一种淡紫拟青霉生物肥药的制备方法.pdf

本发明提供一种淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，属于农业生物技术领域，解决现有技术的中存在的问题，制备方法包括：以淡紫拟青霉为菌株，接种三角瓶液体菌种，以查氏培养基发酵制备生产用液体菌种；以养殖场腐熟或半腐熟的发酵床垫料为基础培养基，配以辅助碳源和水，接种液体菌种，在固体发酵池内厚层通风发酵制备淡紫拟青霉固体发酵培养物；将淡紫拟青霉固体发酵培养物干燥、粉碎，即得。本发明以高效线虫生防菌淡紫拟青霉为菌株，利用养殖场腐熟或半腐熟的发酵床垫料为主要原料，发酵生产淡紫拟青霉生物肥药，作为土壤微生物肥药，可

1.  一种淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，其特征在于：所述制备方法的步骤包括：
(1)生产用液体菌种制备：以淡紫拟青霉为菌种制作二级液体菌种，并以查氏液体培养基或PDA液体培养基为生产用液体菌种用培养基，在发酵罐接种二级液体菌种，培养生产用液体菌种；
(2)配置固体发酵培养基，接种步骤(1)所得的生产用液体菌种，转入固体发酵池，厚层通风发酵制备淡紫拟青霉固体发酵培养物；
(3)将步骤(2)的淡紫拟青霉固体发酵培养物，50～80℃烘干，粉碎，即得淡紫拟青霉肥药。

2.  根据权利要求1所述的淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)的固体发酵培养物制备具体如下：
基础培养基60～80重量份，辅助碳源20～40重量份，搅拌均匀后加水，调整含水率为30～50wt％，接种步骤(1)的生产用液体菌种10～15重量份，转入固体发酵池中，通风，在25～30℃下发酵，24～30小时翻动一次，发酵7～9天，即得到淡紫拟青霉的固体发酵培养物。

3.  根据权利要求2所述的淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，其特征在于：所述的基础培养基为腐熟或半腐熟的养殖场发酵床有机垫料。

4.  根据权利要求2所述的淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，其特征在于：所述的辅助碳源为米糠、麸皮、玉米淀粉或秸粉的一种或几种。

5.  根据权利要求1所述的淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中二级液体菌种具体步骤为：
A.固体斜面菌种培养：配置查氏固体培养基或PDA固体培养基，灭菌，划线接种淡紫拟青霉，置于恒温培养箱内25～30℃下培养7～9天；
所述固体斜面菌种培养中用的杳氏固体培养基配方：NaNO₃ 3g、K₂HPO₄ 1g、  KCl0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeSO₄ 0.01g、蔗糖30g、琼脂15～20g、水1000mL，pH自然；
所述固体斜面菌种培养中用的PDA固体培养基为：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL煮沸半小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10～20g葡萄糖和17～20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤；
B.二级液体菌种培养：二级液体菌种培养基配方与所述固体斜面菌种培养基配方中除不加琼脂外其余成分或制备方法相同，将二级液体菌种培养基按250mL/瓶的量分装于1L的三角瓶中，灭菌冷却后，在无菌操作台上，用接种环从固体斜面培养基保存的淡紫拟青霉中勾取分生孢子一环，接种至三角瓶内液体培养基中，摇床110～150rpm、25～30℃培养4～5天。

6.  根据权利要求1所述的淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中生产用液体菌种制备步骤中：
将所述培养生产用液体菌种中用的查氏液体培养基或PDA液体培养基于气升式发酵罐中装罐、灭菌后，按培养基1wt％的量接种二级液体菌种，控制通气量1∶1、温度25～30℃，发酵培养7～8天，得到淡紫拟青霉的生产用液体菌种。

7.  根据权利要求1或6所述的淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的生产用液体菌种用培养基：
杳氏液体培养基配方为：NaNO₃ 3g、K₂HPO₄ 1g、KCl 0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、FeSO₄ 0.01g、蔗糖30g、水1000mL，pH自然；
PDA液体培养基为：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL煮沸半小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10～20g葡萄糖，充分溶解后趁热纱布过滤。

