2代表H或甲基。在另一个实施方案中，式(I)中的基团R2代表H。
本发明的具体化合物包括在此所列举的化合物及其可药用盐：
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(2-苯并呋喃基)-3-噻吩羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(3-喹啉基)-3-噻吩羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(8-喹啉基)-3-噻吩羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(2-苯并噻吩基)-3-噻吩羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(3-苯并噻吩基)-3-噻吩羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(5-吲哚基)-3-噻吩羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-4-甲基-5-(1，4-苯并二氧杂环己-6-基)-3-噻吩羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-4-甲基-5-(3-吲哚基)-3-噻吩羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-4-甲基-5-(1，3-苯并二氧杂环戊烯(benzodioxo)-5-基)-3-噻吩羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(1H-吲哚-2-基)噻吩-3-羧酰胺；
3-[(氨基羰基)氨基]-5-(1-苯并噻吩-3-基)噻吩-2-羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(2-吗啉-4-基甲基苯并[b]噻吩-5-基)噻吩-3-羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[4-(2-吗啉-4-基乙氧基)-1-苯并噻吩-2-基]-3-噻吩羧酰胺；
2-[(氨基羰基)氨基]-5-{2-[4-甲基苯基磺酰基]-1，2，3，4-四氢异喹啉-6-基}噻吩-3-羧酰胺；
3-[(氨基羰基)氨基]-5-(1-苯并噻吩-2-基)噻吩-2-羧酰胺。
除非另有说明，涉及的术语“C1-C6烷基”在此表示含有1～6个碳原子的直或支链烷基。这些基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。术语“C1-C2烷基”和“C1-C4烷基”可被类似的解释。
除非另有说明，涉及的术语“C2-C3链烯基”在此表示含有2或3个碳原子并含有至少一个碳-碳双键的直或支链烃基。这些基团的实例包括乙烯基和丙烯基。术语“C2-C6链烯基”可被类似的解释。
除非另有说明，涉及的术语“C2-C3炔基”在此表示含有2或3个碳原子并含有一个碳-碳三键的直链烃基。这些基团的实例包括乙炔基和丙炔基。术语“C2-C6炔基”可被类似的解释。
除非另有说明，涉及的术语“C3-C6环烷基”在此表示含有3～6个碳原子的饱和碳环。这些基团的实例包括环丙基、环戊基和环己基。
除非另有说明，涉及的术语“C1-C4烷氧基”在此表示含有1～4个碳原子的直或支链烷氧基。这些基团的实例包括甲氧基、乙氧基和异丙氧基。术语“C1-C2烷氧基”和“C1-C6烷氧基”可被类似的解释。
除非另有说明，涉及的术语“C1-C2链烷酰基”在此表示甲酰基或乙酰基。
除非另有说明，涉及的术语“卤素”在此表示氟代、氯代、溴代和碘代。
含有1～3个独立地选自O、N和S杂原子的5～7元芳香杂环的实例包括呋喃、噻吩、吡咯、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、咪唑、吡唑、三唑、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪。术语“含有1～3个独立地选自O、N和S杂原子的5或6元芳香杂环”可被类似的解释。
任选地含有1～3个独立地选自O、N和S杂原子的饱和5～7元环的实例包括环戊基、环己基、四氢呋喃、吡咯烷、哌啶、哌嗪和吗啉。
稠合二环体系，其中一个环为苯环或含有1～3个独立地选自O、N和S杂原子的5～7元芳香杂环；并且另一个环为稠合苯环或含有1～3个独立地选自O、N和S杂原子的稠合5～7元芳香杂环；或任选地含有1～3个独立地选自氧、氮和硫杂原子的稠合5～7元饱和环的实例，包括萘基、喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、苯并咪唑、1，3-苯并二氧环戊烷(亚甲二氧基苯基)和1，4-苯并二氧杂环己烷(亚乙二氧基苯基)。
任选地还含有O、S或NR基团的5或6元饱和氮杂环的实例包括吡咯烷、哌啶、哌嗪和吗啉。
