一株异养硝化好氧反硝化节杆菌及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710480489.0 (22)申请日 2017.06.22 (83)生物保藏信息 CGMCC NO.14012 2017.04.11 (71)申请人 温州大学 地址 325035 浙江省温州市茶山高教园区 (72)发明人 周茂洪赵肖为 (74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 代理人 张秋越 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/06(2006.01) C02F 101/3

2、8(2006.01) (54)发明名称 一株异养硝化-好氧反硝化节杆菌及其应用 (57)摘要 本发明公开了一株异养硝化-好氧反硝化节 杆菌及其在废水除氮中的应用。 该菌株为节杆菌 （Arthrobactersp.） WZUF01， 保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏中心 登记入册编号为CGMCCNO.14012。 该菌株用于去 除氮污水的氮， 有比较广的pH和温度适应范围以 及比较低的碳氮质量比， 且能耐受比较高的溶 氧。 该菌株能耐受高浓度的铵， 以之处理NH4+-N 浓度超过300mg/L的厌氧消化后养殖场废水， 处 理 结 果 符 合 畜 禽 养 殖 业 污 染

3、物 排 放 标 准 （GB18596-2001） ， 且最终产物为氮气。 该菌株具 有良好的聚集能力。 总之， 节杆菌WZUF01在实际 废水的氮去除中具有很大的应用潜力。 权利要求书1页 说明书14页 序列表1页 附图4页 CN 107245463 A 2017.10.13 CN 107245463 A 1.一株异养硝化-好氧反硝化的节杆菌， 其特征在于， 该菌株为节杆菌 （Arthrobactersp. ） WZUF01， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏中心登记入册编号为 CGMCC NO.14012。 2.权利要求1所述的异养硝化-好氧反硝化的节杆菌的应用， 其

4、特征在于， 所述节杆菌 WZUF01用于去除氮污水的氮： 将节杆菌WZUF01接种于氮污水中以除去氮， 所述氮污水为含 有NH4+、 NO3-、 NO2-其中之一或其组合的污水。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述节杆菌WZUF01用于去除氮污水的氮的 方法， 包括如下步骤： 1） 保藏菌株节杆菌WZUF01接种于活化培养基中， 培养， 离心， 得菌体， 菌体用无菌水洗 涤后制成OD600为0.91.0的菌悬液； 2） 将步骤1） 所得菌悬液接种于氮污水中培养以除氮； 其中， 所述氮污水为含有NH4+、 NO3-和NO2-的一种或其组合的污水。 4.根据权利要求3所述的应用，

5、其特征在于， 步骤1） 所述活化培养基组成为： 蛋白胨 10g、 酵母粉 5g、 NaCl 5g、 H2O 1000 mL、 pH 7.07.2； 步骤1） 的培养时间为1014h， 温度为2530， 在转速150160 r/min下培养。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 步骤2） 为将步骤1） 所得菌悬液接种于氮污 水中， 并加入碳源， 碳源中所含的碳与氮污水中所含的氮的质量比为4:110:1。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述碳源为柠檬酸钠、 醋酸钠、 乳酸钠或丁 二酸钠的其中一种或其任意组合。 7.权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤2） 中去除氮污

6、水的氮的培养温度为1540 。 8.权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤2） 中去除氮污水的氮的培养温度为2035 。 9.权利要求37任一项所述的应用， 其特征在于， 步骤 （2） 中将步骤1） 所得菌悬液接种 于氮污水中， 调节pH59。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107245463 A 2 一株异养硝化-好氧反硝化节杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明属于环境微生物技术领域， 具体涉及一株异养硝化-好氧反硝化节杆菌以 及其在去除污水的氮中的应用。 背景技术 0002 氮素给环境造成的污染问题近年来日益突出， 其危害性也日益被人们认识和重 视。 如氨氮、 硝酸盐氮和亚硝酸

7、盐氮有可能转化为致癌、 致突变和致畸的亚硝胺； 又如氮素 流入水体造成水体富营养化， 引起水质恶化以至湖泊退化。 生物脱氮具有处理效果好、 处理 过程稳定可靠、 操作管理方便等的优点而得到广泛应用。 传统的生物脱氮由自养硝化菌的 硝化作用和厌氧反硝化菌的反硝化作用完成。 0003 20世纪80年代， Robertson和Kuenen在除硫和反硝化处理系统中分离出 Thiosphaera pantotropha(现更名为脱氮副球菌Paracoccus denitrifications)， 它能够 同时利用硝酸盐和氧作为终端电子受体呼吸， 他们称之为好氧反硝化。 经过30多年国内外 学者的大量研究