一种淡紫拟青霉生物肥药的制备方法
技术领域
本发明涉及肥药两用的土壤微生物肥药，更具体涉及一种淡紫拟青霉生物肥药的制备方法。
背景技术
在传统农业生产中，为了增产增收，农户往往大量使用化肥和生产激素等产品促进作物生长，同时使用农药控制病虫害，但由于这些化肥、农药和生产激素等几乎都是同一时期使用，其中的二甲苯等辅助添加剂等多次残留，使许多地方的土壤结构、土地肥力和植物生态失衡、发生退化和异变，造成农作物特别是蔬菜、果树等出现顽固性病害，而治理这些病害所用的化学农药又增加了土地和农产品的污染。在这种情况下，一些厂家开始研发同时具有药效和肥效的制剂，以减少化肥和农药的施用量，达到的节约成本、减少工时、降低土地污染的目的。这些制剂又可分为以药的方式使用并兼具肥效的肥药以及以肥的形式使用并兼具药效的药肥，通常是简单地将农药和肥料按一定的比例配方相混合，并通过一定的工艺而生产的农药与肥料的复合剂，两者各自单独发挥其效用，但之间并无相互作用。
植物线虫病是腔肠动物线虫引起的一类根部病害，严重影响作物产量。目前，植物线虫病发生日益严重，几乎所有的作物都有线虫危害。寄生线虫成为植物侵染性病害的重要病原物之一，对全世界农业生产有很大影响。据估计，全世界每年因线虫危害给粮食和纤维作物造成的损失大约为12.3％，造成约1000亿美元的损失。我国农作物种植业每年因线虫造成的危害损失近233亿元。线虫的防治中应用最广泛是采用杀线虫剂进行化学防治，但杀线虫剂通常毒性较高，会增加环境的污染，越来越多的学者认识到控制寄生性线虫必须采取综合措施或采用以生物生态防治为核心的可持续治理系统。真菌是线虫生物防治中研究较多的天敌生物，也是最为重要的生防因子之一。其中最为著名、也是最重要的一个机会真菌淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus(Thom)Samson)广泛分布于世界各地，容易从土壤中，真菌菌核，线虫和昆虫上分离得到，且易培养。
国内外学者对该菌进行了大量的研究，多年的实践证明：淡紫拟青霉效果显著，且具有持效性；对多种线虫有防治效能，是防治寄生线虫最有前途的生防制剂。同时，该菌对目前使用的杀肥药具有相当的耐药性，可和杀肥药混用，提高防效。菲律宾已将此菌商品化，商品名为Biocon。
研究表明，在淡紫拟青霉的生长过程中，特别是在深层发酵培养过程中，该菌能产生丰富的衍生物，其一是类似吲哚乙酸产物，它最显著的生理功效是在低浓度时促进植物根系与植株的生长，此外还能产生类似生长素和细胞分裂素的作用。因此在根系施用淡紫拟青霉不仅能明显抑制线虫侵染，而且能促进植株营养器官的生长，同时对种子的萌发与生长也有促进作用。
淡紫拟青霉对多种植物病原菌具有拮抗活性，有研究表明：淡紫拟青霉菌株36-1对8种植物病原菌有显著拮抗活性，它们是玉米小斑病、小麦赤霉病、棉花枯萎病、水稻恶菌病、水稻纹枯病、柑桔青霉病菌、柑桔绿霉菌、黄瓜炭疽病菌，Abdul(2000)利用淡紫拟青霉控制棉花细菌性枯萎病与棉花病毒病，结果表明拟青霉菌能明显降低棉花(NIAB-18、CIM-240品种)的病毒性病害，并有效抑制细菌性枯萎病，还从温室中筛选出高拮抗力菌株，喷洒在小麦叶片上，用以控制小麦叶斑病。相关研究还证实：淡紫拟青霉能显著降低向日葵和纳豆根癌病的发病率，并且能抑制由镰孢菌属引起的蕃茄根腐病。
研究发现，淡紫拟青霉能促进难溶磷酸盐的溶解，经实验室试验：淡紫拟青霉菌对辛硫磷的校正降解率在94左右。同类研究还表明，拟青霉还能促进许多化学聚合物(如有机磷农药，制革废水等)的分解。
综上所述，淡紫拟青霉不仅可以开发成为优秀的杀线虫生物农药，并且能同时防治多种植物病害，还可作为高效的生物肥料使用，降低化学农药和化学肥料的残留，促进无公害农产品的生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，解决现有技术中如只将药物和肥料简单混合，药用和肥用效果均不佳，污染环境等等的一系列问题，制备过程简单易行，培养的淡紫拟青霉生物肥药中菌活性好，固体发酵培养时直接以肥料作为培养基，并以微生物作为药用成分，使本发明的肥药具有药用和肥用的有机结合，肥效药效均非常显著，而且对环境无污染，具有显著的经济效益和环境保护效益。
本发明的技术内容：淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，步骤包括：