任选地含有1或2个独立地选自O、N和S杂原子并任选地含有羰基的饱和3～7元环的实例包括环丙基、环己基、吡咯烷、哌啶、吗啉、四氢呋喃、哌啶-2-酮和哌啶-4-酮。
本发明也提供了一种制备式(I)化合物或其可药用盐、对映异构体或外消旋体的方法，其包括：
(a)将式(II)化合物：
其中A、R2、R3和n如式(I)中所定义，与异氰酸酯或异硫氰酸酯或酰基衍生物R1-CO-L进行反应，其中L为离去基；或
(b)将式(III)化合物
其中R3、n和A如式(I)中所定义，与式(IV)化合物进行反应，
其中X、R1和R2如式(I)中所定义并且LG代表离去基；或
(c)将式(V)化合物
其中R3、n和A如式(I)中所定义并且LG代表离去基，与式(VI)化合物进行反应，
其中X、R1和R2如式(I)中所定义；
并且若必须，将得到的式(I)化合物或其另一种盐转化为其可药用盐；或将得到的式(I)化合物转化为另一种式(I)化合物；并且若需要，将得到的式(I)化合物转化为其光学异构体。
在方法(a)中，适合的异氰酸酯试剂包括三甲基甲硅烷基异氰酸酯、三甲基甲硅烷基异硫氰酸酯、氯磺酰异氰酸酯、三氯乙酰基异氰酸酯和异氰酸钠。与三甲基甲硅烷基异氰酸酯或三甲基甲硅烷基异硫氰酸酯的反应，可在溶剂如二氯甲烷/二甲基甲酰胺中、在适合的高温如反应混合物的回流温度下进行。与氯磺酰异氰酸酯的反应，可在溶剂如甲苯中、在环境温度下进行。与异氰酸钠的反应可在适合的溶剂系统如含水乙酸中、在环境温度下进行。三氯乙酰异氰酸酯的反应可在适合的溶剂体系如乙腈中、在环境温度下进行，并随后用氨水处理混合物得到通式(I)的化合物。适合的式R1-CO-L酰基衍生物包括酰卤、特定的酰氯和酸酐。与这些酰基衍生物的反应通常在环境温度、在适合的溶剂如吡啶或者在如有适合的碱如三乙胺或吡啶存在下的二氯甲烷的溶剂中进行。其中X代表O的式(I)化合物，可通过与如Lawesson试剂反应，随后被转化为相应的其中X代表S的式(I)化合物。
在方法(b)和(c)中，式(III)和(IV)化合物或者式(V)和(VI)化合物一起在催化作用下反应，此催化作用由过渡金属如钯或镍的配位化合物来提供。在式(III)和(VI)的化合物中，在适当的条件下，“金属”可以是金属或半金属，如镁、锌、铜、锡、硅、锆、铝或硼。适合的离去基包括碘代、溴代、氯代、三氟甲磺酸酯(triflate)或膦酸酯。
本领域的技术人员应当意识到，在本发明的方法中，起始反应物或中间体化合物中的某些官能团如羟基或氨基可能需要用保护基进行保护。因式(I)化合物的制备，在适当的阶段，可能涉及一个或多个保护基的加入与脱除。
官能团的保护和脱保护在‘Protective Groups in Organic Chemistry’，edited by J.W.F.McOmie，Plenum Press(1973)和‘Protective Groups in OrganicSynthesis’，3rd edition，T.W.Greene & P.G.M.Wuts，Wiley-Interscience(1999)中有充分的描述。
本发明包括以盐特别是酸加成盐形式的式(I)化合物。适合的盐包括那些与有机或无机酸所形成的盐。这类酸加成盐通常是可以药用的，尽管不可药用酸的盐可用于化合物的制备和纯化方。因而，优选的盐包括那些由氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、甲磺酸和苯磺酸所形成的盐。
式(I)化合物的盐可通过将游离碱或其盐，其对映异构体或外消旋体与一当量或多当量的适当酸反应形成。此反应可在如下溶剂中进行：不能溶解此盐的溶剂或介质或能溶解此盐的溶剂，例如，水、二噁烷、乙醇、四氢呋喃或乙醚或混和溶剂，其可在真空中或通过冷冻干燥法被除去。此反应也可能是置换过程或可在离子交换树脂上进行。
式(II)化合物可通过文献[例如，J.Het.Chem.36，333(1999)]中所描述的标准化学进行制备或通过将式(VII)化合物：
其中A、R2、R3和n如式(I)中所定义，并且L代表离去基，与氨水反应来制备。适合的基团L包括卤素，特别是氯代。
其中L是卤代的式(VII)化合物，可由相应的式(VIII)化合物进行制备：
其中A、R2、R3和n如式(I)中所定义，用卤化剂如亚硫酰氯化物处理。
式(III)、(IV)、(V)、(VI)和(VIII)的化合物是市场上可买得到的或可通过这里所列举的标准化学方法制备得到。
这些的新型中间体化合物构成了本发明的另一方面。
式(I)化合物具有药用活性，特别是作为IKK2酶抑制剂，并可用于人类和非人类动物的病症/疾病治疗(治疗性的或预防性的)，在此病症/疾病中IKK2的抑制是有益的。这种病症/疾病的实例包括炎性疾病或伴有炎性成分的疾病。特定的疾病包括炎症性关节炎包括类风湿性关节炎、骨关节炎、脊椎炎、赖特综合征、银屑病关节炎、狼疮和骨吸收病；多发性硬化症、炎症性肠病包括节段性回肠炎；哮喘、慢性阻塞性肺病、肺气肿、鼻炎、重症肌无力、突眼性甲状腺肿(Graves’disease)、同种异体移植物排斥、牛皮癣、皮炎、变态反应性疾病、免疫复合物病、恶病质、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、中毒性休克、心衰竭、心肌梗塞、动脉粥样硬化、再灌注损伤、艾滋病(AIDS)、癌症和胰岛素抗性为特征的失调如糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、血脂障碍、肥胖症、多囊性卵巢病、高血压、心血管疾病和X综合征。