8、， 现已肯定了好氧反硝化菌的存在， 且大多数好氧反硝化菌表现异氧硝化 的特性。 与自养型硝化菌比较,异养硝化菌的生长速率快,细胞产率高， 需要的溶解氧浓度 低,能耐受酸性环境且活性高， 且能够代谢各种形态的氮化合物,同时提高COD的去除率。 好 氧反硝化和异养硝化的发现打破了传统的生物脱氮理论， 使得同步硝化和反硝化成为可 能， 不仅可以降低运行成本,减少工艺上繁琐的操作,还可以扩大自养硝化菌所不能处理的 水质范围， 为废水的生物除氮提供了新思路。 0004 国内外许多学者从不同生态环境中分离出许多异养硝化-好氧反硝化菌， 研究了 其除氮特性和应用潜力。 其中具有低排放NO、 N2O能力的异养

9、硝化-好氧反硝化菌被认为是 是否具有实际应用潜力的首要问题。 大多数好氧反硝化菌， 反硝化的最后两步即NON2O N2对氧气是敏感的， 因此较大量的NO和N2O会在好氧硝酸盐/亚硝酸盐还原阶段被释放出来。 当然， 也有分离获得低排放NO、 N2O能力的异养硝化-好氧反硝化菌的报道。 如Maosheng Zheng等从处理含氮高达200mg/L的垃圾渗滤液的实验室规模曝气生物滤池中分离到1株在 好氧反硝化阶段排放低量的NO和N2O的Pseudomonas stutzeri PCN-1， 在合成废水中， 可以 硝酸盐、 亚硝酸盐、 N2O为良好的反硝化作用底物， 三者的平均脱氮速率分别为11.66

10、mg/L/ h、 12.80mg/L/h和9.67mg/L/h； 以硝酸盐为底物进行好氧反硝化的NO和N2O积累分别低于 0.003和0.33； 以亚硝酸盐为底物进行好氧反硝化的NO和N2O积累分别低于0.006和 0.29； 进一步的研究发现反硝化基因nirS、 cnorB和nosZ的协同表达引起了低NO和N2O排 放量(Maosheng Zheng,et al,Bioresource Technology,2014,162:80-88)。 再如Zhuang Shi等从海底污泥中分离获得的异养硝化-好氧反硝化Paracoccus versutus LYM， 可在有 氧条件下将超过95的硝态氮

11、(约400mg/L)经过亚硝酸盐再转变成气态脱硝产物， 最大去 除率达33mg/L/h； 在以铵为唯一氮源时， 平均去除速率和去除率分别为11.4mg/L/h和 75.4， 其他氮化合物如羟胺、 亚硝酸盐、 硝酸盐仅有少量积累， 其最大积累量分别为 0.045mg/L、 0.048mg/L和4mg/L； 好氧反硝化阶段中N2为主要产物， 没有检测到任何作为温 说明书 1/14 页 3 CN 107245463 A 3 室气体和臭氧层消耗物的氮氧化物的存在(Zhuang Shi,et al,Bioresource Technology, 2013,148:144-148)。 0005 至今为止，

12、 异养硝化-好氧反硝化主要还停留在实验室探索阶段， 用于废水氮处理 实践的报道不多。 鉴于不同生态环境获得的异氧硝化-好氧反硝化菌， 其生理生态特性各 异， 除氮特性和除氮能力也不同， 寻找除氮能力强、 低排放NO、 N2O的优良的异氧硝化-好氧 反硝化菌种质资源仍然为异氧硝化-好氧反硝化最终应用于废水氮处理实践的重要环节。 发明内容 0006 为了解决上述技术问题， 本发明提供一株异养硝化-好氧反硝化菌， 其特点为该菌 株为采用常规分离方法从采自浙江温州东片污水处理厂的活性污泥中分离获得， 经 16SrDNA序列测定并将测序结果通过GenBank Blast进行比对分析， 属于Arthrob

13、acter属， 与尿酸氧化节杆菌(Arthrobacter uratoxydans)的同源性为99.28， 编为Arthrobacter sp.WZUF01。 0007 本发明提供的一株异养硝化-好氧反硝化节杆菌， 该菌株为节杆菌(Arthrobacter sp.)WZUF01， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏中心登记入册 编号为CGMCC NO.14012。 0008 本发明还提供上述的节杆菌的应用， 所述节杆菌WZUF01用于去除氮污水的氮： 将 节杆菌WZUF01接种于氮污水中以除去氮。 0009 所述节杆菌WZUF01用于去除氮污水的氮的方法， 包括如下步骤：

