纳米金作为葡萄糖氧化酶的应用 【技术领域】
本发明涉及检测葡萄糖的方法，具体涉及利用纳米金作为葡萄糖氧化酶的应用。
背景技术
随着糖尿病人越来越多，葡萄糖检测技术目前被广泛应用于临床检测中。目前，普遍被应用的葡萄糖检测方法主要包括两大类：酶学比色法和电化学法。电化学法检测比较灵敏，但是需要专门仪器即电极和电化学工作站，不便于检测。酶学比色法应用的较多，且被制成试纸条用于便携检测，但由于这个反应体系中用到了酶联反应，而生物酶需要一定的反应条件且很容易失活，所以保存时必须注意到维持两种酶的活性。
为了提高生物酶的稳定性，增强酶活性，提高酶的反应效率，有很多文献常使用固定化酶技术来改善酶的活性及保存条件。Jianhong Liu(Langmuir2009，25(23)，13456-13460)等合成了一种新型的复合物，将葡萄糖氧化酶固定在复合物表面，在增强酶活性的同时，也提高了酶的稳定性。Pratibha Pandey(Langmuir 2007，23(6)，3333-3337)等在这个反应体系中引入了纳米材料，通过化学键将葡萄糖氧化酶固定在纳米金表面，增强酶活性，提高了稳定性，且增强了酶对温度和pH的耐受性。还有一些文献中，引入了量子点、Fe
3O
4等纳米材料。
但是上述方法只是通过在反应体系中引入其他物质，利用固定化酶技术提高了酶的活性，并没有从根本上解决问题，酶的活性还是受到一系列因素的制约，如温度、pH、保存条件等，且在反应体系中引入其他物质后，使整个体系变得更复杂。本发明力求从根本上解决生物酶的劣势，制备出一种稳定性高，反应容易进行，保存方便，成本较低的“纳米酶”。
【发明内容】
本发明所要解决的问题在于在葡萄糖的检测中，将纳米金作为葡萄糖氧化酶的应用，以克服传统的生物酶在反应条件及保存上的种种问题，制备出一种稳定性高，不需要特定的反应条件，易于保存，成本较低的“纳米酶”，应用于葡萄糖的检测。
本发明的技术方案如下：
纳米金作为葡萄糖氧化酶的应用，其中，将粒径为10nm-20nm的纳米金与葡萄糖反应，加入过氧化物酶及显色物质，以检测葡萄糖。
所述纳米金的粒径为13nm，所述纳米金的溶度为17nM。
所述的纳米金的制备方法包括：取质量分数为1％HAuCl
4溶液1.7ml和48.3ml的超纯水混合并加热搅拌；在完全沸腾后，加入5ml的11.6mg/ml的柠檬酸三钠；停止加热后继续搅拌，冷却；静置后过滤得到纳米金颗粒。
所述纳米金与葡萄糖反应的温度为0℃-70℃，优选为55-70℃。所述纳米金与葡萄糖反应的酸碱度为pH2.0-9.0，优选为pH2-4或pH7-9。所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明中制备的纳米金，制备方法简便且快速、原料易得、成本较低、可重复性高。
2、本发明中制得的纳米金的葡萄糖氧化酶活性与传统的葡萄糖氧化酶相当，对葡萄糖的亲和力相差不大。
3、本发明中制得的纳米金对反应温度和反应pH没有特殊的要求。
4、本发明中制得的纳米金与传统的葡萄糖氧化酶相比，具有很高的稳定性，能在室温下保存。
【附图说明】
图1为不同粒径纳米金的催化活性。
图2为比较本发明中的纳米材料与传统的葡萄糖氧化酶对葡萄糖亲和力的大小。
图3为比较本发明中的纳米金与传统葡萄糖氧化酶对反应温度的要求。
图4为比较本发明中的纳米金与传统葡萄糖氧化酶对反应pH的要求。
图5为比较本发明中的纳米金与传统葡萄糖氧化酶的稳定性。
【具体实施方式】
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
1、纳米金的制备
试剂包括：
氯金酸购自Sigma公司，分析纯的柠檬酸三钠购自国药化学试剂有限公司。
制备过程包括以下几个步骤：
(1)取质量分数为1％HAuCl
4溶液1.7ml和48.3ml的超纯(MilliQ)水倒入蒸馏瓶内，设置加热温度开始加热，并将转速调至200r/min；其中，加热温度为120-130℃，目的是将氯金酸溶液加热。
(2)在完全沸腾后，将转速调至400r/min，并加入5ml的11.6mg/ml的柠檬酸三钠；在高温下能将氯金酸还原而生成纳米金，在加入柠檬酸三钠后可以观察到溶液颜色从无色变黑-褐色-紫色，最后为紫红色。
(3)加热20分钟后，停止加热，继续搅拌半个小时，冷却至室温，防止粒径不均一。
(4)静置12小时后，用0.22um滤膜过滤除去反应中的一些杂质，得到粒径比较均一的浓度为17nM、粒径为13nm的纳米金。
其中值得注意的是，HAuCl
4溶液与超纯水、柠檬酸三钠的比例是固定的。三者之间特定的比例用于制备特定粒径、特定浓度的纳米金。合成的纳米金的粒径经过AFM或者TEM表征。
其中，不同粒径纳米金的催化活性如图1所示。其中，纳米金的粒径优选为10nm-20nm。