NF-κB在肿瘤发生和化疗抗性方面已报导的作用暗示，通过利用IKK2抑制剂如小分子IKK2抑制剂对该途径的抑制作用可提供新型的癌症单一治疗和/或为化疗抗性肿瘤的治疗提供重要辅助治疗。
我们对选自哮喘、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病包括节段性回肠炎、多发性硬化症、慢性阻塞性肺病、骨吸收病、骨关节炎、糖尿病/血糖控制和癌症的疾病特别感兴趣。
因而，本发明提供了如上文被定义的式(I)化合物或其可药用盐用于治疗的用途。
在另一方面，本发明提供了在上文被定义的式(I)化合物或其可药用盐在用于治疗的药物的制备中的用途。
还有另一方面，本发明提供了在上文被定义的式(I)化合物或其可药用盐在用于治疗疾病或病症的药物的制备中的用途，在所述的疾病或病症中IKK2酶活性的调节是有益的。
在本说明书的上下文中，除非有特别的说明，术语“治疗”包括“预防”。术语“治疗的”和“治疗地”应作相应的解释。
预防应该特别地与曾经患有或其它被认为有高风险患有可疑疾病或病症地病人的治疗相关。处于发展中的特定疾病或病症危险中的人通常包括那些具有疾病或病症家族史的人，或那些通过遗传测试或筛选已被确认特别易于发展所述疾病或病症的人。
本发明还进一步提供治疗IKK2介导疾病的方法，其包括给患者服用治疗有效量的如上文所定义的式(I)化合物或其可药用盐。
本发明也为患者提供治疗炎性疾病，特别是哮喘、类风湿性关节炎或多发性硬化症的方法，病人患有所述疾病或处于所述疾病的危险中，该方法包括给患者服用治疗有效量的如上文所定义的式(I)化合物或其可药用盐。
为了达到上文所提及的治疗效果，用药的剂量当然要随所用化合物、施药方式、期望的治疗和显示的病症而变化。
式(I)化合物和其可药用盐可以其自身使用，但通常以药物组合物的形式被施用，其中式(I)化合物/盐(有效成分)与可药用佐剂、稀释剂或载体相混合。根据施药方式，药物组合物将优选包括0.05～99％w(重量百分比)，更优选0.05～80％w，还更优选0.10～70％w，并甚至更优选0.10～50％w的有效成分，所有的重量百分数基于整个组合物。
本发明也提供一种药物组合物，含有如上文所定义的式(I)化合物或其可药用盐，以及可药用佐剂、稀释剂或载体。
本发明还提供一种用于制备本发明药物组合物的方法，其包括将如上文所定义的式(I)化合物或其可药用盐与可药用佐剂、稀释剂或载体相混和。
药物组合物以溶液、混悬剂、七氟代链烷烃气溶胶和干粉制剂的形式进行局部给药(例如施于肺和/或气道或皮肤)；或者通过下列方式进行全身给药，如以片剂、胶囊、糖浆、散剂或颗粒的形式口服给药，或以溶液或混悬剂的形式进行肠胃外给药，或皮下给药或以栓剂的形式直肠给药；或者被经皮肤给药。用于选择和制备合适的药用制剂的常规方法记载在，例如，″Pharmaceuticals-The Science of Dosage Form Designs″，M.E.Aulton，Churchill Livingstone，1988中。
本发明通过下面的实施例进行举例说明，但并不被其所限制：
实施例1
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(2-苯并呋喃基)-3-噻吩羧酰胺
a)2-氨基-3-噻吩羧酰胺
标题化合物采用Bull.Soc.Chim.France 2804(1974)中所描述的方法按照如下方式进行合成。
将2，5-二羟基-1，4-二噻烷(25g)和氰基乙酰胺(19.3g)的乙醇(120ml)悬液搅拌并加热到50℃。用15分钟的时间，加入三乙胺(9.2ml)，并将混合物在50℃再搅拌2小时。在冰中冷却后，将固体过滤出来并干燥(21.4g)。
MS(ES)143(M+H)+。
b)2-[(氨基羰基)氨基]-3-噻吩羧酰胺
将2-氨基-3-噻吩羧酰胺(0.44g)悬浮于乙腈(25ml)中，并用10分钟的时间在搅拌的条件下滴加三氯乙酰异氰酸酯(0.2ml)。在室温下再继续搅拌3小时，并然后加入氨水的甲醇溶液(10ml的2M溶液)，并再继续搅拌2小时。将溶剂蒸除并将残基物用水处理。将合成的固体过滤出来并用大量的水洗。用乙醚研磨得到标题脲(0.2g)。
MS(ES)186(M+H)+。
c)2-[(氨基羰基)氨基]-5-溴-3-噻吩羧酰胺
将2-[(氨基羰基)氨基]-3-噻吩羧酰胺(1.0g)溶于乙酸(20ml)中，并用5分钟的时间在快速搅拌的条件下加入溴(0.35ml)的乙酸溶液(5ml)。将混合物搅拌90分钟并然后加入水(50ml)。将产物过滤出来并用水洗，并真空干燥(0.55g)。
MS(ES)262/264(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)7.15(m，1H)，7.35(m，1H)，7.8(s，1H)，7.9(m，1H)，10.63(brs，1H)。