(1)生产用液体菌种制备：以淡紫拟青霉为菌种制作二级液体菌种，并以查氏液体培养基或PDA液体培养基为生产用液体菌种用培养基，在发酵罐接种二级液体菌种，培养生产用液体菌种；
(2)配置固体发酵培养基，接种步骤(1)所得的生产用液体菌种，转入固体发酵池，厚层通风发酵制备淡紫拟青霉固体发酵培养物；
(3)将步骤(2)的淡紫拟青霉固体发酵培养物，50～80℃烘干，粉碎，即得淡紫拟青霉肥药。
本发明的优良效果在于：选用高效线虫生防菌淡紫拟青霉为生产菌株，不仅对植物寄生性线虫具有高毒力，而且对多种植物病原菌具有拮抗活性，同时还能产生类生长激素物质，促进植物生长，进一步提高产品的肥效作用；作为淡紫拟青霉固体发酵的基础培养基，养殖场腐熟发酵床垫料本身即是优良的有机肥来源，为作物提供肥力的同时也能为菌株在土壤中更好的定殖提供条件。盆栽和田间试验结果表明，对作物根结线虫病害防治效果显著，同时有良好的抗病促长效果；制备过程简单易行，培养的淡紫拟青霉生物肥药中生防菌产孢率高、活性好；固体发酵培养直接以有机肥作为基础培养基，以高效线虫生防菌淡紫拟青霉作为药用成分，使本发明的肥药具有药效和肥效的有机结合，以肥养药，以药增肥，两者相互促进，肥效药效均非常显著，可减少化学农药和化肥的使用量，对环境无污染，具有显著的经济效益和环境保护效益。
具体实施方式
本发明以福建隆科君农业科技有限公司销售的淡紫拟青霉为生产菌株，制备淡紫拟青霉生物肥药，各步骤具体说明如下：
菌种制备：
二级液体菌种培养：该步骤可以按淡紫拟青霉二级液体菌种常规技术培养，也可以按照以下具体步骤培养：
A.固体斜面菌种培养：配置查氏固体培养基或PDA固体培养基，灭菌，划线接种淡紫拟青霉，置于恒温培养箱内25～30℃下培养7～9天；
所述固体斜面菌种培养中用的查氏培养基：NaNO₃ 3g、K₂HPO₄ 1g、KCl 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeSO₄ 0.01g、蔗糖30g、琼脂15～20g、H₂O 1000mL，pH自然；
所述固体斜面菌种培养中用的PDA固体培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL煮沸半小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10～20g葡萄糖和17～20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤。
B.二级液体菌种培养：二级液体菌种培养基配方与所述固体斜面菌种培养基配方中除不加琼脂外其余成分或制备方法相同，将二级液体菌种培养基按250mL/瓶的量分装于1L的分装于三角瓶中，灭菌冷却后，在无菌操作台上，用接种环从固体斜面培养基保存的淡紫拟青霉中勾取分生孢子一环，接种至三角瓶内液体培养基中，摇床110～150rpm、25～30℃培养4～5天。
将所述培养生产用液体菌种中用的查氏液体培养基或PDA液体培养基于气升式发酵罐中装罐、灭菌后，按培养基1wt％的量接种二级液体菌种，控制通气量1∶1、温度25～30℃，发酵培养7～8天，得到淡紫拟青霉的生产用液体菌种。
生产用液体菌种用培养基：
查氏液体培养基配方为：NaNO₃ 3g、K₂HPO₄ 1g、KCl 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeSO₄0.01g、蔗糖30g、H₂O 1000mL，pH自然；
PDA液体培养基为：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL煮沸半小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10～20g葡萄糖，充分溶解后趁热纱布过滤。
(2)厚层通风发酵制备淡紫拟青霉固体发酵培养物
基础培养基60～80重量份，辅助碳源20～40重量份，搅拌均匀后加水，调整含水率为30～50wt％，接种步骤(1)的生产用液体菌种10～15重量份，转入固体发酵池中，通风，在25～30℃下发酵，24～30小时翻动一次，发酵7～9天，即得到淡紫拟青霉的固体发酵培养物。
基础培养基为腐熟或半腐熟的养殖场发酵床有机垫料；辅助碳源为米糠、麸皮、玉米淀粉或秸粉的一种或几种。
该淡紫拟青霉的固体发酵培养物，孢子数可达到5亿/g干品。
