一种蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711468618.0 (22)申请日 2017.12.29 (71)申请人 天津市湖滨盘古基因科学发展有限 公司 地址 300300 天津市东丽区东丽湖景湖科 技园4号楼 (72)发明人 张耀洲吴玉乾冯建华李冬梅 张树军胖铁良陈玉皎王文雅 (51)Int.Cl. C12N 9/02(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C07K 16/40(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/574(2006.01) G01N

2、33/573(2006.01) G01N 21/31(2006.01) (54)发明名称 一种蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及 其应用 (57)摘要 本发明涉及一种蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1 突变蛋白及其应用， 通过将大量癌症患者作为研 究病例， 对病例进行基因检测并分析， 确定出人 的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1的突变蛋白， 根据该 人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白制备基 因芯片、 单克隆抗体和ELISA试剂盒， 为癌症的基 因诊断提供指引作用， 实现癌症的早诊断、 早发 现和相关治疗。 权利要求书1页 说明书11页 序列表5页 附图5页 CN 108192877 A 201

3、8.06.22 CN 108192877 A 1.一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白， 其特征在于， 其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 2.一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的编码基因， 其特征在于， 其核苷酸序 列如SEQ ID NO:2所示。 3.一种基因芯片， 其特征在于， 包括： 固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针； 所述 核苷酸探针根据所述人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的核苷酸序列， 与人的蛋氨酸 亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。 4.根据权利要求3所述的基因芯片， 其特征在于， 所述核苷酸探针为SEQ ID NO:

4、3所示 的碱基序列。 5.一种特异性识别人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的单克隆抗体， 其特征在 于， 其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。 6.一种用于检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒， 其特 征在于， 所述ELISA试剂盒包括： 包被有权利要求5所述单克隆抗体的ELISA酶标板、 酶标二 抗、 检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白、 样品稀释液、 包被缓冲液、 ELISA酶标板洗涤 液、 显色液和终止液。 7.根据权利要求6所述用于检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的 ELISA试剂盒， 其特征在于， 所述酶标二

5、抗为稀释的HRP辣根过氧化物酶标记的山羊抗人 IgG。 8.一种基于权利要求6或7所述ELISA试剂盒检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋 白的抗体的方法， 其特征在于， 包括： a、 使用所述包被缓冲液对权利要求5所述单克隆抗体进行稀释， 并将稀释后的所述单 克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中， 室温孵育； b、 使用所述样品稀释液将检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白稀释成不同浓度 梯度， 并将不同浓度梯度的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中， 室温孵育； c、 甩去各孔中的液体， 加入所述ELISA酶标板洗涤液， 洗涤并甩干； d、 加入所述酶

6、标二抗， 并室温孵育； e、 甩去各孔中的液体， 加入所述ELISA酶标板洗涤液， 洗涤并甩干； f、 加入所述显色液， 室温避光孵育， 并加入所述终止液终止反应； g、 在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。 9.根据权利要求8所述ELISA试剂盒检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗 体的方法， 其特征在于， 进一步包括： 空白对照实验。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108192877 A 2 一种蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种基因工程领域， 尤其涉及一种蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白 及其应用。 背景技术 000

7、2 蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1是目前发现的可在生物体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残 基氧化结构变化和功能损伤的主要抗氧化酶系统。 它不仅可以在细胞内发挥清除氧化因素 的作用， 还可以对已经发生蛋白质氧化进行有效修复， 增加它的水平和活性可以延长多种 生物的寿命。 0003 人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1发生突变会对人类健康造成影响， 研究发现， 在对 某些癌症(该癌症包括肺癌、 肝癌、 胰腺癌和白血病)患者的外周血进行基因测序的过程中， 均发现患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1发生了突变， 因此， 对人的蛋氨酸亚砜氧化酶 MICAL1突变的检测对判断人体是否患有癌症具有一定的指引作用。 发明内容

8、 0004 本发明目的在于提供一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用。 0005 本发明技术方案包括： 0006 第一方面， 提供一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白， 其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 0007 第二方面， 提供一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1的突变蛋白的编码基因， 其核 苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 0008 第三方面， 提供一种基因芯片， 包括： 固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针； 所述核苷酸探针根据所述人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的核苷酸序列， 与人的蛋 氨酸亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白的核苷酸序列的比对结