14、 0010 1)保藏菌株节杆菌WZUF01接种于活化培养基中， 培养， 离心， 得菌体， 菌体用无菌 水洗涤后制成OD600为0.91.0的菌悬液； 0011 2)将步骤1)所得菌悬液接种于氮污水中培养以除氮； 0012 其中， 所述氮污水为含有NH4+、 NO3-和NO2-的一种或其组合的污水。 0013 优选地， 步骤1)所述活化培养基组成为： 蛋白胨10g、 酵母粉5g、 NaCl 5g、 H2O 1000ml、 pH 7.07.2； 0014 步骤1)的培养时间为1014h， 温度为2530， 在转速150160r/min下培养。 0015 优选地， 步骤2)为将步骤1)所得菌悬液接种

15、于氮污水中， 并加入碳源， 碳源中所含 的碳与氮污水中所含的氮的质量比为4:110:1。 0016 优选地， 所述碳源为柠檬酸钠、 乳酸钠、 醋酸钠、 丁二酸钠的其中一种或其任意组 合。 0017 优选地， 步骤2)中去除氮污水的氮的培养温度为1540， 优选为2035， 以 NaOH或HCl调pH为59。 0018 优选地， 步骤2)中， 将步骤1)所得菌悬液接种于氮污水中在转速150200r/min下 培养以除氮。 0019 本发明能够达到以下技术效果： 0020 1、 本发明提供的异养硝化-好氧反硝化的尿酸氧化节杆菌(Arthrobacter uratoxydans)WZUF01为国内首

16、次报道。 0021 2、 本发明提供的异养硝化-好氧反硝化节杆菌(Arthrobacter sp.)WZUF01去除氮 污水的氮的适宜的碳氮质量比、 温度和pH分别为410:1、 2035和59， 有比较广的pH 说明书 2/14 页 4 CN 107245463 A 4 和温度适应范围以及比较低的碳氮质量比， 且能耐受比较高的溶氧。 。 0022 3、 本发明提供的异养硝化-好氧反硝化节杆菌(Arthrobacter sp.)WZUF01能耐受 高浓度的铵， 在适宜条件下， 其对NH4+-N浓度达600mg/L的人工氮污水的NH4+-N去除率和去 除速率分别为95.78和24.10mg/L/

17、h。 以之处理NH4+-N浓度超过300mg/L的厌氧消化后养殖 场废水， 处理结果符合畜禽养殖业污染物排放标准(GB18596-2001)， 且最终产物为氮气。 0023 4、 本发明提供的异养硝化-好氧反硝化节杆菌(Arthrobacter sp.)WZUF01硝化铵 的终产物为氮气， 不形成任何氮氧化物温室气体。 0024 5、 本发明提供的异养硝化-好氧反硝化节杆菌(Arthrobacter sp.)WZUF01具有良 好的聚集能力， 其聚集能力等级为34之间， 表面疏水性为59.46。 0025 总之， 本发明提供的异养硝化-好氧反硝化节杆菌(Arthrobacter sp.)WZU

18、F01在 实际废水的氮去除中具有很大的应用潜力。 附图说明 0026 图1是Arthrobacter sp.WZUF01在硝酸盐培养基中生长和除氮进程。 0027 图2是Arthrobacter sp.WZUF01在亚硝酸盐培养基中生长和除氮进程。 0028 图3是Arthrobacter sp.WZUF01在铵培养基中生长和除氮进程。 0029 图4是Arthrobacter sp.WZUF01的个体形态。 0030 图5是采用MEGA4.1软件， 邻位连接法显示菌株WZUF01与相关种的16S rDNA序列系 统发育树， 进行1000次的相似度重复计算， 图中发育树节点只显示Bootstr

19、ap值大于50数 值。 0031 图6是Arthrobacter sp.WZUF01除添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水TN、 NH4+-N 和生长的进程。 图中(1)： 对照组； (2)： 处理组。 0032 图7是Arthrobacter sp.WZUF01除添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水NO3-N、 NO2-N和COD进程。 图中(1)： 对照组； (2)： 处理组。 0033 菌株保藏 0034 本发明的Arthrobacter sp.WZUF01， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心， 保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏中心登记入册编号为 CGMCC

