一种芹菜素分子印迹聚合物的制备方法 【技术领域】
本发明属于生物化学工程技术领域，具体涉及一种芹菜素分子印迹聚合物的制备方法。
背景技术
芹菜素(Apigenin，API)又称芹黄素，属黄酮类化合物，广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类、茶叶中，也是菊花、半边旗、地钱、对圆锥铁线莲全草等中草药的有效成份之一。芹菜素具有抗肿瘤、抗炎症、降血压、抗动脉硬化和血栓症、抗焦虑、抗菌抗病毒以及抗氧化等多种药理活性。近年来国内外对高纯度的芹菜素需求日益增长。目前芹菜素主要是从天然植物中分离提取得到，传统方法主要采用溶剂提取法进行富集，然后通过柱分离技术进行分离纯化。近来涌现出很多新型分离技术，如采用大孔吸附树脂、高效液相色谱、高速逆流色谱、超滤膜分离和高效毛细管电泳等，但从现有的分离/提取技术看仍存在着不同程度的缺点，如：提取选择性差，溶剂消耗量大，环境污染严重，效率低成本高、工业化生产困难等。因此寻找对目标分子具有高亲和力、高选择性和高效分离的吸附材料是当务之急。分子印迹聚合物是一类利用分子印迹技术(molecular imprintingtechnology，MIT)制备在空间结构和结合点位上与模板分子完全匹配的，并对其具有特殊亲和性和选择性的分子识别材料。因此，将该材料应用于复杂的中药体系，从而高效且有选择性地分离/提取特定结构的高生物活性芹菜素具有重要的意义。
经过对现有技术的文献的查新，至今尚未发现与芹菜素分子印迹聚合物制备的相关报道。
【发明内容】
本发明提供一种芹菜素分子印迹聚合物的制备方法，该方法操作简单，制备的聚合物作为吸附材料可用于从中草药粗提物中选择性提取、分离、富集模板分子芹菜素及其结构类似物，且具有回收率高、重现性好、使用寿命长等优点。
本发明是通过以下的技术方案实现的，具体包括如下步骤：
(1)将模板分子芹菜素和功能单体按摩尔比1∶4～1∶10溶解到致孔剂四氢呋喃中，制备成混合液，恒温避光条件下使模板分子芹菜素和功能单体充分混合，其中功能单体为α-甲基丙烯酸、丙烯酰胺或2-乙烯基吡啶；
(2)在步骤1的混合液中加入交联剂和催化量引发剂，交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈，充分混溶后，通氮气脱氧，真空状态下于40～60℃水浴中反应24～48h得到棒状固体聚合物；
(3)将合成的聚合物磨碎后，过筛，丙酮沉降；
(4)以甲醇和乙酸的混合溶液为提取液，采用索氏提取的方式，对丙酮沉降后的聚合物提取72h以上，洗脱除去模板分子；
(5)提取结束后，将聚合物置于真空干燥箱中干燥至恒重，即得到芹菜素分子印迹聚合物。
在步骤(1)中，模板分子芹菜素与致孔剂四氢呋喃的量比为1∶40[n(mmol)/V(mL)]；恒温避光条件下使模板分子芹菜素和功能单体充分混合的方法为：恒温避光条件下采用振荡器振荡6h。
在步骤(2)中，交联剂物质的量为功能单体的4～7倍，引发剂用量为单体和交联剂质量之和的1％。充分混溶后，将混合液超声脱气15～20min，通氮气脱氧15min。
步骤(3)中，过筛为过180目分样筛。
步骤(4)中，提取液甲醇和乙酸的混合溶液中甲醇和乙酸的体积比为6∶4，洗脱除去模板分子后，用甲醇洗涤3次除去多余的乙酸。
其中制备芹菜素分子印迹聚合物的最佳条件为：在上述步骤(1)和步骤(2)中模板分子芹菜素、功能单体2-乙烯基吡啶，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为1∶8∶40，模板分子芹菜素与致孔剂四氢呋喃的量比为1∶40[n(nmol)/V(mL)]，引发剂用量为单体和交联剂质量的1％，充分混溶后，将混合液超声脱气15～20min，通氮气脱氧15min，真空状态下封管，于60℃水浴中反应24h得到棒状固体聚合物。