9、果确定。 0009 优选地， 所述核苷酸探针为SEQ ID NO:3所示的碱基序列。 0010 第四方面， 提供一种特异性识别人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的单克隆 抗体， 其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。 0011 第五方面， 提供一种用于检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的 ELISA试剂盒， 所述ELISA试剂盒包括： 包被有上述单克隆抗体的ELISA酶标板、 酶标二抗、 检 测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白、 样品稀释液、 包被缓冲液、 ELISA酶标板洗涤液、 显 色液和终止液。 0012 优选地， 所述酶标二抗为稀释的HRP辣根过氧

10、化物酶标记的山羊抗人IgG。 0013 第六方面， 提供一种基于上述任一所述ELISA试剂盒检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶 MICAL1突变蛋白的抗体的方法， 包括： 0014 a、 使用所述包被缓冲液对上述单克隆抗体进行稀释， 并将稀释后的所述单克隆抗 体加样至ELISA酶标板的孔中， 室温孵育； 说明书 1/11 页 3 CN 108192877 A 3 0015 b、 使用所述样品稀释液将检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白稀释成不同 浓度梯度， 并将不同浓度梯度的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白分别加样至ELISA酶标板的 孔中， 室温孵育； 0016 c、 甩去各孔中的液体， 加入所

11、述ELISA酶标板洗涤液， 洗涤并甩干； 0017 d、 加入所述酶标二抗， 并室温孵育； 0018 e、 甩去各孔中的液体， 加入所述ELISA酶标板洗涤液， 洗涤并甩干； 0019 f、 加入所述显色液， 室温避光孵育， 并加入所述终止液终止反应； 0020 g、 在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。 0021 优选地， 进一步包括： 空白对照实验。 0022 本发明提供了一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用， 将大量癌症 患者作为研究病例， 对病例进行基因检测并分析， 确定出人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1的 突变蛋白， 根据该人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋

12、白制备基因芯片、 单克隆抗体和 ELISA试剂盒， 为癌症的基因诊断提供指引作用， 实现癌症的早诊断、 早发现和相关治疗。 0023 上述说明仅是本发明技术方案的概述， 为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施， 以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。 附图说明 0024 图1是本发明实施例一提供的一种比对结果示意图； 0025 图2是本发明实施例一提供的一种基因芯片布局图； 0026 图3是本发明实施例二提供的一种显色结果示意图； 0027 图4是本发明实施例二提供的另一种显色结果示意图； 0028 图5是本发明实施例五提供的为蛋白含量的标准曲线； 002

13、9 图6是本发明实施例五提供的Western blot检测结果示意图； 0030 图7是本发明实施例六提供的为蛋白含量的标准曲线； 0031 图8是本发明实施例六提供的Western blot检测结果示意图； 0032 图9是本发明实施例七提供的为蛋白含量的标准曲线； 0033 图10是本发明实施例七提供的Western blot检测结果示意图。 具体实施方式 0034 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0035 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0036 实施例一、 基因芯片的制备 0037 首先， 可以根据申请号为 “201

14、710429915.8” 、 专利名称为 “一种突变蛋白的检测方 法及装置” 的中国发明专利中描述的检测方法， 确定出人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变 蛋白的编码基因， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 相应地， 根据该编码基因确定出人的 蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白， 其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 0038 其次， 根据人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其编码基因， 按照如下方式 实现基因芯片的制备。 0039 1、 核苷酸探针的设计 说明书 2/11 页 4 CN 108192877 A 4 0040 (1)核苷酸探针的设计： 核苷酸探针根据人的

15、蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白 的核苷酸序列， 与人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白的核苷酸序列的比对结果来确 定， 并根据如下探针的设计原则， 设计出针对人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的特 异性的核苷酸探针。 0041 其中， 核苷酸探针设计的原则如下： 0042 核苷酸探针Tm值应接近整个基因组的平均Tm值， 上下波动5； 0043 核苷酸探针分子内重复的单一碱基连续不超过4个； 0044 G+C含量为40-60， 减少非特异性杂交保证杂交的特异性； 0045 核苷酸探针分子内部稳定二级结构配对碱基长度少于4bp， 这样可以保证不会 因核苷酸探针内部稳定的二级结构而影

