一种新型的树枝状聚合物基因载体的制备和用途.pdf

1、10申请公布号CN104059231A43申请公布日20140924CN104059231A21申请号201310092038122申请日20130321C08G81/00200601C08G83/00200601C08G65/48200601A61K47/34200601A61K48/00200601A61K49/00200601C12N15/8720060171申请人韩冰地址130021吉林省长春市朝阳区富锦路1266号72发明人韩冰高扬54发明名称一种新型的树枝状聚合物基因载体的制备和用途57摘要一种新型的树枝状聚合物基因载体的制备和用途。本发明公开了以聚乙二醇为核心，以伯氨基为表面，含

2、有叔氨基和仲氨基的树枝状聚酰胺胺高分子聚合物以及其制备方法和其作为基因载体的用途。该树枝状高分子聚合物作为基因载体，可以高效的转染基因或是用于基因治疗，从而用于治疗、诊断、预防各种疾病。该基因载体比其他的含有聚乙二醇或是聚酰胺胺的基因载体在转运基因治疗疾病时的效果更佳。51INTCL权利要求书6页说明书9页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书6页说明书9页附图1页10申请公布号CN104059231ACN104059231A1/6页21一种如下式所示的结构，其结构如下。权利要求书CN104059231A2/6页32权利要求1的树枝状聚合物，其中该树枝状聚合物中的聚

3、乙二醇分子量为100200000，N1500之间的整数，优选N1300之间的整数。3如权利要求1的聚合物的制备方法，其特征在于1）将以SS为核心以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物A分解为带有SH健的活性半个以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物B；2）得到的带有SH健的活性半个以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物与带有活性基团的聚乙二醇C（OPSSPEGOPSS）反应得到以聚乙二醇为核心的羟基为表面的树枝状聚合物D；3）BOCGABAOHE与D反应得到以NHBOC为表面的化合物；4）上步所得化合物催化反应得到以伯氨基为表面的以聚乙二醇为核心的含有叔氨基和仲氨基的聚酰胺胺树枝状聚合物基因载体F；化合物

4、A；权利要求书CN104059231A3/6页4化合物B；化合物C；权利要求书CN104059231A4/6页5化合物D；权利要求书CN104059231A5/6页6化合物E；化合物F。4权利要求3的方法，其中所述化学步骤14选用溶剂选自苯、甲苯、吡啶、四氢呋权利要求书CN104059231A6/6页7喃、三氟乙酸、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺中的一种或多种。5权利要求1的化合物可以制备成适于基因给药的载体。6权利要求5所述基因给药的载体为可携带各种基因或同时携带各种基因。7权利要求1的化合物的用途，用途为用于治疗，诊断及预防的基因载体。权利要

5、求书CN104059231A1/9页8一种新型的树枝状聚合物基因载体的制备和用途技术领域0001本发明公开了以聚乙二醇为核心，以伯氨基为表面，含有叔氨基和仲氨基的树枝状聚酰胺胺高分子聚合物以及其制备方法和其作为基因载体的用途。背景技术0002在未来的临床治疗中，个性化的基因治疗取代化学药物治疗疾病已经成为科学界的共识，目前最大的障碍如何高效地把外源的基因导入到靶细胞中，或是相应的环境中，使之能纠正或补偿基因缺陷或是异常引起的疾病，简单地说就是如何把外源基因或是遗传信息通过基因转移技术将其插入到受体细胞中。那么核心问题落到基因载体上。0003目前基因载体技术日益发展，主要分为病毒载体和非病毒载体

6、。由于机体免疫问题和宿主整合风险等问题，病毒载体基本不会作为未来临床治疗的首选。非病毒载体的开发是科学家目前工作的重点领域。重点即是高转染率和低毒性。0004本专利所开发的基因载体为以聚乙二醇为核心，并以伯氨基为表面，以仲氨基和叔氨基为“树枝”的树枝状聚酰胺胺高分子聚合物。本专利同时公开了其制备方法和用途。该树枝状高分子聚合物作为基因载体，可以高效的转染基因，与含有聚乙二醇而不含有氨基的树枝状高分子或是含有氨基而不含有聚乙二醇的树枝状高分子相比较，其特点为大大增强了其在体内的通过性能和安全性，从而大幅提高了转染效率。0005发明内容0006本发明的内容如下本发明公开了下式所示的式所示的结构，其

7、结构如下说明书CN104059231A2/9页90007其中该树枝状聚合物中的聚乙二醇分子量为100200000，N1500之间的整数，优选N1300之间的整数。0008制备方法特征在于说明书CN104059231A3/9页101）将以SS为核心以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物A分解为带有SH健的活性半个以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物B；2）得到的带有SH健的活性半个以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物与带有活性基团的聚乙二醇C（OPSSPEGOPSS）反应得到以聚乙二醇为核心的羟基为表面的树枝状聚合物D；3）BOCGABAOHE与D反应得到以NHBOC为表面的化合物。00094）上步所得

8、化合物催化反应得到以伯氨基为表面的以聚乙二醇为核心的含有叔氨基和仲氨基的聚酰胺胺树枝状聚合物基因载体F；化合物A；说明书CN104059231A104/9页11化合物B；化合物C；说明书CN104059231A115/9页12化合物D；说明书CN104059231A126/9页13化合物E；说明书CN104059231A137/9页14化合物F0010其中所述化学步骤14选用溶剂选自苯、甲苯、吡啶、四氢呋喃、三氟乙酸、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺中的一种或多说明书CN104059231A148/9页15种。0011终产物可以制备成适于基因给药的