d)2-[(氨基羰基)氨基]-5-(2-苯并呋喃基)-3-噻吩羧酰胺
将2-[(氨基羰基)氨基]-5-溴-3-噻吩羧酰胺(0.26g)、碳酸钠(0.23g)和苯并呋喃-2-硼酸(boronic acid)(0.32g)的二甲氧基乙烷(60ml)和水(2ml)溶液用氩气通气10分钟。然后加入四(三苯膦)钯(0.2g)，并将混合物回流搅拌7小时。冷却后，将混合物过筛并浓缩。将残余物在乙酸乙酯和3N碳酸钠溶液之间分配，并过滤出固体的界面层(0.2g)。
MS(ES)300(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)6.9(s，1H)，7.05(m，2H)，7.2(m，2H)，7.3(m，1H)，7.6(m，3H)，7.8(m，2H)，11.15(brs，1H)。
实施例2
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(3-喹啉基)-3-噻吩羧酰胺
通过实施例1(d)的方法，但使用喹啉-3-硼酸来制备。
MS(ES)311(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)7.0(m，2H)，7.4(m，1H)，7.6(m，2H)，7.65(m，2H)，8.0(m，2H)，8.4(s，1H)，9.15(s，1H)，11.06(brs，1H)。
实施例3
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(8-喹啉基)-3-噻吩羧酰胺
通过实施例1(d)的方法，但使用喹啉-8-硼酸来制备。
MS(ES)311(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)6.9(m，2H)，7.2(m，1H)，7.6(m，2H)，7.7(m，1H)，7.8(d，1H)，8.1(m，2H)，8.4(d，1H)，9.0(m，1H)，11.01(brs，1H)。
实施例4
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(2-苯并噻吩基)-3-噻吩羧酰胺
通过实施例1(d)的方法，但使用苯并噻吩-2-硼酸来制备。
MS(ES)316(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)7.0(m，2H)，7.35(m，3H)，7.4(s，1H)，7.6(s，1H)，7.8(d，1H)，7.85(m，1H)，7.9(d，1H)，11.09(s，1H)。
实施例5
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(3-苯并噻吩基)-3-噻吩羧酰胺
通过实施例1(d)的方法，但使用苯并噻吩-3-硼酸来制备。
MS(ES)316(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)6.95(m，2H)，7.25(m，1H)，7.4(m，2H)，7.65(s，1H)，7.7(s，1H)，7.8(m，1H)，8.0(d，1H)，8.2(d，1H)，11.08(brs，1H)。
实施例6
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(5-吲哚基)-3-噻吩羧酰胺
通过实施例1(d)的方法，但使用吲哚-5-硼酸来制备。
MS(ES)299(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)6.4(s，1H)，6.8(m，2H)，7.2(m，1H)，7.3(m，3H)，7.6(s，1H)，7.65(m，1H)，7.7(s，1H)，10.91(s，1H)，11.0(brs，1H)。
实施例7
2-[(氨基羰基)氨基]-4-甲基-5-(1，4-苯并二氧杂环己-6-基)-3-噻吩羧酰胺
a)2-氨基-4-甲基-5-(1，4-苯并二氧杂环己-6-基)-3-噻吩羧酰胺
将1，4-苯并二氧杂环己-6-基丙酮(1.7g)、氰基乙酰胺(0.84g)、硫磺(0.36g)和吗啉(1ml)的乙醇(5ml)溶液搅拌，并在55℃加热6小时。将反应混合物冷却并在加入水(150ml)之前将其与少量的不溶物分开。将沉淀的固体过滤出来，用水洗然后干燥。然后将产物用乙醚研磨并收集(1.0g)。
MS(EI)266(M)+。
1H NMR(DMSO-D6)7.4(2H，d)，7.3(2H，d)，6.9(2H，s)，6.8(2H，s)，2.2(3H，s)。
b)2-[(氨基羰基)氨基]-4-甲基-5-(1，4-苯并二氧杂环己-6-基)-3-噻吩羧酰胺
将2-氨基-4-甲基-5-(1，4-苯并二氧杂环己-6-基)-3-噻吩羧酰胺(0.44g)溶于四氢呋喃(10ml)中，冷却至0℃，并在搅拌下滴加三氯乙酰异氰酸酯(0.11ml)。在室温下再继续搅拌30分钟，然后加入氨的甲醇溶液(8ml的10％溶液)，并再继续搅拌3小时。将溶剂蒸除，并将残余物用乙酸乙酯处理并将产物过滤出来。