16、响杂交效率； 0046 经同源比较与其他序列的相似性小于40； 0047 经对比与非探针备选序列的同源片段连续不超过20个碱基。 0048 其中， 人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白对应的氨基酸序列与人的蛋氨酸亚 砜氧化酶MICAL1正常蛋白对应的氨基酸序列的比对结果请参考图1， 其中， 图1中的Query序 列是人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白对应的氨基酸序列， Sbjct序列是人的蛋氨酸 亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白对应的氨基酸序列， 根据图1可知， 人的蛋氨酸亚砜氧化酶 MICAL1突变蛋白相对于人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白， 有一处氨基酸序列发生了 缺失，

17、并有一处发生了插入。 根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列， 以及图1的比对结果， 为 了能够特异性识别待检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1是否发生了突变， 那么在选取核 苷酸探针时， 可以按照如下几种方式中的任一种方式设计核苷酸探针： 0049 选取插入位置的插入核苷酸序列生成核苷酸探针； 0050 在插入位置之前， 和/或， 在插入位置之后， 各选择若干个核苷酸序列， 将选择的 若干个序列核苷酸与插入位置的插入核苷酸序列共同生成核苷酸探针， 其中， 生成的核苷 酸探针中相邻核苷酸的先后顺序与其在突变蛋白对应的核苷酸序列中的顺序一致； 0051 在插入位置之前选择若干个核苷酸序列，

18、 与在插入位置的开始位置处选择若干 个核苷酸序列， 生成核苷酸探针； 0052 在插入位置之后选择若干个核苷酸序列， 与在插入位置的结束位置处选择若干 个核苷酸序列， 生成核苷酸探针； 0053 在缺失位置之前与缺失位置之后各选择若干个核苷酸序列(碱基顺序不变)， 生 成核苷酸探针； 0054 在本实施例中， 根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列以及根据上述核苷酸探针设 计原则， 按照上述方式设计一种优选地核苷酸探针如SEQ ID NO:3所示， 该核苷酸探针 为： ccagaacagc tcgtt 0055 (2)核苷酸探针的合成： 通过核苷酸序列合成上述设计好的核苷酸探针。 0056

19、 2、 检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1是否发生突变的基因芯片的制备 0057 为了保证检测对象样品的质量， 还需在基因芯片上设计空白对照、 阳性对照和阴 性对照。 其中， 该基因芯片的布局至少可以为如图2所示的一种布局。 在图2中， 为空白对 照， 为阴性对照， 为阳性对照，为实验组。 说明书 3/11 页 5 CN 108192877 A 5 0058 其中， 实验组的位置即为核苷酸探针的点样位置。 0059 对于空白对照、 阴性对照所需点样的阴性内参质控探针、 以及阳性对照所需点样 的阳性内参质控探针设计如下： 0060 空白对照： 是不含任何基因片段的空白点样液作为芯片制备过程中的

20、污染监控指 标。 0061 阴性内参质控探针： 是一段与检测基因没有同源性的其他基因片段， 作为杂交过 程中非特异性杂交的监控指标， 阴性内参质控探针包括的核苷酸个数可以与核苷酸探针的 碱基个数相同。 本发明实施例中， 基因芯片所需的阴性内参探针序列可以为： tgatgctgat aattgcat。 0062 阳性内参质控探针： 是一段与检测基因有同源性的其他基因片段， 在人的蛋氨酸 亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白中， 选择与核苷酸探针对应的序列不同， 且可以与核苷酸探针 碱基的个数相同， 也可以与核苷酸探针碱基的个数不同的一段核苷酸序列作为阳性内参质 控探针。 优选地， 选取核苷酸个数与核苷

21、酸探针碱基的个数相同的阳性内参质控探针。 本发 明实施例中， 基因芯片所需的阳性内参探针序列可以为： tggcaagctc gggaa。 0063 需要说明的是， 在基因芯片的点样过程中， 按照基因芯片的布局点入阴性内参探 针和阳性内参探针溶液； 空白对照所用的试剂为1倍的点样缓冲液(10海藻糖溶液)。 0064 实施例二、 基因芯片的应用 0065 1、 样品处理 0066 (1)采集检测对象的血液1-3mL。 0067 (2)取DEPC处理的1.5mL EP管， 将其作为被检测样品处理管， 在管中加入检测对象 的血液300 L， 再加入Trizol 700 L， 充分混匀， 室温放置10m

