LncRNA ENST000004245231及其基因在诊断和治疗药物中的应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710594595.1 (22)申请日 2017.07.19 (71)申请人 广州医科大学附属第五医院 地址 510000 广东省广州市黄埔区港湾路 621号 (72)发明人 周新科姚文霞罗远卫梁敏 (74)专利代理机构 广州三环专利商标代理有限 公司 44202 代理人 宋静娜郝传鑫 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/113(2010.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54

2、)发明名称 LncRNA ENST00000424523.1及其基因在诊 断和治疗药物中的应用 (57)摘要 本发明公开了LncRNAENST00000424523.1 及其基因在诊断和治疗药物中的应用， 属于生物 医药技术领域， LncRNAENST00000424523.1及其 基因在筛选或制备胃癌临床诊断或预后的芯片、 制 剂 或 试 剂 盒 中 的 应 用 ，L n c R N A ENST00000424523.1及其基因在筛选或制备胃癌 治疗药物中的应用， LncRNAENST00000424523.1 的基因序列号为LOC101927497。 本发明对胃癌的 临床诊断、 预后以及

3、治疗药物的制备具有促进作 用。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 107236817 A 2017.10.10 CN 107236817 A 1.LncRNA ENST00000424523.1及其基因在筛选或制备胃癌临床诊断或预后的芯片、 制 剂或试剂盒中的应用， LncRNA ENST00000424523.1的基因序列号为LOC101927497。 2.LncRNA ENST00000424523.1及其基因在筛选或制备胃癌治疗药物中的应用， LncRNA ENST00000424523.1的基因序列号为LOC101927497。 3.检测LncRNA ENST00

4、000424523.1的试剂在筛选或制备胃癌临床诊断或预后的芯片、 制剂或试剂盒中的应用。 4.一种胃癌临床诊断或预后的芯片、 制剂或试剂盒， 其特征在于： 包括测定LncRNA ENST00000424523.1转录量的特异性引物， 所述特异性引物包含如Seq ID NO.1和Seq ID NO.2所示的DNA序列。 5.LncRNA ENST00000424523.1促进剂在筛选或制备胃癌治疗药物中的应用。 6.如权利要求5所述的应用， 其特征在于： 所述LncRNA ENST00000424523.1促进剂包括 促进基因LOC101927497过表达的质粒， 所述质粒含有基因LOC101

5、927497的DNA序列。 7.一种胃癌的治疗药物， 其特征在于， 所述治疗药物包含LncRNAENST00000424523.1促 进剂。 8.如权利要求7所述的治疗药物， 其特征在于： 所述LncRNA ENST00000424523.1促进剂 包括促进基因LOC101927497过表达的质粒， 所述质粒含有基因LOC101927497的DNA序列。 9.如权利要求7或8所述的治疗药物， 其特征在于： 所述治疗药物还包含药学生上可接 受的载体。 10.一种基因LOC101927497的siRNA， 其特征在于： 所述siRNA为siRNA-1、 siRNA-2或 siRNA-3， 所述si

6、RNA-1由如Seq ID NO.3和Seq ID NO.4所示的RNA序列组成， 所述siRNA-2 由如Seq ID NO.5和Seq ID NO.6所示的RNA序列组成， 所述siRNA-3由如Seq ID NO.7和Seq ID NO.8所示的RNA序列组成。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107236817 A 2 LncRNA ENST00000424523.1及其基因在诊断和治疗药物中的 应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 尤其涉及LncRNA ENST00000424523.1及其基因在 诊断和治疗药物中的应用。 背景技术 0002 胃癌是世界上最常见的