MS(ES)332(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)2.2(s，3H)，4.25(s，4H)，6.7(m，2H)，6.8(m，2H)，6.9(m，1H)，7.2(br，1H)，10.01(brs，1H)。
实施例8
2-[(氨基羰基)氨基]-4-甲基-5-(3-吲哚基)-3-噻吩羧酰胺
通过实施例7的方法，但使用吲哚-3-丙酮来制备。
MS(ES)313(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)2.2(s，3H)，6.65(brs，2H)，7.05(m，1H)，7.1(m，1H)，7.2(m，2H)，7.4(m，1H)，7.45(d，1H)，7.55(d，1H)，10.14(brs，1H)，11.3(m，1H)。
实施例9
2-[(氨基羰基)氨基]-4-甲基-5-(1，3-苯并二氧环戊-5-基)-3-噻吩羧酰胺
通过实施例7的方法，但使用1，3-苯并二氧环戊-5-丙酮来制备。
MS(ES)318(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)2.2(s，3H)，6.05(s，2H)，6.8(m，1H)，6.9(m，1H)，6.95(m，1H)，7.1(m，2H)，7.2(m，2H)。
实施例10
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(1H-吲哚-2-基)噻吩-3-羧酰胺
a)标题化合物是通过将2-[(氨基羰基)氨基]-5-(1H-1-三叔丁基氧羰基吲哚-2-基)噻吩-3-羧酰胺，用90％三氟乙酸/10％水的混合物在环境温度处理4小时制备得到的。蒸发得到固体(250mg)，将其用水洗。
MS(ES)301(M+H)+。
1H NMR(DMSO-D6)6.5(s，1H)，6.95(m，4H)，7.35(m，2H)，7.45(d，1H)，7.6(s，1H)，7.62(brs，1H)，10.9(s，1H)，11.32(brs，1H)。
b)2-[(氨基羰基)氨基]-5-(1H-1-三叔丁基氧羰基吲哚-2-基)噻吩-3-羧酰胺
标题化合物(500mg)是由1H-1-(叔丁氧基羰基)吲哚-2-基硼酸按照与实施例1(d)相似的方法制备得到的，除了所得到的产物为固体，通过过滤反应混合物并依次用2N氢氧化钠溶液、水和甲醇洗获得。
MS(ES)401(M+H)+。
1H NMR(DMSO-D6)1.4(s，9H)，6.7(m，1H)，6.95(brs，2H)，7.2(m，3H)，7.4(m，1H)，7.6(s，1H)，7.65(brs，1H)，8.0(m，1H)，11.04(brs，1H)。
实施例11
3-[(氨基羰基)氨基]-5-(1-苯并噻吩-3-基)噻吩-2-羧酰胺
a) 2-溴噻吩-4-羧酸
根据J.Am.Chem.Soc.，1954，76，2445中所描述的方法来制备。
MS(ES)205(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)7.45(s，1H)，8.22(s，1H)，12.94(brs，1H)。
b)2-溴-4-(N-叔丁基氧羰基)氨基噻吩
将2-溴噻吩-4-羧酸(3g)溶于干燥温热的叔丁醇(24ml)中。加入三乙胺(2.02ml)，随后加入二苯基磷酰基叠氮化物(3.12ml)。将溶液慢慢加热到回流并继续加热回流过夜。然后将反应混合物冷却，倒入水(150ml)中并用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。将合并的提取物干燥(MgSO4)，过滤并蒸发。粗产物通过柱色谱法来纯化，用含5％乙酸乙酯的己烷来洗脱，得到白色固体(1.69g)。
MS(ES)276(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)1.44(s，9H)，7.03(s，1H)，7.51(s，1H)，9.65(s，1H)。
c)5-溴-3-[(叔丁基氧羰基)氨基]噻吩-2-羧酸
在氩气下，将2-溴-4-(N-叔丁基氧羰基)氨基噻吩(1.68g)在干燥的THF(45ml)中搅拌，并将溶液冷却至-78℃。滴加二异丙胺锂(7.55ml，2M溶液)，并继续搅拌3.5小时。加入粉状CO2(过量)，并将混合物再搅拌10分钟，之后温热至室温。加入水(50ml)，真空除去THF，并将水相用乙酸乙酯(3×40ml)萃取。合并提取物，用1M HCl溶液(50ml)、水(50ml)和盐水(50ml)洗，干燥(MgSO4)，过滤并将溶剂蒸除。残余物用二氯甲烷研磨并将产物通过过滤收集得到淡黄色固体(1.57g)。
MS(ES)320(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)9.38(s，1H)，7.79(s，1H)，1.42(s，9H)。
d)5-溴-3-(叔丁基氧羰基)氨基噻吩-2-羧酰胺
