用于治疗和保护结缔组织尤其是软骨的可植入基材 本发明涉及关节病中用于治疗和保护软骨的可植入基材(substrate)，更具体地说，涉及用于治疗和/或保护结缔组织尤其是软骨的可植入基材，它包括：至少一种利于体内细胞侵入和/或形成细胞基质和/或释放所用因素(means)内组份的结构，和至少一种用于激活局部存在的细胞使之再生为组织的因素。本发明还涉及该基材的制造方法，一种在关节病中用本发明基材治疗和/或保护结缔组织尤其是软骨的方法，以及本发明基材在外科和组织工程中的用途。关节病
骨关节病是世界上最常见的关节病之一，65岁以上人群中大多数受其影响。治疗骨关节病的方法因此与临床、保健政策和经济存在密切相关。在这种原发性退行性年龄依赖性疾病的病程中，关节表面会发生局部逐步损坏，并发生临近和软骨下骨结构的反应性局部生长失调(骨赘)，导致疼痛，以及功能和行动限制。影响骨关节病发生的系统性因素是年龄、性别、体重、骨质疏松、遗传因素和过度的机械负荷(mechanical stress)。局部因素包括关节的特定形状、变形、创伤和具有特殊作用的生物力学因素。虽然是原发性退行性发生过程，但在骨关节病的病程中可观察到炎性变性，例如滑膜炎(关节内皮发炎)和促进炎症的生物信使物质(细胞因子和生长因子)产生。以上变化表现为承重软骨和骨结构部位的组织平衡失调，即，退行性过程与修复过程之间失去了平衡(WB van den Berg：细胞因子和生长因子在骨关节病中软骨损坏中地作用。Z Rheumatol.58：136-141，1999)。
病因是包括骨、肌肉和关节神经支配在内整个关节部位的功能失调，最后造成过度的机械负荷和生化介导的病患关节损伤。而且，重要的是，目前还无法治愈该疾病：一般的理疗、镇痛、消炎药(非甾体类抗风湿药)都是不彻底的对症治疗。传统整形外科手段(扩创，关节刮削，显微骨折，钻孔)也并非完全有效。如果发生广泛变性，就只能用假关节进行手术重塑了(JA Buckwalter，HJ Mankin：关节软骨的修复和移植：关节炎和风湿病41：1131-1342，1998)。用细胞和生长因子通过组织工程再生软骨
组织工程为功能活性的自体细胞移植和任选形状的生物材料移植提供了新的技术可能。
用这种技术可以塑造或培植新的软骨和骨组织。通常，组织工程的基础是自体细胞培育，这些细胞被用于日后以溶液或成熟移植体的形式移植到患者体内。但不幸的是，这些细胞的繁殖能力有限，而且，体外多次传代会使这些细胞的功能严重丢失。
组织工程的另一种方法是用生长因子刺激组织本身再生，或至少刺激预先取自患者的细胞分化。就此而言，特别值得注意的是TGF-β-超家族，因为它们在组织和器官的发育中具有重要作用。在组织工程中，运用这些因子有许多截然不同的理论。例如，部分细胞可用TGF-β-家族的基因转染以促进其成熟，但同时也是为了保护例如慢性炎症关节的组织免遭再次损坏(EvansCH，Robbins PD：关节炎的基因疗法，基因疗法：直接基因转移的方法和应用，JA Wolff编，Boston，Birkhuser，321，(1994)；Kalden JR，Geiler T，Hermann M，Bertling W：Gentherapieder rheumatoiden Arthritis-ein bereits anwendbares Therapieprinzip？-Z Rheumatol57：139-47(1988)；Herndon JH，Robbins PD，Evans CH：关节炎：你的基因治愈了吗？美国骨关节外科杂志81：152-7，(1991))。
另一种方法是用释放系统(US5,910,489)，即，由可吸收的微粒或细胞载体瞬间释放出因子，用于例如在治疗的关键阶段稳定植入体。最后，不用细胞，仅用生长因子和生物材料就可以直接再生出组织(Kübler，Osteoinduktion und-reparation，Mund-Kiefer-Gesichtschir.，1，2-25，(1997))。