7、消化系统恶性肿瘤之一， 统计显示70的胃癌患者属于发 展中国家； 其中， 将近半数的胃癌患者属于东亚亚国家， 特别是中国。 胃癌病因复杂， 其涉及 的因素有幽门螺杆菌感染、 饮食、 环境致癌物暴露和遗传易感性等； 环境致癌物被认为是导 致胃癌发生最重要的因素之一。 0003 N-亚硝基化合物(NOCs)是一类与胃癌发生相关的强致癌物质， 生活中主要来源于 各类腌制物、 烟熏物或由内源性形成。 N-甲基-N -硝基-N -亚硝基胍 (MNNG)作为N-亚硝基 化合物的一种， 是公认广泛存在环境中的化学诱变剂和致癌剂。 虽然目前人们已构建MNNG 诱导胃癌的动物模型和细胞模型， 使胃癌的研究取得一

8、定的进展， 但MNNG涉及的胃癌机制 仍需进一步明确。 0004 过去， 化学致癌物诱发胃癌的机制研究主要针对编码基因， 近年随着高通量测序 等生物技术的发展， 非编码RNA与化学致癌物诱发胃癌的关联逐渐受到人们的重视。 长链非 编码RNA(Long noncoding RNA， LncRNA)是一类长度大于200核苷酸的非编码RNA。 LncRNA是 一类重要的基因表达调控元件， 能在多种水平(表观遗传、 转录和转录后等)调控基因的表 达， 且与多种疾病密切相关， 如肿瘤的发生、 发展、 凋亡、 迁移和粘附等。 根据LncRNA在肿瘤 发生中的作用， 目前分为致癌作用的LncRNA和抑癌作用

9、的LncRNA。 0005 胃癌已成为当今社会的疾病难题， 早期的临床诊断和预后有利于胃癌的治疗， 同 时胃癌的治疗药物有待于进一步研发。 因此， 有必要将LncRNA与胃癌相结合， 为胃癌的诊 断、 预后以及治疗提供新的治疗思路。 发明内容 0006 本发明目的在于克服现有技术存在的不足， 而提供LncRNA ENST00000424523.1及 其基因在诊断和治疗药物中的应用。 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案为： LncRNA ENST00000424523.1及其基因在筛选或制备胃癌临床诊断或预后的芯片、 制剂或试剂盒中 的应用， LncRNA ENST00000424523.1

10、的基因序列号为LOC101927497。 0007 另外， 本发明还提供LncRNA ENST00000424523.1及其基因在筛选或制备胃癌治疗 药物中的应用， LncRNA ENST00000424523.1的基因序列号为 LOC101927497。 0008 另外， 本发明还提供检测LncRNA ENST00000424523.1的试剂在筛选或制备胃癌临 床诊断或预后的芯片、 制剂或试剂盒中的应用。 0009 另外， 本发明还提供一种胃癌临床诊断或预后的芯片、 制剂或试剂盒， 包括测定 LncRNA ENST00000424523.1转录量的特异性引物， 所述特异性引物包含如Seq I

11、D NO.1和 说明书 1/5 页 3 CN 107236817 A 3 Seq ID NO.2所示的DNA序列。 0010 本发明首先通过高通量测序RNA-Seq证实LncRNA ENST00000424523.1的基因 (LOC101927497)在胃癌细胞和阴性细胞中的转录存在差异， 并制备了检测LncRNA ENST00000424523.1的特异性引物， 可以用来作为胃癌的临床诊断和预后的标记物。 0011 另外， 本发明还提供LncRNA ENST00000424523.1促进剂在筛选或制备胃癌治疗药 物中的应用。 0012 作为上述技术方案的改进， 所述LncRNA ENST00

12、00042452 3.1促进剂包含促进基 因LOC101927497过表达的质粒， 所述质粒含有基因LOC101927497的 DNA序列。 0013 本发明构建基因LOC101927497过表达的质粒， 并设计合成出基因 LOC101927497 的siRNA， 实验发现： 在GES-1-T(恶性转化的人胃粘膜细胞) 和MKN-28(胃癌细胞)两种细胞 中， 上调表达LncRNA ENST00000424523 .1 能抑制胃癌细胞增殖， 下调表达LncRNA ENST00000424523.1能促进胃癌细胞增殖。 0014 另外 ， 本发明还提供一种胃 癌的 治疗药物 ， 所述治疗药物包含