将5-溴-3-[(叔丁基氧羰基)氨基]噻吩-2-羧酸(0.80g)在乙腈(80ml)中搅拌。加入羟基苯并三唑(1.41g)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物(2.62g)，并在室温中继续搅拌10分钟。加入浓氨水溶液(8ml)，并将反应混合物加热回流1小时。将乙腈蒸除。加入水(100ml)，并将混合物通过超声波振荡并研磨。将合成的灰白色固体过滤收集，用水洗并真空干燥(0.763g)。
MS(ES)319(M-H)-。
1H NMR(DMSO-D6)1.45(s，9H)，7.63(brs，2H)，7.78(s，1H)，10.40(s，1H)。
e)3-氨基-5-溴噻吩-2-羧酰胺
将5-溴-3-(叔丁基氧羰基)氨基噻吩-2-羧酰胺(0.76g)在二氯甲烷(30ml)中搅拌。加入三氟乙酸(5ml)，将溶液在室温下搅拌1小时，倒入饱和的碳酸氢钠水溶液(200ml)中，并用二氯甲烷(3×100ml)萃取。合并提取物用盐水(150ml)洗，干燥(硫酸镁)，过滤并蒸发得到黄色固体(0.511g)。
MS(ES)221(M+H)+。
1H NMR(DMSO-D6)6.50(brs，2H)，6.69(s，1H)，6.87(brs，2H)。
f)3-[(氨基羰基)氨基-5-溴噻吩-2-羧酰胺
标题化合物按照与实施例1(b)相似的方法，由3-氨基-5-溴噻吩-2-羧酰胺制备得到。
MS(ES)264(M+H)+。
1H NMR(DMSO-D6)6.63(brs，2H)，7.41(brs，2H)，7.97(s，1H)，10.02(s，1H)。
g)3-[(氨基羰基)氨基-5-(1-苯并噻吩-3-基)噻吩-2-羧酰胺
将3-[(氨基羰基)氨基-5-溴噻吩-2-羧酰胺(0.222g)和1-苯并噻吩-3-基硼酸(0.449g)在1，2-二甲氧基乙烷(15ml)和饱和碳酸氢钠水溶液(3.5ml)中进行超声处理并用氩气通气。加入四(三苯膦)-钯(95mg)，并将混合物在搅拌下加热回流4.5小时，然后冷却并在室温下搅拌过夜。将溶液过滤并用1，2-二甲氧基乙烷和水洗。将滤液在真空中浓缩，并用二氯甲烷(20ml)和饱和碳酸氢钠水溶液(20ml)中溶解。将固体产物过滤收集，用二氯甲烷、水、二乙醚洗并干燥(226mg)。
MS(ES)318(M+H)+。
1H NMR(DMSO-D6)6.60(brs，2H)，7.35-7.56(m，4H)，8.04(s，1H)，8.10(t，2H)，8.25(s，1H)，10.08(s，1H)。
实施例12
2-[(氨基羰基)氨基]-5-(2-吗啉-4-基甲基苯并[b]噻吩-5-基)噻吩-3-羧酰胺
将4-(5-溴苯并[b]噻吩-2-基甲基)吗啉(Beilstein Reg.No.1115497)(230mg)的干燥THF溶液，用三异丙基硼酸酯(291mg)来处理，并在氩气下搅拌冷却至＜-70℃。滴加正丁基锂(0.921ml，1.6M的己烷溶液)，随后加温到室温。将溶剂蒸除，并用二甲氧基乙烷(20ml)和饱和的碳酸氢钠水溶液(9ml)的混合物所代替。在氩气下，向此混合物中加入2-[(氨基羰基)氨基]-5-溴噻吩-3-羧酰胺(98mg)和四-三苯膦钯(O)(25mg)，并将此反应在90℃加热1.5小时。将此反应混合物蒸发除去大量的有机物，并将残余物在2M的氢氧化钠水溶液(30ml)和二氯甲烷之间分布。过滤后，将有机相分离，并用更多体积的氢氧化钠溶液(10ml)萃取。将合并的含水提取物酸化至pH为8并过滤。在固体干燥后用乙醚研磨得到粉状物(27mg)。
LCMS 417(M+H)+。
1H NMR(DMSO-D6)2.47(m，4H)，3.65(m，4H)，3.80(s，2H)，6.95(brs，2H)，7.3(brs，1H)，7.33(s，1H)，7.5(m，1H)，7.69(brs，1H)，7.75(s，1H)，7.91(m，2H)，11.0(s，1H)。
实施例13
2-[(氨基羰基)氨基]-5-[4-(2-吗啉-4-基乙氧基)-1-苯并噻吩-2-基]-3-噻吩羧酰胺
a)标题化合物由4-[2-(1-苯并噻吩-4-基氧)乙基]吗啉按照与实施例12相似的方法进行制备，除了将反应混合物在90℃加热4小时之外。在真空中将溶剂除去，将残余物用3M碳酸钠/二氯甲烷处理，并将固体从界面层过滤出来。由制备型hplc纯化得到产物。
MS(ES)447(M+H)+。
1H NMR(DMSO-D6)2.5(m，4H)，2.8(t，2H)，3.55(m，4H)，4.25(t，2H)，7.0(m，3H)，7.15(m，2H)，7.35(m，3H)，7.8(m，1H)，11.05(brs，1H)。
b)4-[2-[(1-苯并噻吩-4-基氧)乙基]吗啉
将4-(2-氯乙基)吗啉氢氯化物(0.74g)、1-苯并噻吩-4-醇(0.5g)和碳酸钾(1.1g)在二甲基甲酰胺(15ml)中加热，并在80℃搅拌6小时。冷却后，将混合物倒入水中，并用乙酸乙酯萃取两次。合并的溶剂相用盐水洗两次，干燥(硫酸镁)并蒸发得到产物(0.7g)。
MS(ES)264(M+H)+。
