一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810148124.2 (22)申请日 2018.02.13 (71)申请人 淄博职业学院 地址 255314 山东省淄博市淄博新区联通 路西首 (72)发明人 龙萍 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 张勇 (51)Int.Cl. C12N 9/42(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种酶活提高的羧甲基纤维素

2、酶突变体 (57)摘要 本发明公开了一种酶活提高的羧甲基纤维 素酶突变体， 属于酶工程技术领域。 本发明通过 定点突变的方式， 将羧甲基纤维素酶分子内部将 第31位缬氨酸替换为谷氨酸， 和/或将第135位甲 硫氨酸替换为赖氨酸， 显著提高了菌株表达羧甲 基纤维素酶的酶活力， 改造后的菌株产酶能力显 著提高， 酶活力提高至83.27U/mL94.32U/mL， 复合突变菌株pET-22b(+)-cmc-V31E/M135K酶活 提高最为显著， 153.92U/mL， 较出发菌株提高了 1.71倍， 突变体在碱性条件下的pH稳定性也有所 提高。 权利要求书1页 说明书3页 序列表5页 CN 108

3、192887 A 2018.06.22 CN 108192887 A 1.一种酶活力提高的羧甲基纤维素酶突变体， 其特征在于， 所述突变体是对氨基酸序 列如SEQ ID NO.1所示的来源于哈茨木霉的羧甲基纤维素酶蛋白质内部氨基酸进行定点突 变， 将第31位缬氨酸替换为谷氨酸， 和/或将第135位甲硫氨酸替换为赖氨酸。 2.表达权利要求1所述羧甲基纤维素酶突变体的细胞系。 3.一种重组大肠杆菌， 其特征在于， 以pET-22b(+)为载体， 以大肠杆菌BL21(DE3)为宿 主， 表达所述突变体。 4.一种酶活提高的重组大肠杆菌的构建方法， 其特征在于， 所述方法是将含有编码所 述羧甲基纤维素

4、酶突变体的基因与表达载体连接后转化至大肠杆菌中。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 以pET-22b(+)为载体、 以E.coli BL21 (DE3)为宿主表达权利要求1所述羧甲基纤维素酶突变体。 6.一种提高羧甲基纤维素酶活力的方法， 其特征在于， 将第31位缬氨酸替换为谷氨酸， 并将第135位甲硫氨酸替换为赖氨酸。 7.一种生产羧甲基纤维素酶的方法， 其特征在于， 是将权利要求3所述的重组大肠杆菌 接种至TB培养基中， 3537培养1230h。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述接种量按体积比为13； 所述菌体 至OD600为0.60.8时， 加入IPTG诱导

5、。 9.权利要求1所述羧甲基纤维素酶突变体在食品、 化工领域的应用。 10.权利要求3所述重组大肠杆菌在降解纤维素方面的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108192887 A 2 一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体 技术领域 0001 本发明涉及一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体， 属于酶工程技术领域。 背景技术 0002 羧甲基纤维素酶可作为水解酶加入预处理后的木质纤维素材料中， 将纤维素酶分 解成可发酵的单糖。 未来随着生物燃料的商业化生产， 酶的需求量将大大增加。 然而， 现今 的商业酶不仅活力低而且价格贵， 难以实现工业化应用。 所以通过筛选出纤维素酶产量高， 具有较高酶活性

6、的纤维素菌株， 是降低生物燃料成本的有效手段。 现今， 大多数的纤维素酶 都是从真菌中获得， 从真菌中获得的纤维素酶产量高、 活性高， 并且其作为胞外酶易于分离 和提取。 0003 目前报道的多数羧甲基纤维素酶表达量低， 易形成包涵体。 因此， 筛选一种酶活较 高并能高效表达的羧甲基纤维素酶对于工业化生产羧甲基纤维素酶， 及运用羧甲基纤维素 酶调节生物机体健康状况具有重要意义。 发明内容 0004 本发明所要解决的问题是提供一种酶活力提高的羧甲基纤维素酶突变体， 所述突 变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧甲基纤维素酶的氨基酸序列进行定点突变， 和/或将第31位缬氨酸替换为谷氨酸

7、， 并将第135位甲硫氨酸替换为赖氨酸， 从而提高羧甲 基纤维素酶的活性。 0005 本发明的第二个目的是提供表达所述羧甲基纤维素酶突变体的细胞系。 0006 本发明的第三个目的是提供一种重组大肠杆菌， 所述重组大肠杆菌是以pET-22b (+)为载体， 以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主， 表达所述突变体。 0007 本发明的第四个目的是提供一种酶活提高的重组大肠杆菌的构建方法， 所述方法 是将含有编码所述羧甲基纤维素酶突变体的基因与表达载体连接后转化至大肠杆菌中。 0008 在本发明的一种实施方式中， 所述方法是pET-22b(+)为载体、 以E.coli BL21 (DE3)为宿主表达所