13、LncRNA ENST00000424523.1促进剂。 0015 作为上述技术方案的改进， 所述LncRNA ENST00000424523.1促进剂包含促进基因 LOC101927497过表达的质粒， 所述质粒含有基因LOC101927497的 DNA序列。 0016 作为上述技术方案进一步地改进， 所述治疗药物还包含药学生上可接受的载体。 0017 在上述技术方案中，“药学上可接受的载体” 包括任何和所有生理上相容的溶剂、 分散介质、 包衣料、 抗细菌和抗真菌剂、 等渗和吸收延缓剂等。 药学上可接受的载体的实例 包括水、 盐水、 磷酸缓冲盐水、 右旋糖酐、 甘油、 乙醇等中的一个或多个以

14、及它们的组合。 在 很多情况下， 优选的是将等渗剂例如糖、 多元醇或氯化钠包括在组合物中。 药学上可接受的 载体还可包含少量的能提高抗体或抗体部分的货架期或有效性的辅助物质， 如湿润剂或乳 化剂、 防腐剂或缓冲液。 0018 另外， 本发明还提供一种基因LOC101927497的siRNA， 所述siRNA为 siRNA-1、 siRNA-2或siRNA-3， 所述siRNA-1由如Seq ID NO.3和Seq ID NO.4 所示的RNA序列组成， 所 述siRNA-2由如Seq ID NO.5和Seq ID NO.6所示的 RNA序列组成， 所述siRNA-3由如Seq ID NO.7和

15、Seq ID NO.8所示的RNA序列组成。 0019 本发明的有益效果在于： 本发明提供LncRNA ENST00000424523.1及其基因在诊断 和 治 疗 药 物 中 的 应 用 ， 本 发 明 首 先 通 过 高 通 量 测 序 R N A - S e q 证 实 L n c R N A ENST00000424523.1的基因(LOC101927497)在胃癌细胞和阴性细胞中的转录存在差异； 并 制备了检测LncRNA ENST00000424523.1的特异性引物， 可以应用于胃癌的临床诊断和预 后； RNA-Seq数据及qRT-PCR数据都显示： LncRNA ENST000

16、00 424523.1在恶性转化的胃粘 膜细胞GES-1-T和胃癌细胞(MKN-28、 MGC-803)中均表达下调， 上调表达LncRNA ENST00000424523.1 能抑制胃癌细胞增殖， 下调表达LncRNA ENST00000424523.1能促进胃 癌细胞增殖； 由此可见， LncRNA ENST00000424523.1及基因可应用于胃癌的临床诊断、 预后 和治疗。 附图说明 0020 图1为GES-1-T细胞和GES-1-N细胞的高通量RNA-Seq测序结果图； 图 1A显示两种 说明书 2/5 页 4 CN 107236817 A 4 细胞差异表达的LncRNA， 图1B

17、显示两种细胞差异表达的mRNA； 图中， 差异表达LncRNA和mRNA 用圆圈标出； 0021 图2为验证LncRNA的差异表达的统计图； 图2A显示GES-1-T细胞和 GES-1-N细胞中 LncRNA表达量， EN452050 .1为ENST00000452050 .1的缩写， EN435695 .1为 ENST00000435695.1的缩写， EN424523.1为ENST00000424523.1的缩写； 图2B显示GES-1细 胞、 MKN-28细胞和MGC-803 细胞中LncRNA ENST00000424523.1相对水平； 图中， *表示p 0.05， *表示 p0.0