22、in。 0068 (3)加入200 L的氯仿， 盖紧管盖， 用力震荡， 室温放置3-5min， 置于离心机中， 12000r/min， 4离心15min， 小心吸去离心管中所有上清。 0069 (4)加入等体积异丙醇， 轻轻颠倒离心管充分混匀液体， 室温放置10min， 12000r/ min， 4离心15min， 小心吸去所有上清。 0070 (5)用1mL 75的乙醇清洗一次， 7500r/min离心15min， 小心吸去所有上清， 在超 净台中干燥15min， 加入10 L DEPC处理水溶解。 0071 (6)所得产物为RNA， 如果总RNA的纯度不高， 会影响探针的标记效率和芯片杂交

23、结 果。 所以使用QIAGENKit纯化总RNA。 0072 2、 cDNA第一链和第二链一步法合成 0073 (1)取2 g RNA于1.5mL的离心管中配置如下反应溶液： 0074 总RNA2 g最多6.5 L T7 Promotor primer5 L RNase-free WaterX L 总体积11.5 L 0075 其中， RNase-free Water的加入量X L， 是根据总体积11.5 L减去T7Promotor primer的加入量5 L， 再减去总RNA的加入量计算得来的。 0076 (2)在65下保温10min， 并冰浴5min， 预先将5First Strand B

24、 ffer在65下 说明书 4/11 页 6 CN 108192877 A 6 预热5min。 0077 (3)配置如下cDNA合成体系： 0078 5First Strand Buffer4 L 0.1M DTT2 L 10mM dNTP mix1 L MMLV RT1 L RNase OUT0.5 L 总体积8.5 L 0079 (4)将上述8.5 L混合均匀后加入变性后冰浴的RNA中。 0080 (5)用枪头混匀之后离心。 0081 (6)40反应2h。 0082 3、 aaUTP标记cRNA合成 0083 NTP的配置： 0084 0085 0086 分装成10管备用， 注： 50PE

25、G(聚乙二醇)使用之前40保温1min。 同时按如下操 作配置Transcription mix； 0087 (1)配置Transcription mix 0088 RNase-free Water5.7 L 4Transcription Buffer20 L NTP16 L 0.1M DTT6 L 50PEG6.4 L aa-UTP(25mM)4 L Inorganic Pyrophosphatase0.6 L T7 RNA Polymerase0.8 L 总体积60 L 0089 (2)加入55 L 2GEx Hybridization Buffer。 说明书 5/11 页 7 CN 10

26、8192877 A 7 0090 (3)PCR仪中热盖60， 40反应2h。 0091 4、 cRNA纯化 0092 QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA， 具体方法可参见QIAGEN公司随试剂盒提供的 操作手册。 0093 (1)加入20 LRNase free水， 加入350 L BufferRLT并充分混匀。 0094 (2)加入250 L无水乙醇， Tip头充分混匀。 0095 (3)将共计700 L含总RNA的溶液转入套在2mL离心管内的RNeasy柱子内8000g离 心15-30s， 弃去滤过液。 0096 (4)吸取500 LBuffer RPE到RNeasy

27、 mini柱子内8000g离心洗涤15-30s弃去滤 过液再用500 LBuffer RPE在8000g离心洗涤2min弃去滤过液和2mL的套管将RNeasymini 柱子转入一新的1.5mL Eppendorf管中。 0097 (5)吸取30 L RNase free的水静置1min， 8000g离心洗脱1min。 0098 (6)重复步骤(5)一次。 0099 5、 cRNA浓度测定 0100 用分光光度计分析cRNA浓度。 需要测定260nm和280nm处的吸光值来确定样品的浓 度和纯度， A260/A280应接近2.0为较纯的cRNA(比值在1.9-2.1也可)。 0101 6、 cR

28、NA样品荧光标记； 0102 (1)取上述cRNA 4 g并浓缩至6.6 L。 0103 (2)加10 L DMSO混匀。 0104 (3)加3.4 L的0.3M pH为9.0的碳酸氢钠(NaHCO3)并混匀。 0105 (4)将上述20 L cRNA混合物加入到荧光染料Cy3中并混匀。 25保温1h。 0106 (5)加9 L的4M Hydroxylamine混匀后25保温15min。 0107 7、 荧光标记cRNA样品纯化 0108 具体步骤同本实施例的步骤4中cRNA纯化的过程， 本步骤不在赘述。 0109 8、 cRNA样品片段化和芯片杂交4x44K microarrays 0110