8、述羧甲基纤维素酶突变体。 0009 本发明的第五个目的是提供一种提高羧甲基纤维素酶活力的方法， 将第31位缬氨 酸替换为谷氨酸， 并将第135位甲硫氨酸替换为赖氨酸。 0010 本发明的第六个目的是提供一种生产羧甲基纤维素酶的方法， 是将所述重组大肠 杆菌接种至TB培养基中， 37培养1230h. 0011 在本发明的一种实施方式中， 所述接种量按体积比为1。 0012 在本发明的一种实施方式中， 所述菌体至OD600为0.81.0时， 加入IPTG诱导。 0013 在本发明的一种实施方式中， 所述方法还将诱导培养后的发酵液离心， 收集菌体， 并破壁纯化获得纯酶。 0014 本发明还提供所述羧

9、甲基纤维素酶突变体在食品、 化工领域降解纤维素方面的应 用。 说明书 1/3 页 3 CN 108192887 A 3 0015 有益效果： 本发明通过定点突变的方式， 显著提高了菌株表达羧甲基纤维素酶的 酶活力， 改造后的菌株产酶能力显著提高， 酶活力提高至83.27U/mL94.32U/mL， 复合突变 菌株pET-22b(+)-cmc-V31E/M135K酶活提高最为显著， 达到153.92U/mL， 较出发菌株提高了 1.71倍， 突变体在碱性条件下的pH稳定性也有所提高， 适用于碱环境下分解纤维素材料。 具体实施方式 0016 LB培养基： 胰蛋白胨10g/L、 酵母粉5g/L、 N

10、aCl 10g/L， pH 7.0； 0017 TB培养基： 蛋白胨12g/L， 酵母膏24g/L， 甘油8g/L， 17mmol/LKH2PO4， 72mmol/L K2HPO4。 0018 羧甲基纤维素酶酶活测定方法： 酶活力及蛋白质浓度的测定羧甲基纤维素酶 (CMCase)活性的测定使用3， 5-二硝基水杨酸(DNS)法。 酶活力单位(U)定义为1min水解底物 产生1 mol葡萄糖所需要的酶量。 0019 粗酶液的制备： 将发酵液60009000rpm离心， 收集菌体后， 用0.1M、 pH 67的磷 酸盐缓冲液洗涤菌体23次， 并超声破碎5min， 离心收集上清液即为粗酶液。 002

11、0 SEQ ID NO.1对应羧甲基纤维素酶的氨基酸序列； SEQ ID NO.2对应密码子优化后 的编码羧甲基纤维素酶的基因序列； SEQ ID NO.3对应突变体V31E的氨基酸序列； SEQ ID NO.4对应突变体M135K的氨基酸序列； SEQ ID NO.5对应突变体V31E/M135K的氨基酸序列。 0021 实施例1高效分泌羧甲基纤维素酶菌株构建 0022 以SEQ ID NO.1所示氨基酸为模板， 经过密码子优化， 合成SEQ ID NO.2所示基因 cmc。 将基因cmc与载体pET-22b(+)进行连接， 连接体系： 目的基因cmc 4 L， 载体pET-22b(+) 1

12、 L， solutionI 5 L， 16过夜连接。 将连接好的重组质粒pET-22b-cmc转化到感受态细胞 E.coil JM109中， 转化氨苄青霉素LB平板， 挑取阳性菌落， 接种至LB培养基中， 37摇床过 夜培养后提取质粒， 酶切验证正确后， 转化子由上海生工进行测序。 0023 实施例2高分泌能力羧甲基纤维素酶生产菌株的验证 0024 将实施例1中测序正确的质粒， 转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。 挑选转化子接种 到LB液体培养基中， 37， 培养12h， 转接到TB培养基中， 接种量为1。 菌体长到OD6001.0时， 加入IPTG诱导， 并将培养温度降到28，

13、培养36h。 离心， 收集菌体， 检测胞内酶活。 结果显 示， 酶活力为56.75U/mL。 0025 实施例3高酶活突变体的获得 0026 利用定点突变试剂盒(TaKaRa)， 设计引物， 以已构建的pET-22b-cmc为模版， 进行 PCR， 将羧甲基纤维素酶第31位缬氨酸突变为谷氨酸， 命名为V31E， 将第135位甲硫氨酸突变 为赖氨酸， 命名为M135K。 采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收， 电泳检验回收产物 的浓度。 转化子由上海生工进行测序， 转化子命名为pET-22b(+)-cmc-V31E、 pET-22b(+)- cmc-M135K。 0027 以测序正确的菌株