发现和鉴定能够影响体细胞成熟和分化的新因子就可以仅由少量白体细胞制造出完全成熟的替代软骨或骨。
然而，这种技术的主要缺点在于必需首先获得患者的组织样品，还需要进行相当复杂的细胞培养。
干细胞，生长因子的聚集
在自然发生的组织愈伤过程中，损伤周围的细胞通常会聚集起来以填补损伤。它们主要是前体细胞，这些细胞以后将通过分化发育成具有特定功能的组织细胞。因此，发生骨折时，来自骨膜和骨髓的前体细胞迁移到损伤部位，“绕过”软骨组织而形成新骨。但是，利用侵入的前体细胞自然再生软骨人体中根本不行。显微骨折等方法的目标是打开来自骨髓的细胞进入关节间隙的通道。
在软骨治疗领域还开发了一些生物活性物质，它们具有趋化性、抗炎性、抗血管生成性、诱导分化或抗粘附性(美国专利5,853,746：用功能性壁垒治疗和修复软骨或骨损伤的方法和组合物；美国专利5,817,773：利用成纤维细胞生长因子的干细胞刺激、产生、培养和移植；美国专利5,910,489：含有透明质酸和NSAIDs的局部用组合物)。
本发明的目的是发明一种可用于治疗和/或保护结缔组织尤其是软骨的基材。以上目的的实现是通过提供一种可在关节病中用于治疗和/或保护结缔组织尤其是软骨的可植入基材。
本发明的基础是运用或刺激多能前体细胞和间质干细胞来再生组织，涉及繁殖和分化的潜力对软骨和骨的治疗具有极大意义。前体细胞和干细胞的应用方式与成熟细胞的类似。这样，就可以在特定的培养条件下，用不同的形态发生因子，例如FGF(成纤维细胞生长因子)或TGF-β(转化生长因子β)-超家族影响它们的分化(美国专利5,817,773)。
因此，本发明涉及一种用于治疗和/或保护结缔组织尤其是软骨的可植入基材，它包含：至少一种可活化局部存在的细胞以实现组织再生的因素(means)，和至少一个利于体内细胞侵入和/或细胞基质形成和/或上述因素中组份释放的结构。
本发明还涉及一种用于保护和/或治疗结缔组织尤其是软骨的基材，它包含至少一种包括分化和趋化因子的因素，最好还包含前文所述的结构。
在本文中，“基材”即完整的本发明主题。本发明的基材可以是，例如，可铺展或胶粘性“细胞吸引性糊剂”或一种“生物活性软骨硬膏”。
图1显示了本发明的一种实施方式。
“利于体内细胞侵入和/或细胞基质形成和/或所用因素中组份释放的结构”指内含本发明上述因素的基质。
“因素”包括所有适用于本发明的生物活性和非活性组份，它们的作用是激活局部存在的细胞以实现组织再生。
“趋化因子”指能够将细胞“吸引”到治疗部位或本发明基材所在位置的生物活性因子，所述的细胞例如来自骨髓的软骨前体细胞，自体间质细胞，祖细胞和干细胞。
“分化因子”指能够诱导细胞例如前文所述细胞生长并形成新组织的生物活性因子。
出人意料的是，本发明可提供一种基材，它含有能够诱导并控制来自周围组织(如果是关节软骨，所述周围组织就是骨髓或滑膜)的组织前体细胞侵入的因素。这样的诱导和控制缘自本发明基材所含因素在治疗过程中的释放。
图1显示了一种夹心结构的本发明优选实施方式。因素
本发明的因素能够诱导并控制来自周围组织的组织前体细胞向治疗部位的侵入。通常，所述因素即能够动员和/或活化和/或吸引自体间质细胞、祖细胞和干细胞的物质。具体地说，这些因素包括生物活性因子，例如趋化因子或趋化和分化因子。具体地说有以下因子：
生长和分化因子，例如TGF超家族的因子，FGF家族的因子，PDGF，IGF，EGF；
细胞粘附分子，例如整联蛋白，CD44，选择蛋白，蛋白聚糖；
合成肽，例如RGD序列，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸；