(3)将步骤(2)得到的淡紫拟青霉固体发酵培养物经50～80℃干燥后，粉碎、质检、包装成品。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，或按制造厂商所建议的条件。在未作特别注明的前提下，所涉及到的所有份数均为质量份数，所有百分比均为质量百分比。
实施例1
(1)淡紫拟青霉的二级液体菌种的制备，具体操作步骤如下：
A.斜面菌种(固体)
称取20份马铃薯，洗净去皮切成小块，加水100份煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加2份葡萄糖和2份琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，15磅蒸气(121℃)灭菌20分钟后取出试管摆斜面，冷却后划线接种淡紫拟青霉NH-PL-03菌株，置于恒温箱内28℃培养8天。
B.二级菌种(液体)
培养基配方同斜面但不加琼脂，分装于三角瓶中，灭菌冷却后，在无菌操作台上，用接种环从固体斜面培养基保存的淡紫拟青霉中勾取分生孢子一环，接种至液体培养基中，摇床110rpm、28℃培养4天。
生产用液体菌种的制备
培养基：查氏液体培养基，NaNO₃ 3份、K₂HPO₄ 1份、KCl 0.5份、MgSO₄·7H₂O 0.5份、FeSO₄ 0.01份、蔗糖30份、H₂O 1000份，pH自然。
气升式发酵罐装罐、灭菌后，接种二级液体菌种50份，控制通气量1∶1、温度28℃，发酵培养8天，得到淡紫拟青霉的生产用液体菌种。
(2)厚层通风发酵制备淡紫拟青霉固体发酵培养物
半腐熟的养殖场发酵床垫料80份，麸皮20份，搅拌均匀后加水，调整含水率为40％，接种步骤(1)的生产用液体菌种10份(以上均为重量份)，转入固体发酵池中，通风，在28℃下发酵，24小时翻动一次，发酵8天，即得到淡紫拟青霉的固体发酵培养物。
该淡紫拟青霉的固体发酵培养物，孢子数可达到5亿/g干品。
(3)将步骤(2)的淡紫拟青霉固体发酵培养物，50～80℃烘干，粉碎，即得淡紫拟青霉肥药。
实施例2：淡紫拟青霉肥药的制备
与实施例1不同的步骤如下，其余未说明的步骤同实施例1：
步骤(2)厚层通风发酵制备淡紫拟青霉固体发酵培养物
腐熟的养殖场发酵床垫料70份，米糠15份，玉米淀粉15份，搅拌均匀后加水，调整含水率为40％，接种步骤(1)的生产用液体菌种8份(以上均为重量份)，转入固体发酵池中，通风，在27℃下发酵，24～30小时翻动一次，发酵9天，即得到淡紫拟青霉的固体发酵培养物。
本发明制备的淡紫拟青霉肥药的效果试验
烟草根结线虫盆栽防治试验
1供试线虫采集和繁殖
供试线虫从受线虫侵染的根围获得。受害根结在显微镜下检查并经扫描电镜观察鉴定，确认为爪哇根结线虫(Meloidogyme javanica)后，采用卵囊接种法，将线虫接种于烟苗根部进行扩大繁殖。
2试验处理
在栽培钵中先加入经日晒消毒并经分离证实无线虫的健土，作以下4种处理：1.肥药处理：每钵各加入100g经接种繁殖带根结的根际病土和50g肥药；2.杀线虫剂处理：每钵各加入100g带根结的病土和2g杀线虫剂(3％呋喃丹颗粒剂)，隔15d后在施1次杀线虫剂(每钵2g)；3.日晒消毒土壤：每钵加入100g经日光消毒的土壤，不接线虫，不施药。对照(CK)：每钵加入100g带根结的病土，不防治。每处理组均植入长势均匀的三叶龄烟苗，每处理20钵，试验重复2次。盆栽试验用菌量为50g/每株。
定植后，观察植株的生长情况。烟苗生长2个月后，拔出烟苗，用清水冲洗去根系土壤，逐一量出植株高度、叶长，用普通天平称出每株地上部和根系鲜重。按以下标准进行根结严重度分级：0级为所有根系均未被线虫侵染，无根结；II级为根结占总根系的26％-50％；III级为根结数占总根系的51％-75％；IV级为根结数占总根系的76％-100％。病情指数＝各级株数×严重度级数/调查总株数×最高病级数
按以上公式算出各处理组中的病情指数。每钵取根系土样1份，按处理组混匀，称取50g，在显微镜下观察，统计出根围土壤中的2龄线虫群体水平。
3防治效果
3.1药效
烟草根结线虫在烟草根部为害产生根结，导致地上部生长不良。试验结果表明，施用肥药和杀线虫剂均能有效地抑制根结线虫的繁殖和减轻为害。杀线虫剂作用最强，烟草根结线虫病病情指数比对照下降39.5％，二龄线虫数减少79.2％，其次是施用肥药，植株病情指数比对照下降了34.0％，二龄线虫数减少了76.3％(表1)
表1  病情指数和土壤中的二龄线虫数(50g根围土壤中)