1H NMR(DMSO-D6)2.5(m，4H)，2.8(t，2H)，3.55(m，4H)，4.25(t，2H)，6.9(d，1H)，7.25(t，1H)，7.4(d，1H)，7.55(d，1H)，7.6(d，1H)。
c)1-苯并噻吩-4-醇
此化合物按照J.Amer.Chem.Soc.，1955，77，5939中所描述的方法制备。
实施例14
2-[(氨基羰基)氨基]-5-{2-[4-甲基苯基磺酰]-1，2，3，4-四氢异喹啉-6-基}噻吩-3-羧酰胺
a)标题化合物由6-溴-2-[4-甲基苯基磺酰]-1，2，3，4-四氢异喹啉按照与实施例13相似的方法进行制备，除了加将反应混合物在80℃加热18小时之外。将溶剂真空除去后，将残余物用2M氢氧化钠和二氯甲烷处理，并分离出水相，用36％的盐酸调到pH为8。粗产物通过制备型hplc来纯化。
MS(ES)471(M+H)+。
1H NMR(DMSO-D6)2.4(s，3H)，2.8(m，2H)，3.2(m，2H)，4.1(s，2H)，6.9(br，2H)，7.15(m，1H)，7.3(m，1H)，7.4(m，2H)，7.5(m，1H)，7.7-7.9(m，5H)，11.0(s，1H)。
b)6-溴-2-[4-甲基苯基磺酰]-1，2，3，4-四氢异喹啉
在氩气5℃下，将2-[3-溴苯基]-N-(4-甲基苯基磺酰)乙胺(7.44g)在氯仿(100ml)中搅拌，其间依次加入37-40％甲醛(3.5ml)和三氯氧磷(30ml)。然后将此混合物回流3小时，冷却，倒入二氯甲烷(250ml)/饱和碳酸氢钠(300ml)中，并在5℃下小心地按份加入固体碳酸氢钠(160g)。再将水相用二氯甲烷萃取，并将合并的有机相用饱和碳酸氢钠和水洗，干燥(MgSO4)并蒸发得到油状物，将其在异己烷/甲苯中结晶得到产物(3.48g)。
MS(ES)365(M)+。
1H NMR(CDCl3)2.43(s，3H)，2.89(t，2H)，3.34(t，2H)，4.1 8(s，2H)，6.89(d，1H)，7.23-7.30(m，2H obscured)，7.33(d，2H)，7.72(d，2H)。
c)2-[3-溴苯基]-N-(4-甲基苯基磺酰)乙胺
将3-溴苯基乙胺氢氯化物(9.44g)加入到含有三乙胺(12.24ml)的THF(60ml)中，并在氩气5℃搅拌，其间用15分钟的时间分批加入4-甲基苯基磺酰氯(11.44g)。将此浆状物用THF(50ml)稀释并搅拌16小时。将固体过滤出来，用THF洗并将滤液蒸发。将残余物溶于乙酸乙酯中，用1N盐酸、水、盐水洗并干燥(MgSO4)。在硅胶上进行快速色谱，用含0～25％乙酸乙酯的异己烷来洗脱得到产物(9.67g)。
MS(ES)352(M-H)-。
1H NMR(CDCl3)2.44(s，3H)，2.74(t，2H)，3.23(q，2H)，4.36(t，1H)，7.03(d，1H)，7.14(t，1H)，7.17(m，1H)，7.30(d，2H)，7.35(dd，1H)，7.69(dd，2H)。
d)3-溴苯基乙胺氢氯化物
标题化合物的游离碱有CAS登记号58971-11-2和Beilstein登记号2716071。
实施例15
3-[(氨基羰基)氨基]-5-(1-苯并噻吩-2-基)噻吩-2-羧酰胺
标题化合物由3-[(氨基羰基)氨基-5-溴噻吩-2-羧酰胺和1-苯并噻吩-2-基硼酸按照与实施例11(g)相似的方法进行制备。
MS(ES)318(M+H)+。
1H NMR(DMSO-D6)6.64(brs，2H)，7.33-7.47(m，2H)，7.49(brs，2H)，7.71(s，1H)，7.80-7.90(m，1H)，7.90-8.02(m，1H)，8.23(s，1H)，10.05(s，1H)。
化合物的药理评价
IKK2滤器激酶试验
通过滤器激酶试验检测化合物的IKK2的抑制活性。将待检测的化合物溶于二甲亚砜(DMSO)中，浓度为10mM。然后将化合物在激酶缓冲液(50mM三羟甲氨基甲烷，pH为7.4，含有0.1mM EGTA，0.1mM原钒酸钠和0.1％β-巯基乙醇)中进行1/40稀释。用2.5％DMSO的激酶缓冲液对此溶液按1∶3连续稀释。将20μl的化合物稀释物加入到96孔板的孔中，一式两份。将20μl含有2.5％DMSO的激酶缓冲液代替化合物加入到对照孔中(0％抑制)。将20μl的0.5 M EDTA代替化合物加入到背景孔中(100％抑制)。
将10μl的醋酸镁、未标记的ATP和33P-标记ATP的混合物加入到每个孔中，使得最终浓度为10mM的醋酸镁、1μM ATP和0.1μCi33P ATP。将20μl IKK2(0.15μg/well)、1-53 GST-IκB(0.5μg/well)和牛血清白蛋白(BSA)(8.5ug/well)的混合物加入到每个孔中使反应开始。最终反应体积为50μl。
将此激酶反应在21℃孵育80分钟，并通过加入等体积(50μl)20％的三氯乙酸(TCA)使蛋白沉淀来中止反应。使沉淀物形成10分钟，然后将其放到GF/C uniflter 96孔板上过滤。每个滤器用约1ml的2％TCA洗两次。将滤器板在30-40℃干燥60分钟，在每个孔中加入20μl的闪烁体并将板密封并在Packard Topcount微板闪烁计数器对其放射强度进行测定。