20、 NO.14012， 保藏起始日期为2017年4月11日。 具体实施方式 0035 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明， 以使本领域的技术人员可以 更好地理解本发明并能予以实施， 但所举实施例不作为对本发明的限定。 0036 本发明提供一株异养硝化-好氧反硝化菌， 其特点为该菌株为采用富集培养、 初 筛、 复筛等过程从采自浙江温州东片污水处理厂曝气池的活性污泥中分离获得， 经16SrDNA 序列测定并将测序结果通过GenBank Blast进行比对分析， 属于Arthrobacter sp.， 与尿酸 氧化节杆菌(Arthrobacter uratoxydans)的同源性为99.28

21、， 编为Arthrobacter sp.WZUF01 0037 实施例一： 异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01的分离 0038 (1)初筛 说明书 3/14 页 5 CN 107245463 A 5 0039 取采自温州东片污水处理厂曝气池的活性污泥5ml接种于装有100ml富集培养基 (丁二酸钠5g、 NaNO3 1g、 KH2PO 4 1g、 K2HPO4 1g、 (NH4)2SO4 0.25g、 MgSO47H2O 0.2g、 酵母 粉1g、 H2O 1000ml、 pH 7.07.2)的250ml锥形瓶中， 在25、 150rpm下振荡培养3天； 取10ml 富集培养液转接到新鲜的

22、富集培养基中在相同条件下培养， 如此重复5次； 取富集培养液经 适当稀释后涂布接种于溴百里酚蓝(Bromothymol Blue)平板(丁二酸钠5g、 NaNO3 1g、 KH2PO 4 1g、 K2HPO4 1g、 MgSO47H2O 1g、 CaCl22H2O 0.2g、 FeSO47H2O 0.05g、 天冬酰胺1g、 溴百 里酚蓝1ml(用1乙醇配制)、 琼脂18g、 H2O 1000ml、 pH 7.07.2)上， 在25下培养2-3天， 挑选具有蓝色光环的单菌落划线转接溴百里酚蓝(Bromothymol Blue)平板在相同条件下 培养， 直至经镜检为纯培养物后转接LB斜面培养后在

23、4下保藏。 初筛共获得20株纯培养 物。 0040 (2)复筛 0041 取初筛获得的20株纯培养物的斜面保藏菌分别接种于装有100ml LB培养基(蛋白 胨10g、 酵母粉5g、 NaCL 5g、 H2O 1000ml、 pH 7.0-7.2)的250ml锥形瓶中， 在25、 150rpm下 培养12h， 在5000rpm下离心15min后收集菌体， 用无菌蒸馏水洗涤3次后配制成OD6000.9 1.0的菌悬液， 每株纯培养物的菌悬液均各取10ml分别接种于装有200ml硝酸盐培养基、 亚 硝酸盐培养基和铵培养基的500ml锥形瓶中， 在25、 160r/min下振荡培养。 培养基的基本 组

24、成为： 丁二酸钠5g、 KH2PO 4 1g、 K2HPO4 1g、 MgSO47H2O 1g、 CaCl22H2O 0.2g、 FeSO4 7H2O 0.05g、 H2O 1000ml、 pH 7.07.2， 硝酸盐培养基加入NaNO30.91g/L(以硝酸盐为基质 的反硝化作用)， 亚硝酸盐培养基加入NaNO2 0.73g/L(以亚硝酸盐为基质的反硝化作用)， 铵培养基加入NH4CL 0.57g/L(以氯化铵为基质的硝化作用)， 硝酸盐培养基、 亚硝酸盐培养 基和铵培养基中氮均为150mg/L， C和N的质量比均为10:1。 定时取样测定生物量以及硝酸 盐、 亚硝酸盐、 铵、 羟胺、 蛋白

25、和丁二酸的浓度变化。 0042 依20株初筛获得的纯培养物分别在硝酸盐培养基、 亚硝酸盐培养基中氧化NO3-、 NO2-和中间产物类型和浓度变化确定其好氧反硝化性， 在铵培养基中氧化NH4+、 中间产物的 类型和浓度变化以及琥珀酸的浓度变化确定其异养硝化性， 结果筛选到5株NO3-、 NO2-、 NH4+ 去除率均大于80的异养硝化-好氧反硝化菌。 其中生物量测定OD600， NO3-N、 NO2-N和NH4+- N的测定分别采用酚二磺酸法分光光度法、 N-(1-萘基)-乙二胺光度法和纳氏试剂比色法， 蛋白测定采用Folin-酚法， 羟胺测定采用其与过量的8-羟基喹啉形成稳定的5,8-喹啉醌-