29、 (1)按下表配制片段化混合液然后在60温浴30min进行片段化。 0111 Cy3 cRNA绿色荧光875ng 10Blocking Agent11 L 25Fragmentation Buffer2.2 L Nuclease-free waterX L 总体积55 L 0112 (2)加入55 L 2GEx Hybridization Buffer。 0113 (3)取100 L杂交液滴加到芯片皿上， 同时按芯片布局如图2所示分别滴加在空白、 阴性、 阳性、 实验组位置上。 盖上芯片并密封于杂交盒中， 60滚动杂交16h。 0114 9、 芯片洗涤 0115 洗液1(1L)配置： 0116

30、 DEPC-H2O700mL 说明书 6/11 页 8 CN 108192877 A 8 20*SSPE300mL 20N-Lauroylsarcosine0.25mL 0117 洗液2(1L)配置： 0118 DEPC-H2O997mL 20*SSPE3.0mL 20N-Lauroylsarcosine0.25mL 0119 洗液3： Stabilization and Drying Solution 0120 (1)取出芯片于洗液1中洗涤1min； 0121 (2)再将芯片放入洗液2中洗涤1min(37)； 0122 (3)最后将芯片于洗液3中洗涤30s。 0123 10、 芯片扫描 01

31、24 将芯片在扫描仪中进行扫描， 根据扫描结果确定检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶 MICAL1蛋白是否发生了突变。 请参考图3和图4， 图3所示的结果中， 阴性对照无绿色荧光， 阳 性对照为绿色荧光， 表明采集检测对象的样品质量是没有问题的， 而实验组为绿色荧光， 那 么表明检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白发生了突变。 图4所示的结果中， 阴性对照 为无色荧光， 阳性对照为绿色荧光， 表明采集检测对象的样品质量是没有问题的， 而实验组 无绿色荧光， 那么表明检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白未发生突变。 0125 实施例三、 特异性识别人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的单

32、克隆抗体的制 备 0126 1、 根据人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的碱基序列(如SEQ ID NO:2所示) 设计上游引物如SEQ ID NO:4所示， 以及， 下游引物如SEQ ID NO:5所示： 0127 上游引物(P)： gctgctgact ttgccaccc 0128 下游引物(F)： gccctgggcc cctgtcccc 0129 2、 检测对象的DNA为模板进行PCR扩增 0130 0131 0132 以检测对象的DNA为模板进行PCR扩增， 获得人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋 白基因完整片段， 并连接pMD19-T Vector(Takara公司)，

33、进行测序。 然后由专门的生物公司 说明书 7/11 页 9 CN 108192877 A 9 制备抗体， 是一种人源化或嵌合型抗体。 将制备的抗体采用ELISA法测定含量。 0133 实施例四、 用于检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的ELISA试剂 盒 0134 本实施例中， ELISA试剂盒的组成为： 包被有实施例三所述单克隆抗体的ELISA酶 标板、 酶标二抗、 检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白、 样品稀释液、 包被缓冲液、 ELISA酶标板洗涤液、 显色液和终止液。 0135 其中， 上述各个组成的参数至少可以为如下一种参数： 0136 ELISA酶标板可以为

34、96孔的ELISA酶标； 0137 酶标二抗可以是稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗人IgG； 其中， 稀释倍 数可以是8000倍。 0138 包被缓冲液可以是1PBS， pH:7.4； 0139 ELISA酶标板洗涤液可以是含0.05Tween-20的1PBS溶液； 0140 显色液可以是3,3 ,5,5 -四甲基联苯胺； 0141 终止液可以是2mol/L的硫酸溶液。 0142 实施例五 0143 在本发明实施例中， 将肺癌患者作为检测对象， 并利用ELISA试剂盒检测该肺癌患 者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白是否发生了突变， 该方法至少可以包括如下一种： 0144 a、 使用

35、所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释， 例如， 稀释成 2.0ug/mL， 并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中， 室温孵育1-2h。 0145 b、 使用样品稀释液将肺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白稀释成不同浓度 梯度， 并将不同浓度梯度的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中， 并室温孵育1-2h； 0146 c、 甩去各孔中的液体， 加入所述ELISA酶标板洗涤液， 洗涤并甩干； 0147 d、 加入所述酶标二抗， 并室温孵育1-2h； 0148 e、 甩去各孔中的液体， 加入ELISA酶标板洗涤液， 洗涤并甩干； 0149