18、1； 0022 图3显示上调LncRNA ENST00000424523.1的表达对胃癌细胞增殖的影响； 图3A显 示导入过表达载体pcDNA-LOC101927497的GES-1-T细胞和MKN-28 细胞中LncRNA ENST00000424523.1的相对表达量； 图3B显示导入过表达载体pcDNA-LOC101927497的GES- 1-T细胞和MKN-28细胞的增殖得到抑制； 图中， pcDNA-LncRNA为导入基因LOC101927497的 过表达载体， pcDNA3.1为阴性对照； 0023 图4显示显示下调LncRNA ENST00000424523.1的表达对胃癌细胞增殖

19、的影响； 图 4A显示转染siRNA的GES-1-T细胞和MKN-28细胞中LncRNA ENS T00000424523.1的相对表达 量； 图4B显示转染siRNA的GES-1-T细胞和 MKN-28细胞的增殖得到促进； 图中， siRNA为阴性 对照。 具体实施方式 0024 为更好地说明本发明的目的、 技术方案和优点， 下面将结合具体实施例、 附表和附 图对本发明作进一步说明。 0025 实施例1高通量RNA-Seq测序结果分析， MNNG处理的GES-1-T细胞会产生差异表达 的LncRNA 0026 方法： 以MNNG诱导的恶性转化人胃粘膜细胞GES-1-T(T： 转化)及DMSO

20、 处理的阴性 对照细胞GES-1-N(N： 正常)为实验对象， 通过高通量RNA-Seq 测序技术， 分析两种细胞中 LncRNA及mRNA的表达差异。 分析GES-1-T和 GES-1-N细胞中的LncRNA表达量， 以表达差异倍 数在2倍以上或0.5倍以下、 p0.05为标准确定差异表达的LncRNA， 以同样的标准确定差异 表达的mRNA。 0027 结果： 通过分析发现， GES-1-T细胞中检测出LncRNA 17626个， GES-1-N 细胞中检 测出LncRNA 17916个。 GES-1-T细胞中较GES-1-N细胞中具有表达差异的LncRNA有253个， 其 中表达上调的L

21、ncRNA有94个， 表达下调的 LncRNA有159个(如图1A所示)； 同时也发现， 两种 细胞中有表达差异的mRNA 共751个， 其中表达上调的mRNA有244个， 表达下调的mRNA有507 个(如图1B所示)。 如表1所示， 列出GES-1-T细胞中下调最明显的3个LncRNA。 0028 表1 说明书 3/5 页 5 CN 107236817 A 5 0029 0030 实施例2LncRNA ENST00000424523.1在GES-1-T细胞和胃癌细胞中低表达 0031 方法： 为了进一步寻找在MNNG诱导GES-1细胞恶转中可能发挥作用的 LncRNA， 我 们从具有表达差

22、异性的LncRNA中选取变化差异较显著的3个 LncRNA， 用qRT-PCR的方法在 GES-1-T细胞与GES-1-N细胞中检测其表达水平。 此外， 我们还通过qRT-PCR检测了胃癌细胞 MKN-28和MGC-803中LncRNA ENST00000424523.1的表达。 qRT-PCR所使用的LncRNA以及内参 GAPDH引物序列如表2所示， 表2中Forward为正向引物， Reverse为反向引物； LncRNA ENST00000424523.1的cDNA引物序列Forward-AATGCTTGGAATGTGGGAGC (如Seq ID NO.1所 示)， Reverse-G

23、GCAGCTTTCAGGGGTTTTA(如Seq ID NO.2 所示)。 0032 结果： 分析变化差异较显著的3个LncRNA， 从检测结果中我们发现LncRNA ENST00000424523.1， 其NCBI基因号为LOC101927497， 是一个未曾被研究的 LncRNA。 与GES- 1-N细胞相比， LncRNA ENST00000424523.1在GES-1-T中的表达明显下调(fold change 0.39747990.26， p0.05)(如图2A所示)； LncRNA ENST00000424523.1在MKN-28、 MGC-803 这两种胃癌细胞中同样表现为低表达