26、 5-(8-羟基-5-喹啉酰亚胺)的定量分光光度法(Frear DS,Anal.Chem.,1955,27:1664- 1665)， 琥珀酸盐测定采用KSUCC琥珀酸测定试剂盒(Michal G H,Anal.Chem.,1976,279: 137-138)， 0043 将筛选到的5株异养硝化-好氧反硝化菌进行氮平衡试验， 方法为将5株异养硝化- 好氧反硝化菌分别接种于装有100ml LB培养基(蛋白胨10g、 酵母粉5g、 NaCL 5g、 H2O 1000ml、 pH 7.0-7.2)的250ml锥形瓶中， 在25、 150r/min下培养12h， 在5000rpm下离心 15min后收集

27、菌体， 用无菌蒸馏水洗涤3次后配制成OD6000.91.0的菌悬液， 每株异养硝 化-好氧反硝化菌的菌悬液均各取10ml分别接种于装有200ml硝酸盐培养基、 亚硝酸盐培养 基和铵培养基的500ml锥形瓶中， 然后用纯氧气通10min后用橡胶隔片密封锥形瓶， 在25、 150r/min下密封培养18h。 培养基的基本组成为： 丁二酸钠5g、 KH2PO4 1g、 K2HPO4 1g、 MgSO47H2O 1g、 CaCl22H2O 0.2g、 FeSO47H2O 0.05g、 H2O 1000ml、 pH 7.07.2， 硝酸盐 说明书 4/14 页 6 CN 107245463 A 6 培养

28、基加入NaNO3 0.91g/L(以硝酸盐为基质的反硝化作用)， 亚硝酸盐培养基加入NaNO2 0.73g/L(以亚硝酸盐为基质的反硝化作用)， 铵培养基加入NH4CL 0.57g/L(以氯化铵为基 质的硝化作用)， 硝酸盐培养基、 亚硝酸盐培养基和铵培养基中氮均为150mg/L， C和N的质量 比均为10:1。 分析培养前后培养基氮、 菌体氮和顶部空间氮气和氧气的变化， 以确定去除的 NO3-、 NO2-、 NH4+是否转变为顶部空间的氮化合物， 筛选最终产物为氮气的异养硝化-好氧反 硝化菌。 结果获得1株NO3-、 NO2-、 NH4+去除率均大于90、 终产物为氮气的异养硝化-好氧反 硝

29、化菌， 编为WZUF01。 其中密封培养的顶部气体中的氧气和氮气含量采用GC-14B气相色谱 仪测定， 菌体氮采用微量凯氏定氮法测定。 0044 图1、 图2和图3分别为复筛过程中菌株WZUF01在硝酸盐培养基、 亚硝酸盐培养基和 铵培养基中生长和氮浓度变化的实验结果， 表1和表2为菌株WZUF01氮平衡试验结果。 0045 表1菌株WZUF01密闭培养18h的氮平衡试验结果(mg/L) 0046 0047 表2菌株WZUF01密闭培养18h顶部空间氮气和氧气变化() 0048 0049 结合图1可看出， 菌株WZUF01在硝酸盐培养基中培养18h后NO3-N去除率达 97.57， NO3-N

30、去除速率为8.21mg/L/h， 且主要发生在对数期， 与生长是同步的； 亚硝酸盐 从6h开始积累， 12h达到最大(21.892.15mg/L)， 至24h降为零； 整个过程没有检测到铵、 羟 胺和蛋白； 结合表1的氮平衡分析表明， 培养18h后培养基和菌体总氮丧失54.17， 结合表2 的的密闭培养18h顶部空间氮气和氧气变化， 表明硝酸盐被菌株WZUF01好氧反硝化为亚硝 酸盐直至氮气。 0050 结合图2可知， 菌株WZUF01在亚硝酸盐培养基中的情况与在硝酸盐培养基中相似， 亚硝酸盐去除主要发生在对数期， 与生长是同步的， 整个过程没有检测到铵、 羟胺、 蛋白和 说明书 5/14 页