36、f、 加入所述显色液， 室温避光孵育10-20min， 加入所述终止液终止反应； 0150 g、 在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。 0151 h、 制作标准曲线： 以标准品浓度为横坐标， 标准品测定的吸光值为纵坐标， 作出标 准曲线； 计算标准曲线回归系数R2， 当R20.99时本次测定有效； 其中， 可以使用ELISA Calc 软件绘制该标准曲线， 根据该ELISA Calc软件可以获知回归系数R20.9956， 因此， 本次测 定有效。 将检测得到的波长为450nm处的吸光值代入标准曲线即可求得肺癌患者的蛋氨酸 亚砜氧化酶MICAL1蛋白的浓度。 利用建立的ELISA方法检测肺

37、癌患者血清样品中蛋氨酸亚 砜氧化酶MICAL1蛋白的含量。 并用Western blot进行鉴定。 请参考图5， 为吸光值的标准曲 线。 其中， X轴为吸光值， Y轴为对应的浓度。 0152 i、 Western blot鉴定 0153 1、 制胶 0154 (1)清洗玻璃板并擦干； 0155 (2)参考分子克隆方法配制SDS-PAGE胶： 0156 A.下层分离胶配制体系(Total Volum： 15mL) 说明书 8/11 页 10 CN 108192877 A 10 0157 ddH2O5.9mL 30丙烯酰胺混合液5.9mL 1.5mol/L Tris(PH8.8)3.8mL 10S

38、DS0.15mL 10过硫酸铵0.15mL TEMED0.006mL 0158 B.上层积层胶浓缩配制体系(Total Volum： 8mL) 0159 0160 0161 (3)在每个胶板中加入相应体积的下层分离胶， 再加入1mL的无菌ddH2O， 压平分离 胶， 待分离胶凝固后， 用滤纸吸干制胶板中剩余的水分， 而后加入上层浓缩胶， 插入梳子后 等待上层浓缩胶凝固。 0162 2、 蛋白上样电泳： 0163 (1)拔下梳子， 做好孔道标记， 加入5SDS电泳缓冲液， 随后给蛋白样品中加入 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5)， 沸水浴加热3-5min， 上样； 0164 (2)先用80V电

39、压进行电泳， 待条带跑过浓缩胶之后， 换用100V电压跑大约100min。 0165 3、 转膜及孵育： 0166 (1)先把PVDF膜在甲醇中活化约30s。 分别将凝胶、 海绵垫和PVDF膜预先在电转移 缓冲液中平衡30min。 按滤纸-胶-膜-滤纸的顺序夹好， 按照黑面对黑面的原则放入转膜器 中， 加入制冷器(冰袋)， 在冰中以150mA的电流跑约120min； 0167 (2)完成后将膜取出， 立刻放入5的脱脂牛奶中， 摇床上轻轻室温封闭1h； 0168 (3)PBST清洗已封闭的膜， 清洗3次， 每次10min； 0169 (4)加入稀释到相应倍数的一抗， 4摇床过夜孵育； 0170

40、(5)回收一抗， PBST清洗膜三次， 每次10min； 0171 (6)二抗(用3的牛奶以1:5000-1:10000稀释)室温孵育膜2h； 0172 (7)用PBST清洗膜三次， 每次10min； 0173 (8)Pierce ECLWestern Blotting Substrate试剂盒A、 B液等体积混匀后， 逐滴滴 加在PVDF膜上； 0174 (9)FluorChem E FE0511中曝光成像， 实验用Image J分析。 0175 其中， 一抗是公司制备的人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白单克隆抗体， 二 说明书 9/11 页 11 CN 108192877 A 11

41、抗是辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。 0176 j、 Western blot检测结果分析： 按照Western blot实验步骤显示结果， 如图6所 示， 其中， 图6中的Marker用于表征标记蛋白的大小。 与空白对照相比， 仅在实验组179KD附 近出现明显条带， 其中， 蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的分子量大约为179KD， 表明该 肺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白确实存在突变。 0177 实施例六 0178 在本发明实施例中， 将肝癌患者作为检测对象， 并利用ELISA试剂盒检测该肝癌患 者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白是否发生了突变， 该方法至少可以包括如

42、下一种： 0179 a、 使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释， 例如， 稀释成 2.0ug/mL， 并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中， 室温孵育1-2h； 0180 b、 使用样品稀释液将检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白稀释成不同浓度 梯度， 并将不同浓度梯度的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中， 并室温孵育1-2h； 0181 c、 甩去各孔中的液体， 加入所述ELISA酶标板洗涤液， 洗涤并甩干； 0182 d、 加入所述酶标二抗， 并室温孵育1-2h； 0183 e、 甩去各孔中的液体， 加入ELISA酶标板洗涤