14、pET-22b(+)-cmc-V31E的质粒为模版， 对羧甲基纤维素酶分子 第135位的甲硫氨酸进行复合突变， 突变为赖氨酸， 命名为V31E/M135K， 转化子由上海生工 进行测序， 转化子命名为pET-22b(+)-cmc-V31E/M135K。 0028 实施例4高产羧甲基纤维素酶生产菌株的验证 0029 将实施例3测序正确的质粒， 分别转化至E.coilBL21(DE3)， 挑选转化子接种到LB 说明书 2/3 页 4 CN 108192887 A 4 液体培养基中， 37， 200220rpm培养12h， 转接到TB培养基中， 接种量为13。 菌体培养 至OD600为0.8时， 加

15、入0.1mM IPTG诱导， 并将培养温度降到28， 培养36h。 将发酵液6000 9000rpm离心， 收集菌体后， 用0.1M、 pH 67的磷酸盐缓冲液洗涤菌体23次， 并超声破碎 5min， 离心收集上清液。 对各重组菌的酶活进行测定， 结果显示。 与出发菌株(实施例2构建 的重组菌)比较， 酶活力均有显著提高， V31E、 M135K、 V31E/M135K酶活力分别为83.27U/mL、 94.32U/mL、 153.92U/mL， 其中， 复合突变菌株pET-22b(+)-cmc-V31E/M135K的酶活较出发菌 株提高了1.71倍。 0030 实施例5高产羧甲基纤维素酶突变

16、体pH稳定性的验证 0031 按实施例4的方法制备野生酶(wt)和突变体的粗酶液， 将粗酶液以相同的量加入 至pH分为为810的磷酸盐缓冲液中， 静置30min， 测定相对酶活(以实施例4条件下测定的 酶活为100)。 结果如表1所示。 突变体M135K和V31E/M135K在pH 89的条件下均具有较高 的酶活。 0032 表1不同pH条件处理后的相对酶活 0033 0034 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 3/3 页

17、5 CN 108192887 A 5 SEQUENCE LISTING 淄博职业学院 一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体 5 PatentIn version 3.3 1 235 PRT 人工序列 1 Met Lys Leu Phe Gln Ile Leu Pro Val Ile Leu Pro Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Gln Thr Ser Cys Val Gln Tyr Ala Val Phe Thr Gly Gly Asn Gly Tyr 20 25 30 Ser Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Gln Ser Ala Gly Arg

18、Gly Phe Gly 35 40 45 Cys Ile Thr Val Asn Ser Leu Asn Ser Ala Ala Ser Trp His Ala Asp 50 55 60 Trp Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Pro Asn Val 65 70 75 80 Gln Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Ile Val Asn Ser Ile Gly Ser Met 85 90 95 Pro Thr Thr Ala Thr Trp Ser Tyr Thr Gly Ser Asn Leu Arg A

19、la Val 100 105 110 Val Ala Tyr Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Pro Asn His Val Thr Tyr 115 120 125 Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Asp Ile 130 135 140 Gly Pro Ile Gly Ser Ala Gln Gly Thr Val Asn Ile Asn Gly Gln Ser 145 150 155 160 Trp Thr Leu Tyr Tyr Gly Phe Asn Gly Ala Met Gln V

20、al Tyr Ser Phe 165 170 175 Val Ala Pro Ser Thr Val Thr Asn Trp Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe 180 185 190 Phe Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Pro Ala Ser Ser Gln Tyr 195 200 205 Val Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr 210 215 220 序列表 1/5 页 6 CN 108192887 A 6 Leu Asn Val Asn

21、Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn 225 230 235 2 700 DNA 人工序列 2 atgaaactgt tccagatcct gccggttatc ctgccggttg ctgttgctca gacctcttgc 60 gttcagtacg ctgttttcac cggtggtaac ggttactctg tttctaacaa cctgtggggt 120 cagtctgctg gtcgtggttt cggttgcatc accgttaact ctctgaactc tgctgcttct 180 tggcacgctg actggcagtg gtctggtggt c

22、agaacaacg ttaaatctta cccgaacgtt 240 cagatcgcta tcccgcagaa acgtatcgtt aactctatcg gttctatgcc gaccaccgct 300 acctggtctt acaccggttc taacctgcgt gctgttgttg cttactacct gttcaccgct 360 tctaacccga accacgttac ctactctggt gactacgaac tgatgatctg gctggctcgt 420 tacggtgaca tcggtccgat cggttctgct cagggtaccg ttaacatcaa

23、 cggtcagtct 480 tggaccctgt actacggttt caacggtgct atgcaggttt actctttcgt tgctccgtct 540 accgttacca actggtctgg tgacgttaaa aacttcttca actacctgcg tgacaacaaa 600 ggttacccgg cttcttctca gtacgttctg tcttaccagt tcggtaccga accgttcacc 660 ggttctggta ccctgaacgt taactcttgg accgcttcta 700 3 235 PRT 人工序列 3 Met Lys L