31、 7 CN 107245463 A 7 硝酸盐； 培养18h后NO2-N降至4.350.55mg/L， NO2-N去除速率和去除率分别为8.04mg/L/ h和97.08， 结合表1和表2的氮平衡分析可知， 其中52.11氮被转化为顶部空间的氮气。 0051 结合图3看出， 菌株WZUF01在铵培养基中氧化铵形成羟胺、 亚硝酸盐和硝酸盐， 同 时随着细菌的生长丁二酸浓度逐渐降低， 表明菌株WZUF01的异养性； 18h后NH4+-N降至 2.97mg/L， NH4+-N的去除率和去除速率分别为98.03和8.22mg/L。 硝化产物羟胺、 亚硝酸盐 和硝酸盐分别在3h、 6h和6h开始出现，

32、至24h均降为零， 表明发生异养硝化-好氧反硝化； 结 合表1和表2的氮平衡分析， 表明铵除了用于菌体增加外， 其余46.46被异养硝化-好氧反 硝化为顶部空间的氮气。 0052 为了更进一步地证明菌株WZUF01是进行好氧反硝化， 通过改变摇床转速以改变溶 氧的方法检测溶氧对菌株WZUF01反硝化的影响， 当摇床转速分别为0、 50、 100和150和200r/ min时， 其相应的溶氧水平为2.35、 3.55、 4.94、 6.18和7.35mg/L， 溶氧水平用Orion-3-star 310D-01氧电极测量。 菌株WZUF01在与前述条件相同的亚硝酸盐培养基中培养时， NO2-N去

33、 除率分别为10.62、 21.89、 64.2、 98.74、 和97.45， 表明菌株WZUF反硝化在好氧条 件下进行且能容忍比较高的溶氧水平。 0053 为了实现获得的异养硝化-好氧反硝化菌具有实际应用潜力， 测定了菌株WZUF01 的聚集能力和表面疏水性。 经测定， 菌株WZUF01的聚集能力等级为3-4之间， 表面疏水性为 59.46。 0054 聚集能力的测定方法： 在硝酸盐培养基、 亚硝酸盐培养基或铵培养基中25、 150r/min下培养24h的培养液， 经5000r/min 15min离心后用蒸馏水洗涤菌体3次， 用蒸馏水 配成OD600为1.5的菌悬液， 然后转移到石英管中涡

34、旋0.5min、 轻轻滚动1min， 然后静置目测 聚集能力； 聚集能力等级判断依据为： 0， 悬浮液没有聚集； 1， 浑浊液中有小的均匀聚集体； 2， 浑浊液中有容易可见的聚集体； 3， 清晰可见的聚集， 出现清晰的上清液； 4， 几乎瞬间出现 大的絮状聚集体， 留下清晰的上清液(Richard A H,Appl.Environ.Microbiol.,2002,68: 3644-3650)。 0055 表面疏水性的测定方法： 在硝酸盐培养基、 亚硝酸盐培养基或铵培养基中25、 150r/min下培养24h的培养液， 经5000r/min 15min离心后用蒸馏水洗涤菌体3次， 用pH 7.4

35、 的磷酸缓冲液配成OD600 1.0的菌悬液， 分别取1.2ml菌悬液和0.8ml菌悬液(加0.4ml十六 烷)转移至用5ml酸洗涤过的玻璃试管中涡旋2min， 两相分离15min后测定低水相的OD600， 表 面疏水性依十六烷处理后的细菌悬液对原细菌悬液OD600的百分比减少来计算(Rosenberg, FEMS Microbiol,1980,9:29-33)。 0056 实施例二： 异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01的鉴定 0057 菌株WZUF01幼龄细胞为不规则杆状， 常呈V型排列， 在生长过程中杆状断裂为小球 状， 具明显杆、 球周期变化， G+(见图4)； 好氧， 接触酶阳性。

36、 0058 以细菌基因组DNA为模板扩增16SrDNA， 扩增采用一对通用引物： 上游引物(P1)： 5 -AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3 ， 下游引物(P6)： 5 -TACGGCTACCTTGTTACGACTTCAC CCC-3 ， PCR、 PCR产物的纯化和测序由中国工业微生物菌种保藏管理中心完成， 测序结果通 过GenBank Blast进行比对分析。 0059 WZUF01菌株的16SrDNA由1594bp碱基组成， 如SEQ ID NO.1所示； 通过GenBank Blast进行比对分析， 与GenBank中的节杆菌属(Arthrobacter)

37、的16SrDNA序列具有很高同 说明书 6/14 页 8 CN 107245463 A 8 源性， 与尿酸氧化节杆菌(Arthrobacter uratoxydans)的同源性为99.28。 采用MEGA4.1 软件， 邻位连接法显示异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01与相关种的16S rDNA序列系统 发育树见图5。 0060 节杆菌(Arthrobacter sp.)WZUF01， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心， 其保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.14012， 保藏起始日期为2017年4月11 日。 0061 实施例三： 异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF

