TBX19基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810009554.6 (22)申请日 2018.01.04 (71)申请人 大连医科大学附属第二医院 地址 116021 辽宁省大连市沙河口区中山 路467号 (72)发明人 张波娄佳成王翔李欣宇 吕逸竹郝宇超 (74)专利代理机构 北京律远专利代理事务所 (普通合伙) 11574 代理人 丁清鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 TBX19基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及 表达 (

2、57)摘要 本发明公开了TBX19基因在垂体腺瘤生物标 记中的应用及表达， 具体为天然核糖核苷酸的用 途技术领域， TBX19是T-box家族基因的一种， 鉴 别可能患有垂体腺瘤的对象或垂体腺瘤的侵袭 性， 再或者确定先前经鉴别的对象的手术预后的 方法及其引物序列结构、 PCR产物识别序列。 包括 检测来自所述对象的垂体腺瘤组织样本中TBX19 的表达量量， 其中较高量的TBX19为所述对象垂 体腺瘤侵袭性强， 并与所述对象预后不良可能性 增加有关。 提出了TBX19基因的用途。 TBX19基因 在侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤病人组 织中表达量存在差异， 因此TBX19基因具有成为 垂体腺

3、瘤生物标志物的应用前景。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 108220441 A 2018.06.29 CN 108220441 A 1.TBX19基因在垂体腺瘤生物标记中的应用， 其特征在于： TBX19是T-box家族基因的一 种， 鉴别可能患有垂体腺瘤的对象或垂体腺瘤的侵袭性， 再或者确定先前经鉴别的对象的 手术预后的方法及其引物序列结构、 PCR产物识别序列， 所述的TBX19碱基序列如SEQIDNO： 1 所示。 2.如权利要求1所述的应用， 包括检测来自所述对象的垂体腺瘤组织样本中TBX19的表 达量量， 其中较高量的TBX19为所述对象垂体腺瘤侵袭性强，

4、并与所述对象预后不良可能性 增加有关。 3.TBX19基因在垂体腺瘤生物标记中的表达， 其特征在于： 具体的表达方法包含以下步 骤： 步骤一、 侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织RNA提取； 步骤二、 总RNA反转录cDNA； 步骤三、 将cDNA进行定时定量PCR检测， 反应结束后检测样品中TBX19的PCR识别序列， 然后与PCR产物序列结果进行对比可知TBX19在垂体腺瘤组织中进行表达。 4.根据权利要求3的表达方法， 其特征在于： 所述的步骤一中侵袭性和非侵袭性垂体腺 瘤组织RNA提取方法是相同的， 具体提取方法为： 称取2克组织材料， 加入250微升RNAiso Plus， 手持电动器研磨

5、后， 转移至1.5毫升RNase-free的离心管中， 12000转4离心10分钟， 去上清200微升加入1.5毫升RNase-free的离心管中， 加入1毫升RNAiso Plus新混匀后室温 静置5分钟， 加入200微升的氯仿， 充分混匀后， 室温静置3分钟， 12000转4离心15分钟， 取 上清250ul， 加入500微升异丙醇混匀后室温静置10分钟， 12000转4离心10分钟， 弃掉上 清， 加入75乙醇， 颠倒混匀后， 7500转4离心5分钟， 弃掉上清， 室温静置5分钟， 加入15- 20微升Nuclease-Free water溶解， Nanodrop测算所得液体的OD值及浓

6、度。 5.根据权利要求3的表达方法， 其特征在于： 所述的步骤二中总RNA反转录cDNA的方法 为： 按照反转录试剂盒PrimeSeriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser说明， 加入1微克 RNA进行基因组DNA的去除， 具体加入DNA酶、 反应缓冲液及Nuelease-Free水补齐10微升反 应体系， PCR仪42孵育2分钟， 而后进行反转录， 具体加入反转录所需的随机引物， 缓冲液、 反转录酶及Nuclease-Free水补齐20微升反应体系， PCR仪37孵育15分钟， 85孵育30秒， 4保温， 将反转录产物1 10稀释， 在冰上制备qPCR混合

