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1、10申请公布号CN102010831A43申请公布日20110413CN102010831ACN102010831A21申请号201010182965922申请日20100526CCTCCNOM201012320100520C12N1/14200601A23F3/10200601C12R1/64520060171申请人云南农业大学地址650201云南省昆明市黑龙潭云南农业大学茶学院72发明人周红杰卓婧魏珍珍赵明李亚莉袁文侠李家华秘鸣74专利代理机构昆明今威专利代理有限公司53115代理人杨宏珍54发明名称一种产洛伐他汀真菌及其在普洱茶生产中的应用57摘要本发明涉及一种产洛伐他汀真菌及其在普洱茶。
2、生产中的应用，属生物技术领域。本发明的生产菌株由生产菌株的分离、纯化、经薄层层析初筛、高效液相复筛工序后得到。生产菌株为产洛伐他汀紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVSMPT13，保藏日期2010年5月20日，保藏号CCTCCM2010123，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉武汉大学。本发明将产洛伐他汀的真菌应用于普洱茶的生产中。本发明的优点在于将紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVS按一定的比例接种应用到普洱茶发酵过程中，得到了含洛伐他汀的普洱茶且在保持传统普洱茶风味的基础上，香气和汤色方面也具有新的特点，并且缩短了加工时间，对普洱茶新产品与特色普洱茶的开发发挥重要作用。。
3、83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页CN102010834A1/1页21一种产洛伐他汀真菌，由生产菌株的分离、纯化、经薄层层析初筛、高效液相复筛工序后得到，其特征在于生产菌株为产洛伐他汀紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVSMPT13，保藏日期2010年5月20日，保藏号CCTCCM2010123，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉武汉大学。2权利1所述的产洛伐他汀真菌，其特征在于产洛伐他汀真菌应用于普洱茶的生产中。权利要求书CN102010831ACN102010834A1/3页3一种产洛伐他汀真菌及其在普洱茶生产。
4、中的应用技术领域0001本发明涉及一种产洛伐他汀真菌及其在普洱茶生产中的应用，属生物技术领域。背景技术0002近年来，普洱茶由于其良好的降脂功效和独特品质而受到广泛关注，且有多位学者报道在普洱茶中发现了洛伐他汀，他汀药物是羟甲戊二酰辅酶AHMGCOA还原酶抑制剂，是最为经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗，但目前还未有关于洛伐他汀和普洱茶中微生物的系统研究，也尚未有产洛伐他汀菌株应用在普洱发酵中的研究。0003利用红曲霉菌生产红曲米和红曲色素的生产和应用已有上千年的历史，其用途也由医用领域逐渐扩展到食品领域。红曲霉在发酵过程称产生的次级代谢产物洛伐他汀做为良好的天然降脂药成为研究与生。
5、产的热点，天然红曲中的洛伐他汀多为酸式，其空间结构与体内HMGCOA更为接近，无需水解，直接发挥抑制体内胆固醇合成的作用，其活性较内酯式高约一倍，福建、浙江一带已经开发出多种含有洛伐他汀的功能性荞麦红酒、饼干等保健食品。0004在普洱茶研究领域，由于长期缺乏学科的研究，尤其是从微生物的角度来进行普洱茶的研究。而如何通过对云南普洱茶加工中微生物的研究，控制普洱茶中洛伐他汀的含量尚未见公开的文献报道。发明内容0005本发明的目的是从微生物的角度对普洱茶进行研究，为生产企业提供生产含洛伐他汀普洱茶的有益菌株来源。本发明的另一目的是通过控制有益菌种在普洱茶生产中的比例，为促进云南普洱茶品质稳定和提高发。
6、挥作用。0006本发明的产洛伐他汀真菌，由生产菌株的分离、纯化、经薄层层析初筛、高效液相复筛工序后得到。生产菌株为产洛伐他汀紫色红曲菌霉MONASCUSPURPUREVSMPT13，保藏日期2010年5月20日，保藏号CCTCCM2010123，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉武汉大学。0007本发明的紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVS的形态学特征为0008培养7D，在PDA培养基上菌落直径达29CM，菌落稍隆起，有放射状沟纹，边缘整齐，气生菌丝稀少，基内菌丝发达，菌落颜色以桔红色为主，边缘为浅肉色；菌落背面有放射状沟纹，边缘整齐，颜色以深桔红色为主，边缘桔黄色。在麦芽汁培养。