2、检测葡萄糖
试剂包括：
葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶及显色物质2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)ABTS均购自Sigma公司，分析纯的葡萄糖购自国药化学试剂有限公司。
检测葡萄糖的过程包括如下几个步骤：
(1)将17nM纳米金15ul与0.2M葡萄糖30ul在37℃反应30min；
(2)在上述溶液中加入10
-2mg/ml辣根过氧化物酶5ul及显色物质ABTS(0.1M，pH5.0)；
(3)10min后观察显色，测410nm处的吸光值。
此检测过程简单易行，重复性强。本发明的纳米金与传统的葡萄糖氧化酶对葡萄糖亲和力的大小的比较如图2所示。
其中，步骤(1)是纳米金将葡萄糖催化产生葡萄糖酸和过氧化氢。用纳米金代替传统的检测体系中的生物酶，在反应条件和稳定性上都具有很大的优势。
其中，步骤(2)是在有过氧化氢的存在下，辣根过氧化物酶将还原态的显色物质氧化而显色，在410nm处有吸光值。
3、纳米金的反应条件的探究
试剂包括：
EDTA、三乙胺、羟胺、盐酸、三氯化铁、三氯乙酸均购自国药化学试剂有限公司。
将上述试剂配制成如下溶液：
溶液一：5mM EDTA+0.15M三乙胺
溶液二：3M NH
2OH
溶液三：1M HCl+0.1M FeCl3+0.25M CCl
3COOH
反应温度的探究：
将17nM纳米金15ul和2*10
-3mg/ml葡萄糖氧化酶5ul分别与0.2M葡萄糖30ul混合后分别放置于调节至不同温度(0℃-70℃)的水浴锅，反应30min后，进行显色，探究不同反应温度对此反应的影响。
由此实施例结果发现，葡萄糖氧化酶在不同温度下的活性呈现“钟罩型”特征，即温度过高或过低，其活性都受到影响，温度过低时活性受到抑制，温度过高时葡萄糖氧化酶又将失活，其最适反应温度为37℃。而对于纳米金，随着温度的升高，其催化活性越高，在葡萄糖氧化酶失活时，纳米金仍具有很高的活性，说明纳米金对反应温度没有特殊要求，在0-70℃都催化葡萄糖氧化，其中温度优选为55-70℃。
反应pH的探究：
将1ml纳米金(13nm、17nM)浓缩后除去上清，加入不同pH(2.0-9.0)的缓冲液PBS(稀释10倍至浓度为100mM)100ul，再加入1M葡萄糖40ul，反应30min后，检测产生的葡萄糖酸，即加入250ul溶液一和25ul溶液二，反应15min，再加入125ul溶液三，反应5min，测505nm处的吸收。
葡萄糖氧化酶(10ul，1mg/ml)+不同pH的缓冲液(稀释10倍至浓度为100mM)(90ul)，再加入1M葡萄糖40ul，反应30min后，检测产生的葡萄糖酸，即加入250ul溶液一和25ul溶液二，反应15min，再加入125ul溶液三，反应5min，测505nm处的吸收。
由此实施例结果发现，葡萄糖氧化酶在不同pH下的活性也呈现“钟罩型”特征，即pH过高或过低，其活性都受到影响，其最适反应pH为4.0-6.0。而对于纳米金，在不同的反应pH条件下都能正常进行反应，在葡萄糖氧化酶不能起催化作用时，纳米金仍具有很高的活性，说明纳米金对反应pH没有特殊要求，能在较宽的反应pH条件(2.0-9.0)下正常氧化葡萄糖，其中优选pH2-4或pH7-9。
4、纳米金的稳定性及保存
将纳米金和传统的葡萄糖氧化酶分别置于4℃和室温下放置12小时和放置24小时后，检测葡萄糖氧化酶和纳米金的氧化活性，即(1)与葡萄糖反应30min；(2)在上述溶液中加入辣根过氧化物酶及显色物质；(3)10min后观察显色，测410nm处的吸光值。
从此实施例的结果发现，葡萄糖氧化酶在4℃下保存，基本能维持活性，但是在室温下放置12小时后，活性丧失一半，24小时后，基本已经没有活性，而纳米金能在4℃保存，也能在室温下保存，24h后仍能维持活性。纳米材料在保存上占有优势。
由以上实施例的结果发现，葡萄糖氧化酶在反应温度、反应pH和保存上均受到很大的制约，而由于纳米材料的一些特殊性质，使得本说明中的纳米金的葡萄糖氧化酶活性对反应温度和反应pH没有什么特殊的要求，由于纳米材料的稳定性，使得纳米金能在室温下保存，并且仍能保持很高的活性，克服了传统的生物酶的种种劣势，同时有具有较高的葡萄糖氧化酶活性，基本与葡萄糖氧化酶相当。
本发明中提供的纳米金与昂贵的生物酶相比，制备方便、经济可行，且纳米金作为葡萄糖氧化酶的应用的检测方法操作简单，保存方便。
以上所述的，是根据本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的技术内容为本领域技术人员的公知常识。