7、物。 6.根据权利要求3的表达方法， 其特征在于所述的步骤三中将eDNA进行定时定量PCR检 测反应条件如下： 首先95下预变性30秒， 然后95变性5秒， 56退火30秒， 72延伸30 秒， 40个循环， 热融解阶段95下变性60秒， 56下热融解30秒， 95热融解30秒。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108220441 A 2 TBX19基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达 技术领域 0001 本发明涉及TBX19基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达， 具体为天然核糖核 苷酸的用途技术领域。 背景技术 0002 垂体腺瘤(简称垂体瘤)是人类最常见的颅内肿瘤之一， 约占颅内肿瘤的1

8、0- 15。 垂体瘤在组织学上属于良性肿瘤， 但有些垂体瘤呈侵袭性生长， 包绕或侵犯周围组织 结构， 该部分肿瘤手术难以彻底切除， 是肿瘤复发的主要原因之一。 根据垂体瘤的生物学行 为可分为非侵袭性垂体瘤、 侵袭性垂体瘤和垂体癌。 侵袭性垂体瘤介于非侵袭性垂体瘤和 垂体癌之间， 其组织学形态属于良性， 生物学特征却似恶性。 侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤的 临床表现、 预后均明显不同。 侵袭性垂体腺瘤的坏死、 卒中、 囊变发生率明显高于非侵袭性 垂体腺瘤。 侵袭性生长使得外科手术难以做到全切肿瘤， 而常用药物溴隐停、 生长抑素对这 类肿瘤的疗效较差； 侵袭性生长同样限制了其对放疗的敏感性， 且鞍区放

9、疗容易导致正常 垂体、 下丘脑及视神经等重要结构的损伤。 这些因素导致侵袭性垂体腺瘤术后复发率高， 肿 瘤残余组织增长快。 显而易见， 对侵袭性垂体瘤的治疗是神经外科领域和肿瘤治疗领域面 临的巨大挑战。 因此， 寻找与垂体腺瘤侵袭性相关的分子标记对于及时治疗和改善预后至 关重要。 0003 TBX19是T-box家族基因的一种， 对于促肾上腺皮质激素细胞分泌前阿片黑素细胞 皮质激素(POMC)及促肾上腺皮质激素细胞的分化是必要的。 本发明利用实时定量PCR的方 法， 检测分析TBX19基因与垂体腺瘤侵袭性有很好相关性， 可用于制备垂体腺瘤辅助诊断或 者预后判断制剂。 发明内容 0004 本发明

10、的目的在于提供TBX19基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达。 0005 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： TBX19基因在垂体腺瘤生物标记中的 应用， TBX19是T-box家族基因的一种， 鉴别可能患有垂体腺瘤的对象或垂体腺瘤的侵袭性， 再或者确定先前经鉴别的对象的手术预后的方法及其引物序列结构、 PCR产物识别序列。 0006 所述方法包括检测来自所述对象的垂体腺瘤组织样本中TBX19的表达量量， 其中 较高量的TBX19为所述对象垂体腺瘤侵袭性强， 并与所述对象预后不良可能性增加有关。 0007 本发明还提供TBX19基因在垂体腺瘤生物标记中表达， 所述的表达方法包含以下 步

11、骤： 0008 步骤一、 侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织RNA提取； 0009 步骤二、 总RNA反转录cDNA； 0010 步骤三、 将cDNA进行定时定量PCR检测， 反应结束后检测样品中TBX19的PCR识别序 列， 然后与PCR产物序列结果进行对比可知TBX19在垂体腺瘤组织中进行表达。 0011 进一步优选， 所述的步骤一中侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织RNA提取方法是相 说明书 1/4 页 3 CN 108220441 A 3 同的， 具体提取方法为： 称取2克组织材料， 加入250微升RNAiso Plus， 手持电动器研磨后， 转移至1.5毫升RNase-free的离心管中， 12