细胞因子；
趋化因子，例如CDMP，CTGF，骨桥蛋白，NO-合成酶阻滞剂；或
胞外基质组份，例如蛋白聚糖，纤连蛋白，胶原蛋白。
此外，根据用途，本发明所述的因素可还包括以下组份：
酶或其前体，例如蛋白酶，金属蛋白酶，组织蛋白酶；
酶抑制剂，例如THVIP，抗体或催化中心的合成阻滞剂；
抗炎添加剂，例如抗炎药物和/或抗炎因子。
此外，所述因素还可包括自体细胞和非自体细胞，例如间质细胞，祖细胞和干细胞/前体细胞，然后由它们释放出相应的因子。
在进一步的实施方式中，还可将基因或生物活性因子转染到细胞内。
本发明所用因素的两种或更多种组份可以同时或先后，及/或从本发明基材或结构的两相或更多相/组份/层中分别释放。此外，本发明的因素和/或结构还可含有延迟组份释放的机制。结构
本发明的基材还具有利于体内细胞侵入和/或形成细胞基质和/或释放所用因素中组份(尤其是所含各因子)的结构，实施方式之一中，所述结构为必选，另一实施方式中则为任选。
本发明所述利于体内细胞侵入和/或形成细胞基质和/或释放所用因素中组份(尤其是趋化和/或分化因子)的结构包括：
水凝胶；
海绵体(例如胶原质海绵体)；
多糖制成的毛或棉毛样结构(例如，纤维素毛，纤维素棉毛)；
天然或合成的多肽(血纤蛋白，聚赖氨酸)；
纤维制成的褶纹布、纱或织物(例如可吸收的聚合物纤维)；
粘合糊剂(例如丙烯酸酯)，胶粘膜(血纤蛋白原，有涂层的透明质酸片)；
陶瓷材料；
或以上所述的组合。
本发明所用的结构，亦即本发明的基材，可以是可吸收的也可以是不可吸收的。例如，可吸收的结构可包含透明质酸(最好是分子量400-600kD的透明质酸)，聚α羟基酸，胶原，藻酸盐(酯)，琼脂糖，血纤蛋白，生物玻璃材料，或它们的组合。不可吸收结构可包含例如陶瓷材料，或陶瓷材料与可吸收性结构的组合。
此外，本发明的基材可以包含多个亚结构。这些亚结构能够储存并释放本发明所用因素或其中的各组份，它们包括多个层、液滴/微球或表面包衣。因此，可以在陶瓷材料的格状结构中包含内有本发明因素的水凝胶。
因此，本发明基材可以制成海绵的形状，珠体、膜/片、栅格、棉毛、袋子/垫子、液体、凝胶或多层材料的形式。此时，所述基材可以是含有包含透明质酸及趋化生长因子(例如骨桥蛋白)的聚合物(例如聚乙醇酸交酯)毛样结构。
总的说来，本发明的基材具有可成形，可铺展或糊状特性，并具有弹性或塑性之类机械特性，而且是可注射的。
本发明的基材或其中的结构(如果有)可以包含多个相和/或组份和/或层，然后分别释放两种或多种因素。
在一优选实施方式中，可将间质干细胞与透明质酸混合，然后在治疗部位进行注射。
在一具体实施方式中，所述基材为多层结构，用于覆盖关节表面，在其下表面用栓、空心栓/针和/或固定结构(例如Velcro搭扣)固定。此外，它们可构建成在其下表面释放(例如)软骨消化酶即金属蛋白酶、透明质酸酶、组织蛋白酶。所述的栓、空心针或固定结构最好是可吸收的。
在另一实施方式中，用双筒注射器同时注射或用不同的注射器先后注射间质干细胞和/或其他结缔组织前体细胞和透明质酸，所述细胞例如骨外膜和软骨膜的细胞。
本发明的可植入基材能够动员、活化和/或吸引自体间质细胞、祖细胞和/或干细胞，并刺激它们繁殖、分化和/或成熟。还可向这些细胞内转染基因或上述生物活性因子。制造方法
本发明可植入基材的制造是通过：将利于形成细胞基质和/或体内细胞侵入和/或释放所用因素中组份的结构与至少一种用于活化局部存在的细胞以再生组织的因素接触；或者，如果本发明的基材不包含所述结构，则其制造是通过接触分化因子和趋化因子。治疗方法
此外，本发明还涉及一种治疗和/或保护结缔组织的方法，尤其是在关节病中。该方法的特征在于结缔组织与本发明的基材接触。
“结缔组织”在本文中包括软骨、骨、腱和半月板。在一优选实施方式中，当本发明方法用于治疗和/或保护软骨时，在软骨与本发明基材接触前先在软骨的软骨下间隙内形成连接通道。