38、01除氮特性 0062 保藏的异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01(1.5mL冷冻管融化菌液)接种于装有 100ml LB培养基(蛋白胨10g、 酵母粉5g、 NaCL 5g、 H2O 1000ml)的250ml锥形瓶中， 在25、 150r/min下培养12h， 在5000r/min下离心15min后收集菌体， 用无菌蒸馏水洗涤3次后配制 成OD6000.91.0菌悬液。 0063 取5ml接种于装有100ml培养基的250ml锥形瓶中， 在一定温度和转速(基础温度和 转速分别为25、 150rpm)下振荡培养24h， 然后在5000r/min下离心10min得上清液， 对上清 液进行相关

39、测定分析。 0064 基本培养基的组成为： 丁二酸钠5g、 KH2PO4 1g、 K2HPO4 1g、 MgSO47H2O 1g、 CaCl22H2O 0.2g、 FeSO47H2O 0.05g、 H2O 1000ml、 pH 7.07.2， 分别加入NaNO3 0.91g/L (以硝酸盐为基质的好氧反硝化作用)和NH4CL 0.57g/L(以氯化铵为基质的异养硝化作用- 好氧反硝化作用)， 使培养基中氮均为150mg/L， C和N的质量比为10:1。 0065 NH4+-N(或NO3-N)的去除率/(培养前上清液NH4+-N(或NO3-N)浓度(mg/L)-培 养后上清液NH4+-N(或NO

40、3-N)浓度(mg/L)/培养前上清液NH4+-N(或NO3-N)浓度(mg/L)。 0066 主要研究碳源、 C/N、 温度、 pH、 转速对节杆菌WZUF01除氮的影响。 0067 1、 碳源的选择 0068 分别以表3中的不同碳源代替基本培养基中的丁二酸钠， 使C和N的质量比均为10: 1， 其实验结果如表3所示。 由表3看出， 最适宜的碳源为醋酸钠、 丁二酸钠和柠檬酸钠， 其次 为乳酸钠。 0069 表3碳源选择实验结果 说明书 7/14 页 9 CN 107245463 A 9 0070 0071 2、 碳氮质量比(C/N)的选择 0072 以醋酸钠代替基本培养基中的丁二酸钠， 碳氮

41、的质量比及实验结果如表4所示。 由 表4可知， 适宜的碳氮质量比为410:1， 表明异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01不需要较 高的碳氮质量比。 0073 表4碳氮质量比选择实验结果 0074 0075 0076 3、 培养温度的选择 0077 以醋酸钠代替基本培养基的丁二酸钠， 浓度为2.56g/L， 使C和N的质量比为5:1， 温 度的选择及实验结果如表5。 由表5看出， 最适宜的温度为20-35， 但15下仍有超过60 说明书 8/14 页 10 CN 107245463 A 10 的去除率， 表明异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01有很广的温度适应范围。 0078 表5培养温度选

42、择的实验结果 0079 0080 4、 pH的选择 0081 以醋酸钠代替基本培养基的丁二酸钠， 浓度为2.56g/L， 使C和N的质量比为5:1， 温 度25， 培养基的pH选择及实验结果如表6。 由表6可知， 适宜的pH范围为5-9， 表明异养硝 化-好氧反硝化节杆菌WZUF01有很宽的pH适应范围。 0082 表6 pH选择的实验结果 0083 0084 0085 5、 培养转速的选择 说明书 9/14 页 11 CN 107245463 A 11 0086 以醋酸钠代替基本培养基的丁二酸钠， 浓度为2.56g/L， 使C和N的质量比为5:1， 温 度25， 培养基的pH为7， 摇床转速

43、选择及实验结果如表7。 由表7看出， 适宜的转速为150- 200r/min， 表明异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01能耐受比较高的溶氧水平。 0087 表7培养转速选择的实验结果 0088 0089 实施例四： 最适条件下异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01除氨氮试验 0090 保藏的异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01(1.5mL冷冻管融化菌液)接种于装有 100ml LB培养基(蛋白胨10g、 酵母粉5g、 NaCL 5g、 H2O 1000ml)的250ml锥形瓶中， 在25、 150r/min下培养12h， 在5000r/min下离心15min后收集菌体， 用无菌蒸馏水洗涤3