9、载体。所述基因给药的载体为可携带各种基因或同时携带各种基因。用途为用于治疗，诊断及预防的基因载体。0012本发明的制备方法具体如下将以SS为核心以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物320G在501000摩尔浓度的三2氯乙基磷酸酯的磷酸缓冲溶液（PH78）中反应130小时。分解为带有SH健的活性半个以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物。0013得到的带有SH健的活性半个以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物与带有活性基团的聚乙二醇（OPSSPEGOPSS）反应，常温过夜，得到以聚乙二醇为核心的羟基为表面的树枝状聚合物。0014BOCGABAOH05G20G与上步反应所得的化合物在EDC和DMAP催化下，

10、在DMF和DMSO的混合溶液中反应得到以NHBOC为表面的化合物。0015上步所得化合物在常温下，在TFADCM混合溶液中反应102000分钟，得到以伯氨基为表面的以聚乙二醇为核心的含有叔氨基和仲氨基的聚酰胺胺树枝状聚合物基因载体。0016将1005000UL的基因011MG/ML与102000UL的上步化合物溶液混合震荡既得载有基因的新型的以伯氨基为表面的，以聚乙二醇为核心的，含有叔氨基和仲氨基的聚酰胺胺树枝状聚合物基因载体。0017本发明得到的以伯氨基为表面的，以聚乙二醇为核心的，含有叔氨基和仲氨基的聚酰胺胺树枝状聚合物基因载体与含有聚乙二醇而不含有氨基的树枝状高分子或是含有氨基而不含有聚

11、乙二醇的树枝状高分子相比较，其特点为大大增强了其在体内的通过性能和安全性，从而大幅提高了转染效率。完全超越其他形式的基因载体。0018附图说明图1该基因载体的核磁共振图谱。具体实施方式0019下面具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不仅局限以下实施例。0020制备实施例如下实施例11）将以SS为核心以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物3G在100摩尔浓度的三2氯乙基磷酸酯的磷酸缓冲溶液（PH73）中反应两小时。分解为带有SH健的活性半个以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物。00212）得到的带有SH健的活性半个以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物与带有活性基团的聚乙二醇（OPSSPEGOPS

12、S）反应，常温过夜，得到以聚乙二醇为核心的羟基为表面的树枝状聚合物。00223）BOCGABAOH1G与上步反应所得的化合物在EDC和DMAP催化下，在DMF和DMSO的混合溶液中反应得到以NHBOC为表面的化合物。00234）上步所得化合物在常温下，在TFADCM为64溶液中反应10分钟，得到以伯氨说明书CN104059231A159/9页16基为表面的以聚乙二醇为核心的含有叔氨基和仲氨基的聚酰胺胺树枝状聚合物基因载体。00245）将1000UL的基因（IL21）02MG/ML与100UL的上步化合物溶液混合震荡既得载有基因（IL21）的新型的以伯氨基为表面的，以聚乙二醇为核心的，含有叔氨基

13、和仲氨基的聚酰胺胺树枝状聚合物基因载体。0025实施例21）将以SS为核心以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物5G在200摩尔浓度的三2氯乙基磷酸酯的磷酸缓冲溶液（PH74）中反应4小时。分解为带有SH健的活性半个以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物。00262）得到的带有SH健的活性半个以羟基为表面的聚酰胺胺树枝状聚合物与带有活性基团的聚乙二醇（OPSSPEGOPSS）反应，常温过夜，得到以聚乙二醇为核心的羟基为表面的树枝状聚合物。00273）BOCGABAOH1G与上步反应所得的化合物在EDC和DMAP催化下，在DMF和DMSO的混合溶液中反应得到以NHBOC为表面的化合物。00284）上步所

14、得化合物在常温下，在TFADCM为55溶液中反应20分钟，得到以伯氨基为表面的以聚乙二醇为核心的含有叔氨基和仲氨基的聚酰胺胺树枝状聚合物基因载体。00295）将500UL的基因（IL21）03MG/ML与80UL的上步化合物溶液混合震荡既得载有基因（IL21）的新型的以伯氨基为表面的，以聚乙二醇为核心的，含有叔氨基和仲氨基的聚酰胺胺树枝状聚合物基因载体。0030效果实验如下将实施例12制备的样品以及聚乙二醇为核心的带有羟基表面的树枝状高分子，PAMAM2代树枝状高分子携带IL21治疗H22荷瘤小鼠情况进行药效学比较。0031制备H22肝癌小鼠模型，按照传统方法，将H22细胞植入小鼠腋下，制备模

15、型后，分为5组，即空白组，实施例12制备的样品以及聚乙二醇为核心的带有羟基表面的树枝状高分子，PAMAM2代树枝状高分子携带IL21组，每组20只小鼠。0032将实施例12制备的样品以及聚乙二醇为核心的带有羟基表面的树枝状高分子，PAMAM2代树枝状高分子携带IL21。（携带等量IL21，每组含10ULIL21），分别瘤内注射各组小鼠体内，试验2周后，处死小鼠，取瘤用卡尺测量体积，结果如下。0033表1瘤大小比较表1肿瘤体积（单位CM2）组别瘤大小对照组1604218聚乙二醇为核心的带有羟基表面的树枝状高分子1082108PAMAM2代树枝状高分子998159实施例1584087实施例2546069直接注射IL21普通制剂1307129与对照组组比较P005，P001，与普通制剂组比较P005，P001。说明书CN104059231A161/1页17图1说明书附图CN104059231A17