24、水平(如图2B所示)。 这些结果表明， LncRNA ENST00000424523.1 在MNNG诱导的恶转细胞GES-1-T和胃癌细胞株中均表达下调， 基因 LOC101927497有可能作为抑癌基因在MNNG诱导胃癌过程中发挥重要作用。 0033 表2 0034 0035 实施例3上调LncRNA ENST00000424523.1的表达抑制胃癌细胞的增殖 0036 方法： 为了探讨基因LOC101927497在MNNG诱导胃癌过程中的功能， 通过构建过表 说明书 4/5 页 6 CN 107236817 A 6 达载体pcDNA-LOC101927497， 研究基因LOC1019274

25、97在恶性转化胃癌细胞GES-1-T和胃癌 细胞系MKN28中的作用。 用pcDNA-LOC101927497 分别转染GES-1-T和MKN-28细胞， 48小时 后， 用qRT-PCR法检测LncRNA ENST00000424523.1的过表达效果， 并用CCK-8试剂盒检测过 表的LncRNA ENST00000424523.1对胃癌细胞增殖的影响。 0037 结果： 转染pcDNA-LOC101927497后， LncRNA ENST00000424523.1的表达水平在 GES-1-T和MKN-28细胞均有明显上调(如图3A所示) ； 其次 ， 过表达的LncRNA ENST000

26、00424523.1明显削弱GES-1-T细胞和MKN-28细胞的增殖(如图3B所示)。 该结果表明 上调LncRNA ENST00000424523.1的表达水平对胃癌细胞的增殖能力有明显抑制作用。 0038 实施例4下调LncRNA ENST00000424523.1的表达促进胃癌细胞的增殖 0039 方法： 用siRNA干扰LncRNA ENST00000424523.1的表达， 检测对GES-1-T 细胞和 MKN-28细胞增殖的情况。 合成了3条特异性siRNA： siRNA-1、 siRNA-2、 siRNA-3(如表3所示)， 用3条siRNA分别转染GES-1-T细胞和MKN-

27、28细胞， 48小时后， 用qRT-PCR检测LncRNA ENST00000424523.1的表达水平以验证 siRNA的干扰效果， 并进一步用CCK-8试剂盒检测下 调表达的LncRNA ENST00000424523.1对胃癌细胞增殖的影响。 0040 结果： 转染3条siRNA后， LncRNA ENST00000424523.1的表达水平在 GES-1-T细胞 和MKN-28细胞中均有明显下降(如图4A所示)； 敲低LncRNA ENST00000424523.1的表达后， GES-1-T和MKN-28细胞增殖能力显著增强， 且MKN-28细胞较为明显(如图4B所示)。 0041 表

28、3 0042 0043 最后所应当说明的是， 以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护 范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理 解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和 范围。 说明书 5/5 页 7 CN 107236817 A 7 序列表 广州医科大学附属第五医院 LncRNA ENST00000424523.1及其基因在诊断和治疗药物中的应用 2017.7.3 8 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 1 aatgcttgga atgtgggagc 20 2 2

29、0 DNA 人工序列 2 ggcagctttc aggggtttta 20 3 21 RNA 人工序列 3 ccuaggagau uucaguaaau u 21 4 21 RNA 人工序列 4 uuuacugaaa ucuccuaggu u 21 5 21 RNA 人工序列 5 gccugccacu uaccuuaaau u 21 6 21 序列表 1/2 页 8 CN 107236817 A 8 RNA 人工序列 6 uuuaagguaa guggcaggcu u 21 7 21 RNA 人工序列 7 ccugccacuu accuuaaauu u 21 8 21 RNA 人工序列 8 auuuaaggua aguggcaggu u 21 序列表 2/2 页 9 CN 107236817 A 9 图1 图2 说明书附图 1/3 页 10 CN 107236817 A 10 图3 说明书附图 2/3 页 11 CN 107236817 A 11 图4 说明书附图 3/3 页 12 CN 107236817 A 12