核酸扩增.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201380031868.1 (22)申请日 2013.03.15 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104471075 A (43)申请公布日 2015.03.25 (30)优先权数据 61/635,584 2012.04.19 US 61/699,810 2012.09.11 US 61/767,766 2013.02.21 US 61/781,016 2013.03.14 US 61/792,247 2013.03.15 US (85)PCT国际申请进入国家阶

2、段日 2014.12.17 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2013/032598 2013.03.15 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/158313 EN 2013.10.24 (73)专利权人 生命技术公司 地址 美国加利福尼亚 (72)发明人 C-Y李D拉夫S-M陈 J奥尼尔R卡辛斯卡斯 J罗恩伯格 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 李程达 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) (56)对比文件 WO 2007107710 A1,2007.09.27, WO 2013045700 A1

3、,2013.04.04, Tom Morrison 等.nanoliter high throughput quantitative PCR. nucleic acids research .2006,摘要、 图1、 图4B、 第2页 左栏第2段-右栏第1段、 第5页左栏. 审查员 罗洋 (54)发明名称 核酸扩增 (57)摘要 在一些实施方案中， 本教导内容提供了用于 核酸扩增的方法， 包括形成反应混合物， 和使反 应混合物经历适合于核酸扩增的条件。 在一些实 施方案中， 用于核酸扩增的方法包括使待被扩增 的核酸经历部分变性条件。 在一些实施方案中， 用于核酸扩增的方法包括在不完全变性被扩增

4、 的核酸的情况下进行扩增。 在一些实施方案中， 用于核酸扩增的方法使用催化同源重组的酶和 聚合酶。 在一些实施方案中， 可在单个反应容器 中进行用于核酸扩增的方法。 在一些实施方案 中， 可在反应混合物的单一连续液相中进行用于 核酸扩增的方法， 而无需反应混合物的区室化或 反应组分的固定。 在一些实施方案中， 用于核酸 扩增的方法包括任选地在存在聚合物的情况下， 在等温扩增条件下在表面上扩增至少一个多核 苷酸。 聚合物可包括筛分剂和/或扩散减少剂。 权利要求书2页 说明书105页 序列表1页 附图20页 CN 104471075 B 2018.06.22 CN 104471075 B 1.用于

5、核酸扩增的非诊断目的的方法， 包括: (a)将至少两个多核苷酸分配至支持物上的多个位点中， 所述支持物包含第一固定引 物， 其中第一多核苷酸被分配至第一位点并且第二多核苷酸被分配至第二位点， 其中所述 至少两个多核苷酸具有不同的序列， 其中所述至少两个多核苷酸各自包含第一引物结合部 位和第二引物结合部位， 并且其中第一引物结合部位能杂交至第一固定引物， 第二引物结 合部位能杂交至溶液中的第二引物； (b)通过在第一固定引物和溶液中的第二引物的存在下扩增所述至少两个位点内的多 核苷酸来形成至少两个基本上单克隆的核酸群， 其中所述至少两个位点在扩增期间彼此流 体连通， 其中所述扩增发生于连续液相，

6、 其中所述扩增包括： 将所述至少两个多核苷酸与单 个反应混合物接触， 所述单个反应混合物包含： 用于核酸合成的试剂、 重组酶和一种或多种 辅助蛋白， 其中所述用于核酸合成的试剂包含聚合酶和多种核苷酸， 所述一种或多种辅助 蛋白包括重组酶载入因子和/或单链结合蛋白； 和 (c)其中所述反应混合物还包含筛分剂， 所述筛分剂限制或减缓多核苷酸扩增产物通 过反应混合物迁移。 2.权利要求1的方法， 其中在扩增期间在不完全变性所述至少两个多核苷酸的情况下 进行所述扩增。 3.权利要求1的方法， 其中所述第一位点和第二位点可操作地偶联至传感器， 并且其中 所述传感器能检测位点内核苷酸并入副产物的存在。 4

7、.权利要求3的方法， 其中反应室内的每个位点包含共形地置于该反应室内的亲水聚 合物基质。 5.权利要求4的方法， 其中所述亲水聚合物基质包括水凝胶聚合物基质， 或者其中所述 亲水聚合物基质是原位固化的聚合物基质。 6.权利要求4的方法， 其中所述亲水聚合物基质包括聚丙烯酰胺、 聚丙烯酰胺的共聚 物、 聚丙烯酰胺的衍生物或它们的组合。 7.权利要求6的方法， 其中所述聚丙烯酰胺缀合于所述第一固定引物。 8.权利要求3的方法， 其中所述传感器包括离子敏感性场效应晶体管。 9.权利要求8的方法， 其还包括使用所述离子敏感性场效应晶体管检测一种或多种核 苷酸并入副产物在位点上的存在， 其中所述检测包括

8、使用所述离子敏感性场效应晶体管检 测至少一个反应室内发生的pH变化。 10.权利要求9的方法， 其还包括将核苷酸引入位点； 和检测来自传感器的由核苷酸至 测序引物的并入而引起的输出信号， 其中所述输出信号基于离子敏感性场效应晶体管的临 阈电压。 11.权利要求1的方法， 其中所述多个位点在流动池上。 12.权利要求1的方法， 其中所述方法用于克隆地扩增所述多个位点包含的多个多核苷 酸。 13.权利要求1的方法， 其中所述多个位点在多个小珠上。 14.权利要求1的方法， 其中所述重组酶载入因子包括来自T4噬菌体的uvsY并且所述单 链结合蛋白包括来自T4噬菌体的gp32蛋白或来自T4噬菌体的经修