12、000转4离心10分钟， 去上清200微升加入1.5毫 升RNase-free的离心管中， 加入1毫升RNAiso P lus新混匀后室温静置5分钟。 加入200微升 的氯仿， 充分混匀后， 室温静置3分钟， 12000转4离心15分钟， 取上清250ul， 加入500微升 异丙醇混匀后室温静置10分钟， 12000转4离心10分钟。 弃掉上清， 加入75乙醇， 颠倒混 匀后， 7500转4离心5分钟， 弃掉上清， 室温静置5分钟， 加入15-20微升Nuclease-Free water溶解。 Nanodrop测算所得液体的OD值及浓度。 0012 进一步优选， 所述的步骤二中总RNA反转录

13、cDNA的方法为： 按照反转录试剂盒 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser说明， 加入1微克RNA进行基因组DNA的 去除， 具体加入DNA酶、 反应缓冲液及Nuclease-Free水补齐10微升反应体系， PCR仪42孵 育2分钟。 而后进行反转录， 具体加入反转录所需的随机引物， 缓冲液、 反转录酶及 Nuclease-Free水补齐20微升反应体系， PCR仪37孵育15分钟， 85孵育30秒， 4保温， 将 反转录产物1： 10稀释， 在冰上制备qPCR混合物。 0013 作为优选， 所述的步骤三中将eDNA进行定时定量PCR检测

14、反应条件如下： 首先95 下预变性30秒， 然后95变性5秒， 56退火30秒， 72延伸30秒， 40个循环， 热融解阶段95 下变性60秒， 56下热融解30秒， 95热融解30秒。 0014 本发明的有益效果是： (1)提出了TBX19基因的用途。 (2)本发明的研究表明异常量 的TBX19为所述对象垂体腺瘤侵袭性强， 并与所述对象预后不良可能性增加有关。 (3)TBX19 基因在侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤病人组织中表达量存在差异， 因此TBX19基因 具有成为垂体腺瘤生物标志物的应用前景。 附图说明 0015 图1为使用TBX19筛查引物对垂体腺瘤患者组织样本表达量筛选结果图。

15、具体实施方式 0016 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于 本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例， 都属于本发明保护的范围。 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步描述 0017 实验材料， 临床样品： 19例垂体腺瘤(8例侵袭性垂体腺瘤， 9例非侵袭性垂体腺瘤) 组织样本有大连医科大学附属第二医院所提供。 0018 试剂： TBX19筛查引物由Invitrogen公司合成； RNAiso Plus(货号9109)

16、购自 Takara公司； 0019 氯仿购自永大化学试剂(天津)有限公司； 0020 异丙醇购自永大化学试剂(天津)有限公司； 0021 乙醇购自国药集团化学试剂有限公司； 0022 反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(货号： RR047Q) 购自Takara公司； 0023 SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号： FP205-02)购自天根生化科技(北 说明书 2/4 页 4 CN 108220441 A 4 京)有限公司； 0024 Nuclease-Free water(货号RT121

17、)购自根生化科技(北京)有限公司。 0025 2、 实验方法， 称取2克组织材料， 加入250微升RNAiso Plus， 手持电动器研磨后， 转 移至1.5毫升RNase-free的离心管中， 12000转4离心10分钟， 去上清200微升加入1.5毫升 RNase-free的离心管中， 加入1毫升RNAiso Plus新混匀后室温静置5分钟。 加入200微升的 氯仿， 充分混匀后， 室温静置3分钟， 12000转4离心15分钟， 取上清250ul， 加入500微升异 丙醇混匀后室温静置10分钟， 12000转4离心10分钟。 弃掉上清， 加入75乙醇， 颠倒混匀 后， 7500转4离心5分

