含生长因子的细胞培养液添加剂 所属技术领域
本发明涉及一种细胞培养液添加剂，尤其涉及一种从牛初乳中制备含有高生长因子、低蛋白、低内毒素和低免疫球蛋白的细胞培养液添加剂的方法。
发明技术背景
在体外培养哺乳动物细胞，基础培养液是传统的添加剂加哺乳类动物血清，血清中含有部份至今仍不清楚作用机理的促进细胞生长的因子，例如生长因子、维生素、微量元素、激素、粘附蛋白和接触因子等，在细胞培养时最常用和最适合的添加剂是是胎牛血清，随着生物科学研究的广泛开展，胎牛血清需要量持续增加，其价格也不断攀升，而过高的价格因素又减少了纯胎牛血清的制备和供应。除了价格因素以外，采用胎牛血清还存在的问题是血清中含有复杂成份和较高的蛋白含量，它会妨碍从细胞培养产物中分离制备细胞培养中产生的物质，同时也存在着被微生物污染的风险。
动物细胞培养技术的一个重要组成部分就是生产单克隆抗体供临床及基础研究，在大规模生产单克隆抗体过程中，选择合适的细胞培养液是一个关键的步骤，不但要求其容易纯化，而且也要尽量降低成本，并避免微生物和内毒素的污染，应用胎牛血清很难满足上述要求。
现代研究证实，牛初乳及其所含的多肽在体外能促进哺乳类动物细胞生长，其富含的多种成份是细胞生长所必需的，但是其中高含量的免疫球蛋白，尤其是丰富的免疫球蛋白G(IgG)(每升初乳内含40～60克)，不利于细胞培养，尤其不利于产生单克隆抗体的杂交瘤细胞培养，此外在牛初乳储存过程中，其中格兰氏阴性杆菌产生的内毒素也可能会产生污染。
美国专利(4440860)公开地技术中介绍了用凝胶层析和电渗透方式分离牛初乳中多肽并应用于细胞培养液中，这个方法不适合于大规模生产和制备，不能实际应用。
本发明所要解决的技术问题是，在保持牛初乳中多种生长因子活性同时去除其中免疫球蛋白和可能残余的内毒素或者其他微生物，并用作细胞培养液添加剂。
【发明内容】
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案，其特征是，采用离心方式去除牛初乳中脂肪和细胞碎片，通过调节牛初乳至酪蛋白等电点并加热来促进酪蛋白凝结，采用离心或过滤方式去除酪蛋白，应用微滤膜滤除微生物、内毒素及凝集蛋白质，用分子量为80,000～120,000D的超滤膜滤除免疫球蛋白，最后用微滤膜过滤杀菌，冷藏备用，其中含有丰富的生长因子和低蛋白、低内毒素、低免疫球蛋白，适合用作细胞培养液添加剂。
本发明的技术特征是，采用的原料是牛初乳，最好是牛分娩后72小时内初乳，初乳采用离心方式去除脂肪和破碎的细胞碎片，离心速度5,000～10,000转/分，离心时间30～60分钟，离心温度4℃～10℃，离心后去除漂浮在表层的脂肪及沉淀在底部的细胞碎片。
本发明的技术特征是，去除初乳中的酪蛋白不是必需的过程，保留初乳中的酪蛋白，直接用超微滤膜分离的工艺方法会减少工作流程，降低成本，而且去除酪蛋白后获得的产品质量更高，蛋白含量显著降低，适合制备高质量产品。去除酪蛋白的程序是，用酸剂调节初乳PH至4.6～4.8，并同时加热至40℃～50℃，保持20～50分钟，酪蛋白凝聚后，用离心方式或滤布分离过滤方式去除已凝集的酪蛋白。
本发明的技术特征是，在处理初乳过程中，采用微滤膜过滤微生物及内毒素，可能会减少细菌、病毒及内毒素的含量，采用的过滤设备可以是普通的微滤设备，采用交错切面流体超滤设备效果更佳，微滤膜孔径可以采用0.22～0.8mu.m微滤膜。