本发明制备的分子印迹聚合物是具有多孔结构的蜂窝状物质，平均孔径为34.1nm，具有良好的热稳定性，在245℃内无质量损失。平衡结合实验表明印迹聚合物含有与芹菜素空间结构匹配、官能团相互作用的孔穴，这种空穴对芹菜素分子具有“记忆”功能，因而对芹菜素具有很好的亲和性和吸附性能。选择性实验表明印迹聚合物对模板分子芹菜素具有显著的分子识别能力。本发明制备的芹菜素分子印迹聚合物可作为固相萃取吸附材料，也可用作HPLC的固定相，达到分离提取中草药复杂体系中芹菜素及其结构类似的黄酮类功能因子的目的，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
图1本发明制得的分子印迹聚合物表面放大20000倍的电镜图。
图2本发明制得的分子印迹聚合物的孔径分布曲线。
图3本发明制得的分子印迹聚合物的TG-DSC图。
图4本发明制得的分子印迹聚合物的平衡结合实验结果。
【具体实施方式】
一、制备实例
实例1
将0.5mmol模板分子芹菜素和4mmol功能单体2-乙烯基吡啶溶解到20.0mL致孔剂四氢呋喃中，制备成混合液，恒温避光振荡6h，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯20mmol，引发剂偶氮二异丁腈(用量为单体和交联剂质量的1％)，充分混溶后，超声脱气15min，通氮气脱氧15min，真空状态下封管。60℃水浴中反应24h得到棒状固体聚合物。将制备的聚合物磨碎并过180目分样筛，通过丙酮沉降3次除去微细的颗粒后，干燥至恒重。用体积比为6∶4的甲醇和乙酸的混合溶液为提取液，对聚合物索氏提取72h，除去模板分子后再用纯甲醇洗涤3次除去多余的乙酸。将聚合物置于真空干燥箱中干燥至恒重即得到芹菜素分子印迹聚合物，记为API-MIP，非印迹聚合物(NMIP)的制备除不加模板分子外步骤同印迹聚合物。所得芹菜素分子印迹聚合物表面放大20000倍的电镜图见图1，说明本发明制备的芹菜素分子印迹聚合物是具有多孔结构的蜂窝状物质。孔径分布曲线见图2，说明本发明制备的分子印迹聚合物中主要含有30～40nm地空穴，为聚合物的吸附和解吸传质过程提供了很好的通道，其平均孔径为34.1nm。TG-DSC图见图3，表明本发明制备的分子印迹聚合物具有良好的热稳定性，在245℃内无质量损失。本实施例所用条件为制备芹菜素分子印迹聚合物的最佳条件。
实例2
将0.5mmol模板分子芹菜素和2mmol功能单体丙烯酰胺溶解到20.0mL致孔剂四氢呋喃中，制备成混合液，恒温避光振荡6h，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯10mmol，引发剂偶氮二异丁腈(用量为单体和交联剂质量的1％)，充分混溶后，超声脱气20min，通氮气脱氧15min，真空状态下封管。60℃水浴中反应24h得到棒状固体聚合物。将制备的聚合物磨碎并过180目分样筛，通过丙酮沉降3次除去微细的颗粒后，干燥至恒重。用体积比为6∶4的甲醇和乙酸的混合溶液为提取液，对聚合物索氏提取72h，除去模板分子后再用纯甲醇洗涤3次除去多余的乙酸。将聚合物置于真空干燥箱中干燥至恒重即得到芹菜素分子印迹聚合物。
实例3
将0.5mmol模板分子芹菜素和4mmol功能单体2-乙烯基吡啶溶解到20.0mL致孔剂四氢呋喃中，制备成混合液，恒温避光振荡6h，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯28mmol，引发剂偶氮二异丁腈(用量为单体和交联剂质量的1％)，充分混溶后，超声脱气20min，通氮气脱氧15min，真空状态下封管。60℃水浴中反应24h得到棒状固体聚合物。将制备的分子印迹聚合物磨碎并过180目分样筛，通过丙酮沉降3次除去微细的颗粒后，干燥至恒重。用体积比为6∶4的甲醇和乙酸的混合溶液为提取液，对聚合物索氏提取72h，除去模板分子后再用纯甲醇洗涤3次除去多余的乙酸。将聚合物置于真空干燥箱中干燥至恒重即得到芹菜素分子印迹聚合物。
实例4