18、钟， 弃掉上清， 室温静置5分钟， 加入15-20微升Nuclease-Free water 溶解。 Nanodrop测算所得液体的OD值及浓度。 0026 3、 表达量筛查， 按照反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser说明， 加入1微克RNA进行基因组DNA的去除， 具体加入DNA酶、 反应缓冲液及 Nuclease-Free水补齐10微升反应体系， PCR仪42孵育2分钟。 而后进行反转录， 具体加入 反转录所需的随机引物， 缓冲液、 反转录酶及Nuclease-Free水补齐20微升反应体系， PCR仪 37孵育15分钟，

19、85孵育30秒， 4保温。 0027 配置反应混合物 0028 0029 B.Real-Time PCR(SYRB Green法) 0030 将反转录产物1 10稀释， 在冰上制备qPCR混合物： 说明书 3/4 页 5 CN 108220441 A 5 0031 0032 将样品放入qPCR仪器中运行， 程序如下 0033 0034 4、 图1为使用TBX19筛查引物对垂体腺瘤患者样品表达量筛查的结果图。 实验结果 表明TBX19基因在侵袭性垂体腺瘤中的表达显著升高， 平均表达量(Ct值)差-2.254， 相当于 侵袭性垂体腺瘤中TBX19的表达量是非侵袭性垂体腺瘤中的4.77倍。 如此大的

20、表达差异给 了TBX19作为侵袭性垂体腺瘤生物标记物的应用前景。 0035 尽管已经示出和描述了本发明的实施例， 对于本领域的普通技术人员而言， 可以 理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、 修改、 替换 和变型， 本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。 说明书 4/4 页 6 CN 108220441 A 6 序列表 大连医科大学附属第二医院 TBX19基因在垂体腺瘤生物标记中的应用及表达 2018-01-04 2 SIPOSequenceListing 1.0 1 2882 DNA 人类(homo sapiens) 1 tagaagcagg caagttg

21、ggt aacggctctc ggcaaagttc gagaagtgcc tatggccatg 60 agtgagctgg gcactcggaa gcccagcgat ggcactgttt ctcatctgct caatgtggtg 120 gagagtgagc ttcaggcagg gagggaaaaa ggcgacccta cggagaagca acttcagatc 180 atcctggagg atgcacctct ctggcagaga ttcaaggaag tcactaatga gatgattgtg 240 accaagaatg gcagacggat gtttccagtc ctaaag

22、atta gtgtcacagg gttggacccc 300 aatgccatgt actccctcct gctggacttt gtccctacgg acagtcaccg ctggaagtac 360 gtcaacgggg aatgggtgcc cgctggcaag ccagaggtct ccagccacag ctgcgtctac 420 attcacccgg actcccccaa ctttggggcc cactggatga aagctcccat ctccttcagc 480 aaagtgaagc tgaccaacaa gctcaatgga ggcgggcaga taatgttgaa ttct

23、ctgcat 540 aaatatgaac cccaggttca catagtgcgt gttggaagtg cccatcgaat ggtaacaaac 600 tgctccttcc ctgaaaccca gttcatagcc gtgactgcct atcagaatga ggagataacg 660 gctctcaaaa tcaagtacaa tccttttgcc aaagccttct tggatgccaa ggaaagaaat 720 cacctaagag acgtaccgga ggctatctct gagagccagc atgtgaccta ttctcacttg 780 ggaggctgg

24、a tcttttccaa tccagatgga gtgtgcacag caggaaactc caattaccag 840 tatgccgctc ctctgcctct gcctgctccc cacacccacc atggctgtga gcactattcg 900 ggtctccgag gacaccggca ggctccctac ccttctgcgt acatgcacag aaaccattct 960 ccctcagtga atttgataga aagctcaagc aataatctgc aagttttctc gggacctgac 1020 agctggactt ccttatcctc cacacc