本发明的技术特征是，去除初乳中的免疫球蛋白及其他大分子蛋白，采用超滤的方式是最好选择，超滤设备最好选用交错切面流体超滤装置，采用的超滤分子量为80,000～120,000D，最好是选用分子量为100,000D的超滤膜。
本发明的技术特征是，在滤除免疫球蛋白后，最好采用微滤膜再次过滤微生物和内毒素，微滤膜孔径最好选用0.22mu.m。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的含高含量生长因子和低含量蛋白、免疫球蛋白和内毒素的牛初乳分离物可以广泛用作细胞培养液添加剂，以部分或全部替代胎牛血清，在上述牛初乳分离物中加入一个或多个添加剂可能会增加其作用，这些添加剂包括但不限于胰岛素、亚硒酸盐、乳清白蛋白等。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的细胞培养液添加剂，其浓度最佳范围在5％～15％，更高的浓度反而可能会阻止细胞的生长，不同类型的细胞生长所需的浓度不一样，当LPCI杂交瘤细胞时，加入10％的牛初乳分离的添加剂，并同时添加亚硒酸钠，最佳浓度为0.4～2mu.m.。
本发明的有益效果是，与胎牛血清相比，本发明制备的细胞培养液添加剂细胞密度更低，在分离、纯化单克隆抗体时工艺更简单，纯化度更高，促进细胞生长能力更强，价格更加经济合理，更适合制备用于人体的各种治疗性蛋白质。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
以牛初乳为原料制备细胞培养液添加剂
收集20升牛初乳，采用离心方式脱脂，离心速度5000转/分，离心时间20分钟，去除顶层的脂肪和底层的细胞碎片，用2N HCL调PH至4.6，同时加温至45℃维持30分钟，酪蛋白沉淀后，以离心方式沉淀去除酪蛋白，离心速度为6000转/分，离心时间45分钟，收集的上清液静置过夜，温度保持4℃，用2N NaOH调PH至7.0，室温下再次离心去除沉淀的酪旦白，澄清的上清液通过0.8mu.m和0.22mu.m的微滤膜(Millipore Corporation，Bedford.Mass.USA)过滤，过滤液抽入交错切面流体超滤装置(Pall Inc.USA)，应用分子量为100,000D的超滤膜分离免疫球等大分子蛋白，超滤液被进一步通过0.22mu.m的微滤膜灭菌过滤，贮存在-20℃低温环境下。
实施例2
制备保留酪蛋白的细胞培养液添加剂
按实施例1的方式去除脂肪和细胞碎片，脱脂初乳直接送入系统微滤装置，分别通过0.8mu.m和0.22mu.m的微滤膜，过滤液被直接泵入交错切面流体过滤超滤装置，应用分子量为100,000D的超滤膜分离免疫球蛋白，超滤液被通过0.22mu.m的微滤膜抽滤消毒后，在-20℃下贮存。
实施例3
免疫球蛋白含量测定
取实施例1的细胞培养添加剂，采用比色的方法，以牛免疫球蛋白作为标准对照组，测量其中蛋白质总量和免疫球蛋白G含量，并以牛初乳作为对照组进行对比，正常牛初乳中免疫球蛋白总量为67.1±7.5，免疫球蛋白G为22.5±1.0，实施例1方法制备的细胞培养液添加剂中蛋白总量为3.48±0.88，免疫球蛋白G为0.830±0.341，结果显示，蛋白总量及免疫球蛋白量明显减少。
实施例4
细胞培养液添加剂用于细胞培养
产生单克隆抗体的LFC1和LFC6杂交瘤细胞在分别含有10％胎牛血清和含有实施例1制备的牛初乳分离物的培养液内生长，在持续培养12天后，用胎牛血清的培养细胞产生单克隆抗体浓度为40％，用实施例1牛初乳分离物培养细胞产生的单克隆抗体浓度为42％，结果证实两者效果相似。