44、次后配制 成OD6000.91.0菌悬液。 0091 取10ml菌悬液接种于装有200ml培养基的500ml锥形瓶中， 在25、 150r/min下振 荡培养， 定时取样测定生物量， 然后在5000r/min下离心10min后对上清液进行相关测定分 析， 结果如表8所示。 0092 培养基的组成： 醋酸钠、 NH4CL、 KH2PO 4 1g、 K2HPO4 1g、 MgSO47H2O 1g、 CaCl2 2H2O 0.2g、 FeSO47H2O 0.05g、 H2O 1000ml、 pH 7.07.2， 培养基中NH4+-N浓度分别为150、 300、 600、 800、 1000mg/L，

45、 C和N的质量比为5:1。 0093 由表8计算得知， 当NH4+-N浓度分别为150、 300、 600、 800和1000mg/L时， 异养硝化- 好氧反硝化节杆菌WZUF01对NH4+-N的去除率分别为96.20、 97.25、 95.78、 90.58和 73.09， 去除速率分别为8.07、 12.10、 24.10、 17.29和13.66mg/L/h， 即随NH4+-N浓度增加， 异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01对其去除速率随之提高， 但超过600mg/L后， 其去除速 率又开始下降， 表明过高浓度的NH4+-N对其表现出抑制效应； 这与异养硝化-好氧反硝化节 杆菌WZUF

46、01在不同NH4+-N浓度下的生物量变化是一致的， 且NH4+-N的去除与生长是同步的。 0094 由表8也可知， 当NH4+-N浓度小于600mg/L时， NO2-N几乎没积累(浓度0.1mg/L)， NH4+-N浓度超过600mg/L后NO2-N开始逐渐积累； 而NO3-N浓度无论NH4+-N的浓度多大， 要么 没积累要么浓度1mg/L。 说明书 10/14 页 12 CN 107245463 A 12 0095 0096 实施例五： 异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01除厌氧消化后养殖场废水氮试验 0097 保藏的异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01(1.5mL冷冻管融化菌液)接种于

47、装有 说明书 11/14 页 13 CN 107245463 A 13 100ml LB培养基(蛋白胨10g、 酵母粉5g、 NaCL 5g、 H2O 1000ml)的250ml锥形瓶中， 在25、 150r/min下培养12h， 在5000r/min下离心15min后收集菌体， 用无菌蒸馏水洗涤3次后配制 成OD6000.9-1.0菌悬液。 菌悬液按5体积比分别转接于装有200mL厌氧消化后养殖场废 水以及添加醋酸钠的200mL厌氧消化后养殖场废水的500mL锥形瓶中， 在25、 150r/min下 培养， 并分别以不接入菌悬液的原废水在相同条件下培养为对照， 定时取样测定生物量， 并 在8

48、000r/min下离心10min得上清液进行相关检测计算， 直至趋于稳定为止。 同时进行氮平 衡试验， 方法为菌悬液按5体积比分别转接于装有200mL厌氧消化后养殖场废水以及添加 醋酸钠的200mL厌氧消化后养殖场废水的500mL锥形瓶中， 然后用纯氧气通10min后用橡胶 隔片密封锥形瓶， 在25、 150r/min下密封培养， 分析培养前后培养基氮、 菌体氮和顶部空 间氮气和氧气的变化。 0098 原废水组成： TN(总氮)402.894.69mg/L、 NH4+-N 329.345.58mg/L、 NO3-N 35.191.54mg/L、 NO2-N 34.581.15mg/L、 COD

49、 378.425.87mg/L。 0099 TN测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(GB-11894-89)， COD测定采用重铬 酸钾法。 0100 表9为异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01除厌氧消化后养殖场废水氮的效果， 表 10为异养硝化-好氧反硝化节杆菌WZUF01除添加6.89g/L醋酸钠使醋酸钠所含碳与总氮的 质量比为5:1的厌氧消化后养殖场废水氮的效果， 图6和图7为节杆菌WZUF01除添加醋酸钠 的厌氧消化后养殖场废水氮的进程。 表9节杆菌WZUF01除厌氧消化后养殖场废水氮的结果 0101 0102 表10节杆菌WZUF01除添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水氮的结果 说明书 12/14 页 14 CN 107245463 A 14 0103 0104 对比表9和表10可以看出， 节杆菌WZUF01对添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水 的TN、 NO3-N、 NO2-N、 NH4+-N的去除效果显著高于未添加醋酸钠的原厌氧消化后养殖场废 水。 由表11的