43、液， 洗涤并甩干； 0184 f、 加入所述显色液， 室温避光孵育10-20min， 加入所述终止液终止反应； 0185 g、 在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。 0186 h、 制作标准曲线： 以标准品浓度为横坐标， 标准品测定的吸光值为纵坐标， 作出标 准曲线； 计算标准曲线回归系数R2， 当R20.99时本次测定有效； 其中， 可以使用ELISA Calc 软件绘制该标准曲线， 根据该ELISA Calc软件可以获知回归系数R20.9958， 因此， 本次测 定有效。 将检测得到的波长为450nm处的吸光值代入标准曲线即可求得样品中肝癌患者的 蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白的浓

44、度。 利用建立的ELISA方法检测肝癌患者血清样品中蛋 氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白的含量。 并用Western blot进行鉴定。 请参考图7， 为吸光值的 标准曲线。 其中， X轴为吸光值， Y轴为对应的浓度。 0187 i、 Western blot鉴定 0188 j、 Western blot检测结果分析 0189 其中， 步骤i和步骤j与实施例五中的相同， 在此不再赘述， 请参考图8， 图8中的 Marker用于表征标记蛋白的大小。 本实施例的实验显示结果， 与空白对照相比， 仅在实验组 179KD附近出现明显条带， 其中， 蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的分子量大约为179

45、KD， 表明该肝癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白确实存在突变。 0190 实施例七 0191 在本发明实施例中， 将胰腺癌患者作为检测对象， 并利用ELISA试剂盒检测该胰腺 癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白是否发生了突变， 该方法至少可以包括如下一种： 0192 a、 使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释， 例如， 稀释成 2.0ug/mL， 并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中， 室温孵育1-2h； 0193 b、 使用样品稀释液将胰腺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白稀释成不同浓 度梯度， 并将不同浓度梯度的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1

46、蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔 中， 并室温孵育1-2h； 说明书 10/11 页 12 CN 108192877 A 12 0194 c、 甩去各孔中的液体， 加入所述ELISA酶标板洗涤液， 洗涤并甩干； 0195 d、 加入所述酶标二抗， 室温孵育1-2h； 0196 e、 甩去各孔中的液体， 加入ELISA酶标板洗涤液， 洗涤并甩干； 0197 f、 加入所述显色液， 室温避光孵育10-20min， 加入所述终止液终止反应； 0198 g、 在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。 0199 h、 制作标准曲线， 以标准品浓度为横坐标， 标准品测定的吸光值为纵坐标， 作出标 准曲

47、线； 计算标准曲线回归系数R2， 当R20.99时本次测定有效； 其中， 可以使用ELISA Calc 软件绘制该标准曲线， 根据该ELISA Calc软件可以获知回归系数R20.9975， 因此， 本次测 定有效。 将检测得到的波长为450nm处的吸光值代入标准曲线即可求得样品中胰腺癌患者 的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白的浓度。 利用建立的ELISA方法检测胰腺癌患者血清样品 中蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白的含量。 并用Western blot进行鉴定。 请参考图9， 为吸光 值的标准曲线。 其中， X轴为吸光值， Y轴为对应的浓度。 0200 i、 Western blot鉴定 0

48、201 j、 Western blot检测结果分析 0202 其中， 步骤i和步骤j与实施例五中的相同， 在此不再赘述， 请参考图10， 图10中的 Marker用于表征标记蛋白的大小。 本实施例的实验显示结果， 与空白对照相比， 仅在实验组 179KD附近出现明显条带， 其中， 蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的分子量大约为179KD， 表明该胰腺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白确实存在突变。 0203 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 并不用于限制本发明， 应当指出， 对于本技 术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和 变型， 这些改

49、进和变型也应视为本发明的保护范围。 说明书 11/11 页 13 CN 108192877 A 13 序列表 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司 一种蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用 5 SIPOSequenceListing 1.0 1 733 PRT 智人种(Homo sapiens) 1 Ala Ala Asp Phe Ala Thr His Gly Lys Leu Gly Lys Leu Glu Phe Ala 1 5 10 15 Gln Asp Ala His Gly Gln Pro Asp Val Ser Ala Phe Asp Phe Thr Ser 20 25 30 Met Met Arg Ala Gl