7、基上菌落直径达25CM，菌落稍隆起，有放射状深沟纹，边缘整齐，气生菌丝非常稀少，基内菌丝发达，菌落边缘凹陷，菌落表面有皮膜状，菌落颜色由里到外从土色变成桔红色；菌落背面有放射状沟纹，有呈开裂状，边缘整齐，颜色呈土色。在察氏培养基菌株生长弱，菌落平，直径为12CM，边缘不整齐，界限不清，气生菌丝稀疏，基内菌丝生长弱，说明书CN102010831ACN102010834A2/3页4菌落颜色呈淡桔红色；菌落背面颜色呈淡桔红色，边缘界限不清。本发明经公知的初筛、复筛、天然培养基培养、根霉纯化培养等传统工序后得到。0009显微形态为菌丝不规则地分枝、有隔膜，内有油滴，壁上附有许多颗粒，直径为2992M。。
8、分生孢子单生或成链，球形或倒梨形，669279131M。闭囊壳无孔口，球形或稍椭圆形，直径204714M，呈桔红色或稍浅红色。子囊孢子卵形或椭圆形，39534766M。0010红曲霉所产生的大量酶类和色素对普洱茶品质形成有着重要作用，接种产洛伐他汀菌株紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVSMPT13发酵的普洱，在保持传统普洱茶品风味的基础上，香气和汤色方面也具有新的特点。0011本发明的产洛伐他汀的真菌应用于普洱茶的生产中。0012本发明的优点在于将紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVS按一定的比例接种应用到普洱茶发酵过程中，得到了含洛伐他汀的普洱茶且在保持传统普洱茶风味的基础上，。
9、香气和汤色方面也具有新的特点，并且缩短了加工时间，对普洱茶新产品与特色普洱茶的开发发挥重要作用。具体实施方式0013实施例1紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVS菌种的分离纯化0014从采集到的样品中，通过PDA培养基200G马铃薯洗净去皮切块，加水1000ML煮半小时，纱布过滤，再加20G葡萄糖和18G琼脂，121灭菌30分钟后倒平板和麦芽汁培养基麦芽汁750800ML，加水至1000ML，加1518G琼脂，121灭菌30分钟后倒平板分离纯化。0015分离纯化方法如下00161将固体培养基熔化，冷却至45，注入无菌培养皿中，每皿约1520毫升，稍微摇转，静置，使成平板备用。00172取。
10、要分离的粉碎样品1G，在火焰旁加到装有9ML无菌水的试管中，此时得到的是102的菌悬液。00183稀释按十倍稀释法把菌悬液稀释至108，十倍法是指下一管的菌悬液要比上一管的稀十倍。00194接种事先准备好的平板9套，分别标号为106、107、108，每个稀释度写三套平皿，以便比较。在每个已标号的平皿中注入1ML相应的菌悬液，用涂布棒涂均匀，放入2528培养24小时观察。00205培养25天后，挑取单个菌落，多次划线纯化得到纯化菌株。0021实施例2产洛伐他汀紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVS的筛选00221液态发酵0023分离纯化得到的菌株，接种麦芽汁斜面，28培养6D后，以10ML。
11、无菌水洗入带玻璃珠的小三角瓶中制成孢子悬液。取3ML孢子悬液接种于50ML液体种子培养基中每250ML三角瓶装液50ML30，150R/M，培养23D至液体颜色微红。0024按5的接种量将液体种子培养基接入液体发酵培养基中250ML装液量50ML28，150R/M培养1214D左右。说明书CN102010831ACN102010834A3/3页500252薄层层析初筛0026取发酵液1ML，加乙酸乙酯5ML30下150R/MIN振摇3小时离心，收集上清液沉淀再以5ML乙酸乙酯抽提2次合并上清液，蒸干以少许苯溶解干燥物待苯溶液会发后，加02ML甲醇溶解。待测液在薄层层析板上点样10L，在环己烷氯。
12、仿异丙醇631的展开剂中展开，吹干后，以10磷钼酸显色。00273高效液相复筛0028取1ML发酵液，加入10ML甲醇，超声波提取1H，先用滤纸过滤，再用微膜过滤，收集滤液，进行高效液相检测分析，分析条件为紫外检测波长238NM；色谱柱ECLIPSEXDBC185M，44150MM；流动相A甲醇；B60甲醇；柱温30；洗脱程序012MINA液，1000；B液，0100，1215MIN100B液，1520MIN100A液；流速1ML/MIN；进样量10L。0029实施例3紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVS在普洱茶发酵中的应用0030将毛茶按传统的方法进行湿热，随后在毛茶中接种重量比5的紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVS的固态发酵剂让其发酵，定期翻堆，当堆温升高到253时，MONASCUSPURPUREVS开始进行代谢，洛伐他汀为红曲霉的次级代谢产物，在接种发酵后的35天后开始产生，1215天产量达到最高。0031经接种紫色红曲霉MONASCUSPURPUREVS后生产的普洱茶，洛伐他汀含量最高达到0263MG/ML，且形成了汤色红浓明亮，滋味甘滑，香气酯香突出的风味特征。说明书CN102010831A。