24、eu Phe Gln Ile Leu Pro Val Ile Leu Pro Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Gln Thr Ser Cys Glu Gln Tyr Ala Val Phe Thr Gly Gly Asn Gly Tyr 20 25 30 Ser Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Gln Ser Ala Gly Arg Gly Phe Gly 35 40 45 Cys Ile Thr Val Asn Ser Leu Asn Ser Ala Ala Ser Trp His Ala Asp 50 55 60 Trp Gln Trp Ser

25、Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Pro Asn Val 65 70 75 80 Gln Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Ile Val Asn Ser Ile Gly Ser Met 85 90 95 Pro Thr Thr Ala Thr Trp Ser Tyr Thr Gly Ser Asn Leu Arg Ala Val 100 105 110 Val Ala Tyr Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Pro Asn His Val Thr Tyr 序列表 2/5 页 7 CN 108192887 A

26、7 115 120 125 Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Asp Ile 130 135 140 Gly Pro Ile Gly Ser Ala Gln Gly Thr Val Asn Ile Asn Gly Gln Ser 145 150 155 160 Trp Thr Leu Tyr Tyr Gly Phe Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe 165 170 175 Val Ala Pro Ser Thr Val Thr Asn Trp Ser Gly Asp Val Ly

27、s Asn Phe 180 185 190 Phe Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Pro Ala Ser Ser Gln Tyr 195 200 205 Val Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr 210 215 220 Leu Asn Val Asn Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn 225 230 235 4 235 PRT 人工序列 4 Met Lys Leu Phe Gln Ile Leu Pro Val Ile Leu Pro Val A

28、la Val Ala 1 5 10 15 Gln Thr Ser Cys Val Gln Tyr Ala Val Phe Thr Gly Gly Asn Gly Tyr 20 25 30 Ser Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Gln Ser Ala Gly Arg Gly Phe Gly 35 40 45 Cys Ile Thr Val Asn Ser Leu Asn Ser Ala Ala Ser Trp His Ala Asp 50 55 60 Trp Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Pro Asn

29、Val 65 70 75 80 Gln Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Ile Val Asn Ser Ile Gly Ser Lys 85 90 95 Pro Thr Thr Ala Thr Trp Ser Tyr Thr Gly Ser Asn Leu Arg Ala Val 100 105 110 Val Ala Tyr Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Pro Asn His Val Thr Tyr 115 120 125 Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Lys Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Asp

30、 Ile 130 135 140 Gly Pro Ile Gly Ser Ala Gln Gly Thr Val Asn Ile Asn Gly Gln Ser 序列表 3/5 页 8 CN 108192887 A 8 145 150 155 160 Trp Thr Leu Tyr Tyr Gly Phe Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe 165 170 175 Val Ala Pro Ser Thr Val Thr Asn Trp Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe 180 185 190 Phe Asn Tyr Leu Arg As

31、p Asn Lys Gly Tyr Pro Ala Ser Ser Gln Tyr 195 200 205 Val Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr 210 215 220 Leu Asn Val Asn Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn 225 230 235 5 235 PRT 人工序列 5 Met Lys Leu Phe Gln Ile Leu Pro Val Ile Leu Pro Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Gln Thr Ser Cys Val Gln

32、 Tyr Ala Glu Phe Thr Gly Gly Asn Gly Tyr 20 25 30 Ser Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Gln Ser Ala Gly Arg Gly Phe Gly 35 40 45 Cys Ile Thr Val Asn Ser Leu Asn Ser Ala Ala Ser Trp His Ala Asp 50 55 60 Trp Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Pro Asn Val 65 70 75 80 Gln Ile Ala Ile Pro Gln Lys

33、Arg Ile Val Asn Ser Ile Gly Ser Lys 85 90 95 Pro Thr Thr Ala Thr Trp Ser Tyr Thr Gly Ser Asn Leu Arg Ala Val 100 105 110 Val Ala Tyr Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Pro Asn His Val Thr Tyr 115 120 125 Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Lys Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Asp Ile 130 135 140 Gly Pro Ile Gly Ser Ala Gln

34、 Gly Thr Val Asn Ile Asn Gly Gln Ser 145 150 155 160 Trp Thr Leu Tyr Tyr Gly Phe Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe 165 170 175 Val Ala Pro Ser Thr Val Thr Asn Trp Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe 序列表 4/5 页 9 CN 108192887 A 9 180 185 190 Phe Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Pro Ala Ser Ser Gln Tyr 195 200 205 Val Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr 210 215 220 Leu Asn Val Asn Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn 225 230 235 序列表 5/5 页 10 CN 108192887 A 10