3.2肥效
试验结果表明，淡紫拟青霉肥药不仅对线虫起抑制作用而且能促进烟草植株生长。虽然与杀线虫剂相比，根结病情指数稍高，但植株生长却比呋喃丹处理组健壮。从植株长势看，加入肥药的烟株叶色浓绿，长势良好；加入3％呋喃丹颗粒剂的烟草的植株叶茎短缩，叶色偏黄，株高明显低于加肥药的烟株；而仅加病土的对照则明显矮小，长势差；使用日晒消毒土壤种植的烟株生长健壮。烟株生长性状测定结果表明，经处理的烟草植株和根系平均鲜重、株高、叶长均明显高于未处理的植株。施用肥药的植株地上部平均鲜重比对照增加96.25％，根系增加153.85％，株高和叶长分别增加75.89％和38.89％，以根系增重最为显著。此外，施用肥药的烟株其地上部及根系的平均鲜重、株高和叶长均明显高于施用杀线虫剂的烟。将施用肥药组和使用日晒消毒健土处理组进行比较，肥药组的地上部和根系鲜重2、7周后调查发现：土壤中2龄线虫减少76.3％，根结指数下降43.6％，烟株根生长量增加153.7％，地上部分鲜重增加44.4％
茄子根结线虫田间小区防治试验
1根结线虫卵体的制备：
室内培养的根结(带根结线虫)剪切后，用双层纱布过滤，在解剖镜下计算根结线虫卵数。
2实验处理
试验于2003年在福建省福州市永泰葛岭福建农科院生物技术中心实验基地进行，共设三个肥药处理，每处理穿插一个对照，田间每畦种植36株，每处理为三畦分为两排，即每处理各108株。茄子长二片真叶时，三个处理分别以淡紫拟青霉肥药兑清水浇灌。浇菌一周后用根结线虫卵体接种，500株茄子苗共接4000个卵(悬浮液浓度≈10个/mL)，二周后重复上次接卵处理。茄苗移栽大田后，分别在生长期、花期各浇灌肥药一次(孢子浓度≈1.2×10⁷个/mL)，CK用清水浇灌。跟踪调查根结线虫的数量以及植株生长情况，评价肥药的效果。
3防治效果
3.1药效
表1.田间茄子根围根结线虫虫口密度抽样调查(单位：条/50g土)