25、ccat gccagcatcc tgtctgtacc ccacaccaac 1080 ggaccaatca atccagggcc cagcccctac ccgtgcctgt ggaccatcag caatggtgcc 1140 ggaggcccca gtgggccagg cccggaggtg cacgccagca ccccaggagc atttctcctc 1200 ggaaacccag ctgtgacttc acccccttct gtgctctcca cccaagcacc cacttcggct 1260 ggtgtggagg ttctggggga gccctcgcta accagcattg

26、ctgtgtccac ctggacagca 1320 gtggcctcgc atcccttcgc gggctggggt ggcccaggag cgggtgggca ccattctcct 1380 tcctcactgg atggttaagc aggatcctag gagcctcttt gcacagcgat ccttccatgt 1440 gtagagtgct tagaaacccc atcaactgat ctagtgagtc agactgtgga atctcccttc 1500 ccactagctg gaggtggagg tgggttatta cagaagtcat actgggagag ggttc

27、agttt 1560 ggatgatgct agttagatca tttgcatctc tccaccattt tcttctgcac tcccattttc 1620 序列表 1/2 页 7 CN 108220441 A 7 tctgcagctt attcttgcca tgcttaggtg acagaagttt gttaagtacc atccttgtgc 1680 cctgcctctt attctcaaat cgttctggaa agcctcactt ccttttctgt ggagaaggtg 1740 caaagctgtt aaatgagctc agagtttacc tagctaaggc cac

28、tgcttcc tgctttgtga 1800 agcctggaaa gtatgtgtgg ccacagggct caggttcaca cttctgcttt gagaccagga 1860 tggggtgtaa gccatagagt aaggttaaca aaaagaataa agctaatcat gtattacaaa 1920 cagcagtgtg cccagacttg tggaaatgaa gtcatgtcac tcctctgctc agaaaccttc 1980 aatggttcac cattaccagt ggaatgaagt caattctcct cactataact gggtgtgg

29、ta 2040 gtttaagcct ataatctcag cccttttgga ggccaaggta agaggatcgc ttgaggtcag 2100 gagttcgaga ccagcttgtg caacaaagtg agagcctgtc tctacaaaaa atagtcatgc 2160 acacaaaatt agctgggcat ggtggcctgt gcctatagtc ccaactactt agaggaggat 2220 cgcttgatct caggaggttg aggctgcagt gaattatgat tgtggcattg cactccagcc 2280 tgggtggt

30、ag atcaaggctt tgtttcattt gaaaaaaaag aaagaaagaa agaaagaaag 2340 aaatcctact acgagcgatc acaccatctg gcctgaaacc acttccccag cttaggtccc 2400 tctgttatcc tgttggcctc ctatgtattg gtcaaggcag gcatctctgt tctctgaaca 2460 ttcattgcac tttcccacct ctataccttg cctgtgcctt agtgtcctct tttttccagt 2520 tcacctgtgc gaatccgacc ca

31、cctcccag agcctggctg aaacgtcact ccctgcatcc 2580 aacatctgat ctgctgagat atgtctgatc tatctctgct cgctgttctc ccgttgtttt 2640 tgcctctgcc atagagctca cctcattttg ccttgtattt ttgttacctg tgagtgtgtc 2700 tctccctatt agactgtaag cctctcgagg gtgaggccta gccttcttgt ctttgtaacc 2760 cacagcagct ggtactgtgc cttgcctatt gtaggtg

32、ccc aataaacatt tgctgaactg 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aa 2882 2 233 DNA 人类(homo sapiens) 2 cagcgatcct tccatgtgta gagtgcttag aaaccccatc aactgatcta gtgagtcaga 60 ctgtggaatc tcccttccca ctagctggag gtggaggtgg gttattacag aagtcatact 120 gggagagggt tcagtttgga tgatgctagt tagatcattt gcatctctcc accattttct 180 tctgcactcc cattttctct gcagcttatt cttgccatgc ttaggtgaca gaa 233 序列表 2/2 页 8 CN 108220441 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 108220441 A 9