例如，在进行软骨治疗和保护时，可用血纤蛋白或丙烯酸酯胶粘剂将所述基材固定于关节表面。所述血纤蛋白和丙烯酸酯胶粘剂最好与现成的趋化生长因子(软骨源性形态发生蛋白或结缔组织生长因子)一同给予。它们被固定于关节表面，最好用凝血酶形成人造的超级血凝块(superclot)。或者，在用双筒注射器时，本发明的基材包含一管内的本发明因素，例如分化因子和/或趋化因子，和另一管内的凝血酶。具体地说，后一种改换方式用于在治疗部位预先形成显微骨折之后，这样可以将生物活性物质(因素)引入超级血凝块。
诱导因素和/或因子的释放最好从外部实施，例如利用磁场、电流或电压脉冲、物质的迁移或注射。
本发明基材适宜在形成通入例如软骨下间隙的通道后植入，所述通道可通过例如显微骨折、钻孔、针刺等方法形成。在骨髓腔和关节间隙之间形成连接通道/孔可使用针栅，而该针栅可以是本发明结构的一部分。或采用Velcro搭扣样固定结构，使用时在下面垫以针栅。
以上本发明优选实施方式中之一的方法其特征在于：关节间隙和骨髓腔之间形成连接通道，关节病变软骨上粘附有粘性的亲软骨层，来自骨髓的细胞被吸引并进入周围软骨组织中发育，粘附层中的环境则临时提供营养和良性影响。这样，使用本发明基材在关节间隙与骨髓腔之间通过大量预先形成的微小孔/通道能够实现连接，由此诱导周围组织中的组织前体细胞的侵入，并可形成用于形成细胞基质的结构。上述方法的特点之一是所述基材(最好分多层)包含能够覆盖关节表面的结构和/或因素，由此诱导来自骨髓的软骨前体细胞的生长和成熟。
本发明基材表现为已知元素(间质细胞，祖细胞，来自骨髓的干细胞/前体细胞，生物活性因子)和新元素(骨髓腔和关节间隙之间的连接通道；用于覆盖关节诱导来自骨髓的软骨前体细胞生长和成熟的多层材料；人造超级血凝块)的组合，它们相互影响，因为它们的新作用产生了本发明的优点(协同作用)和期望的成功，这是因为：来自骨髓的细胞现在可以在本发明基材(例如用于覆盖关节表面的多层基材)中被吸引并进入软骨组织发育。使用本发明基材可最大限度地避免外部培养细胞然后将培养细胞植入患者，更好的是，完全替代后者。
本发明基材的用途体现在它们在外科和组织工程中的应用，具体地说，体现在关节病中软骨治疗和保护领域，以及它们用于细胞繁殖、分化和成熟的用途。
以下将通过实施例来进一步解释本发明。实施例实施例1
为了治疗一个因关节病而变形的关节表面，首先，通过钻多个小孔(1-2mm)形成骨髓腔与关节间隙之间的小通道。然后，用血纤蛋白或丙烯酸酯胶粘剂将加有透明质酸和趋化因子(骨桥蛋白)的毛样聚合物(聚乙醇酸交酯)粘到关节表面。实施例2
为了治疗实施例1中的关节表面，在骨髓腔的连接形成后，将加有现成趋化生长因子(软骨源性形态发生蛋白或结缔组织生长因子)的血纤蛋白胶粘剂敷在关节表面，并用凝血酶固定(人造超级血凝块)。缩略语表
CD44：分化簇；
CDMP：软骨源性形态发生蛋白；
CTGF：结缔组织生长因子；
EGF：表皮生长因子；
FGF：成纤维细胞生长因子；
IGF：胰岛素样生长因子；
NO-合成酶抑制剂：氧化氮合成酶抑制剂；
NSAID：非甾体消炎药；
PDGF：血小板源性生长因子(由血小板形成的生长因子)；
RGD序列：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列；
PVC：聚氯乙烯；
TGF-β-超家族：转化生长因子β超家族；
TIMP：金属蛋白酶的组织抑制剂。
图1中数字的说明
1：铺展的物质；
2：通向骨髓的连接通道；
3：前体细胞从骨髓迁出；
4：生物活性因子的释放；
5：间质细胞，可以经基因修饰；
6：含有生物活性因子的颗粒；
7：覆盖层；
8：含有分化因子或组织形成因子的层；
9：含有趋化因子的层。