当在上述的试验中被检测时，实施例1～15的化合物给出少于10μM的IC50值，表明它们预期能显示出有效的治疗活性。
IKK1滤器激酶试验
化合物的选择性可通过用滤器激酶试验测定它们对IKK1的抑制来评估。此试验条件同IKK2滤器激酶试验是相同的，除了将IKK1(0.25μg/well)和1-53 GST IκB(9μg/well)的混合物加入到每个孔中开始反应之外。
对PBMC中LPS-诱导的TNFα产生的抑制
通过测定肿瘤坏死因子α(TNFα)的产生抑制来评价测试化合物对核因子κB(NFκB)的激活作用，肿瘤坏死因子α是通过细菌的脂多糖(LPS)刺激外周血单核细胞(PBMCs)所产生。
从健康的志愿者中收集人血(250ml)，用肝素抗凝。在50ml聚丙烯离心管中将等分的血(25ml)放在20ml Lymphoprep(Nycomed)上。将此管在2,500rpm离心(Sorval RT600B)30分钟。将含有PBMCs的浑浊层用好尖端的巴斯德吸管收集，转移到8个干净的聚丙烯离心管(每支管约10ml)中，并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释到50ml。将这些管在2,000rpm离心8分钟。向每个细胞团中加入PBS(10ml)，并轻轻地使细胞再次悬浮。将细胞混合于4支离心管中，将PBS加入到每支管中使得体积为50ml，并将离心管在1,400rpm离心8分钟。细胞团又再一次悬浮于10ml的PBS中，将其混合于2支离心管中，用PBS使体积达到50ml，并将管在900rpm离心10分钟。
最终的细胞团轻轻地再悬浮于10ml的组织培养液(RPMI，含有1％热灭活的人血清、L-谷氨酰胺和青霉素和链霉素)中，将其混合装入1支管中并用RPMI培养基使体积达到30ml。细胞计数并将细胞悬液稀释为2.6×106细胞/ml。
将化合物溶于DMSO至10mM，并用RPMI培养基以1∶250(40μM)稀释。然后将此化合物用含0.4％DMSO的RPMI培养基以1∶3进行连续稀释。将测试化合物的稀释液等分(50μl)的转移到96-孔板的孔中。对照孔中含有代替此化合物地0.4％DMSO的RPMI。
将细胞悬液等分(100μl)加入到每个孔中，并将板在37℃培养30分钟。向孔中加入50μl的40μg/ml LPS(Sigma，L-4130)以刺激由细胞产生TNFα，并使板在37℃培养过夜。将RPMI培养基(50μl)加入到阴性对照孔中代替LPS。最终培养体积为200μl。
将板在1,200rpm离心4分钟，并将上层清液移出以测定TNFα的浓度。残余细胞团的生存力可用WST-1试剂(Boehringer Mannheim，1044807)来测定。将含有10μl WST-1试剂的100μl RPMI培养基加入到每个孔中，并将板培养0.5～3小时。用96-孔板分光光度计来测定450nm处的吸光度。
通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定上层清液中的TNFα(新获得的或在-20℃冻存)。此ELISA板按下列方式制备：将96孔板的孔涂上羊抗-人TNFα单克隆抗体(稀释于涂层缓冲液中的100μl的1μg/ml抗体；0.5M的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6，含有0.2g/l的叠氮钠)，并在4℃孵育过夜。空白孔不被涂敷。将孔用0.1％BSA的含有0.05％Tween的PBS(PBS/Tween)洗一次，然后在室温下用1％BSA的涂层缓冲液(200μl)孵育1小时。然后将孔用0.1％BSA的PBS/Tween液洗三次。
将来自PBMC培养的上清液的样品，用1％BSA的PBS/Tween液按1∶3稀释。将此稀释液的100μl的等分量加入到ELISA板中。其它孔中含有100μl的TNFα标准样(10、3.3、1.1、0.37、0.12、0.04、0.014和0ng/ml)。将此ELISA板在室温下孵育2小时，之后将板用0.1％BSA的PBS/Tween液洗3次。将兔抗-人TNFα抗体(100μl的2.5μg/ml溶液)加入到每个孔中，并将板在室温下孵育1.5小时。然后将孔用0.1％BSA的PBS/Tween液洗3次。将羊抗-兔IgG-辣根过氧化物酶结合物(ICN，674371；100μl的1∶10,000的稀释物)加入到每个孔中，并将板在室温下孵育1.5小时。将孔用0.1％BSA的PBS/Tween液洗3次。
过氧化物酶底物通过将1mg TMB片剂(Sigma，T-5525)溶于100μl的DMSO(100μl)中制备得到，并将其与36μl的UHPO(BDH，30559；1g片剂溶于25ml的蒸馏水)加入到10ml的0.1M柠檬酸盐/醋酸盐的缓冲液中，pH为6。将100μl的底物加入到每个孔中，并在室温下将板避光孵育约30分钟。此反应通过向每个孔中加入25μl的2M硫酸来中止。用96孔板分光光度计测定450nm处的吸光度。