将0.5mmol模板分子芹菜素和4mmol功能单体2-乙烯基吡啶溶解到20.0mL致孔剂四氢呋喃中，制备成混合液，恒温避光振荡6h，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯20mmol，引发剂偶氮二异丁腈(用量为单体和交联剂质量的1％)，充分混溶后，超声脱气20min，通氮气脱氧15min，真空状态下封管。50℃水浴中反应24h得到棒状固体聚合物。将制备的分子印迹聚合物磨碎并过180目分样筛，通过丙酮沉降3次除去微细的颗粒后，干燥至恒重。用体积比为6∶4的甲醇和乙酸的混合溶液为提取液，对聚合物索氏提取72h，除去模板分子后再用纯甲醇洗涤3次除去多余的乙酸。将聚合物置于真空干燥箱中干燥至恒重即得到芹菜素分子印迹聚合物。
二、本发明芹菜素分子印迹聚合物的平衡结合实验
实验器材：日本岛津公司制造的UV-2450紫外可见分光光度计。
实验方法：配制一系列不同浓度的芹菜素四氢呋喃溶液，取等量的API-MIP和NMIP作为吸附剂对其吸附24h，紫外可见分光度法测定吸附平衡后上层清液的浓度，差减法计算聚合物对底物的吸附量Q。计算公式为：Q＝(C0-CS)V/W
其中Q为聚合物的吸附量，μmol·g-1；C0为平衡实验中被吸附化合物原始浓度，μmol·mL-1；CS为达到吸附平衡后上层清液中被吸附化合物的浓度，μmol·mL-1；V为吸附溶液的体积，mL；W为聚合物的重量，g。
具体实验步骤如下：
称取约50.0mg实例1制备的API-MIP和NMIP，分别置于5mL离心管中，加入一定浓度芹菜素的四氢呋喃溶液3.0mL，于振荡器上室温振荡24h后，高速离心沉降，移取适量上层清液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤并用四氢呋喃稀释一定倍数后，采用紫外分光度法测定芹菜素的平衡浓度，差减法计算聚合物对底物的吸附量Q。
API-MIP和NMIP对不同浓度的模板分子溶液的等温吸附结果如图4所示。
由图4可见，在不同浓度范围内，API-MIP对芹菜素的结合量均明显高于NMIP，表明组成相同的两种聚合物在空间结构上存在明显差异，NMIP对芹菜素的吸附主要为非特异性吸附，没有选择性。而API-MIP因含有与芹菜素空间结构匹配、官能团相互作用的孔穴，这种空穴对芹菜素分子具有“记忆”功能，因而选择性吸附能力强。两种聚合物的吸附量的差值主要源于这种空穴的特异性吸附。表明在本发明最佳制备条件下制备的芹菜素分子印迹聚合物对芹菜素具有很好的亲和性和吸附性能。
三、本发明芹菜素分子印迹聚合物的选择性实验
实验器材：日本岛津公司制造的UV-2450紫外可见分光光度计。
实验方法：选择与芹菜素具有相似结构或功能基团的化合物作为对照底物，在平衡结合实验条件下，对比分子印迹聚合物和非印迹聚合物对底物的吸附情况，采用静态分配系数KD(KD＝CP/CS，(mL·g-1)；CP表示聚合物结合的底物的浓度，即聚合物对底物的吸附量Q(μmol·g-1)；CS表示吸附平衡时溶液中底物的浓度(μmol·mL-1))来表征API-MIP和NMIP对API及对照底物的分子识别特性。
具体实验步骤如下：
选取了芹菜素、山奈酚和芦丁为对照底物，以四氢呋喃为溶剂分别配置浓度为200.0μg·mL-1三种底物的溶液。分别称取3等份50mg实例1制备的API-MIP和NMIP于5mL离心管中，分别移取3.0mL不同底物的四氢呋喃溶液。恒温吸附24h，高速离心沉降，移取适量上层清液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤并用四氢呋喃稀释一定倍数后，采用紫外分光度法测定芹菜素的平衡浓度，差减法计算聚合物对底物的吸附量Q。
API-MIP和NMIP对不同底物的静态分配系数KD，见表1
表1聚合物对不同底物的静态分配系数KD(mL·g-1)
由表1数据可以看出，API-MIP对模板分子芹菜素的KD不但明显大于其它两种底物，而且也远大于NMIP，说明API-MIP对模板分子芹菜素产生了专一性印迹识别位点，因而其对芹菜素具有显著的分子识别能力，同时也进一步表明API-MIP的特异选择吸附性能不仅依赖与官能团互补的功能基，还有结构互补的三维空穴。