9、饰的gp32蛋白。 15.权利要求1-14中任一项的方法， 其中所述反应混合物包含浓度为0.1至20重量/ 权利要求书 1/2 页 2 CN 104471075 B 2 体积的筛分剂。 16.权利要求1-14中任一项的方法， 其中所述筛分剂显示在以2个重量百分比溶解于水 中时在25下测量的5厘泊至15,000厘泊的平均粘度范围。 17.权利要求1-14中任一项的方法， 其中所述筛分剂显示以2水溶液在25下测量的 10厘泊至10,000厘泊的平均粘度范围。 18.权利要求1-14中任一项的方法， 其中所述筛分剂显示以2水溶液在25下测量的 15厘泊至5,000厘泊的平均粘度范围。 19.权利要求

10、1-14中任一项的方法， 其中所述筛分剂包括多糖聚合物， 所述多糖聚合物 包括选自纤维素、 葡聚糖、 淀粉、 糖原、 琼脂、 壳多糖、 果胶或琼脂糖的一种或多种聚合物。 20.权利要求1-14中任一项的方法， 其中所述筛分剂包括纤维素衍生物。 21.权利要求20的方法， 其中所述纤维素衍生物是羧甲基纤维素钠、 羧甲基2-羟乙基纤 维素钠、 甲基纤维素、 羟乙基纤维素、 2-羟丙基纤维素、 羧甲基纤维素、 羟丙基纤维素、 羟乙 基甲基纤维素、 羟丁基甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素或羟乙基乙基纤维素。 权利要求书 2/2 页 3 CN 104471075 B 3 核酸扩增 0001 发明背景 00

11、02 核酸扩增在分子生物学中非常有用并且实际上在生物学、 治疗学、 诊断学、 法医 学和研究的每个方面都具有广泛的适用性。 通常地， 使 用一种或多种引物从起始模板产生 扩增子， 其中扩增子相应于或互补 于从其产生所述扩增子的模板。 多重扩增还可使过程简 化并减少费用。 该应用涉及用于核酸扩增和/或分析的方法和试剂。 0003 发明概述 0004 本文中提供了核酸扩增和/或分析的方法、 试剂和产物。 扩增可利 用固定的和/或 溶解的引物。 可将单组引物与不同的模板混合， 或者可 将单个模板与多种不同的引物接 触， 或者可将多种不同的模板与多种 不同的引物接触。 从本文中提供的方法产生的扩增子

12、是适合用于进一 步分析例如序列测定的底物。 0005 在一些实施方案中， 本教导内容提供了用于核酸扩增的组合物、 系统、 方法、 装置 和试剂盒。 0006 附图详述 0007 图1提供了显示模板行走(template walking)的实施方案的示 意图。 在可选择的 实施方案中， 固定的引物包含被命名为(A)n的富含 腺苷的序列， 例如(A)30， 并且模板上针 对固定引物的引物结合部位包 含互补的富含T的序列， 例如(T)30。 0008 图2描述了在小珠上通过模板行走的扩增和小珠在的平面阵列 上的堆积以用于 测序的概图。 0009 图3描述了使用合成测序的基于半导体的检测的一些可选择的

13、 实施方案。 模板行 走可用于在小珠上或在反应室的基底或底部上产生 克隆扩增子群。 在可选择的实施方案 中， 固定的引物包含被命名为(A)n的富含腺苷的序列， 例如(A)30， 并且模板上针对固定引物 的引物结合 部位包含互补的富含T的序列， 例如(T)30。 0010 图4描述了以引物草坪(primer lawn)形式在平面衬底上的固定 位点的一些可选 择的实施方案。 可使用不连续的固定位点的阵列或者 引物的单个连续草坪可被认为是固 定位点的随机阵列。 任选地， 一个 或多个固定位点在引物的连续草坪中的位置可以是还未 确定的， 其中 位置在行走之前起始模板的附着之时被确定， 或由扩增的簇所占

14、据的 空间 来确定。 在可选择的实施方案中， 固定的引物包含被命名为(A)n的富含腺苷的序列， 例如 (A)30， 并且模板上针对固定引物的引物结合 部位包含互补的富含T的序列， 例如(T)30。 0011 图5显示了温度对模板行走反应的影响。 针对反应温度计算和绘 制了模板行走扩 增之前和之后的Ct的图表。 0012 图6提供了96个双重TaqMan qPCR反应的Ct值的表。 0013 图7描述了显示了在小珠上通过模板行走进行的约100,000倍扩 增的数据。 针对 反应时间计算和绘制了模板行走反应之前和之后的 Ct和模板行走反应之前和之后的扩 增倍数。 0014 图8提供了示例性链翻转和

15、行走策略的示意图描述。 (A)模板行 走， (B)链翻转以 产生翻转的链， (C)在最终的翻转链上添加新的引物 结合序列Pg 。 说明书 1/105 页 4 CN 104471075 B 4 0015 图9描述了来自使用重组酶介导的扩增反应扩增的多核苷酸模 板的Ion TorrentTM PGM测序运行的示例性阅读长度直方图。 0016 图10描述了来自使用重组酶介导的扩增反应扩增的多核苷酸模 板的Ion TorrentTM Proton测序运行的示例性阅读长度直方图。 0017 图11描述了来自使用重组酶介导的扩增反应扩增的多核苷酸模 板的Ion TorrentTM Proton测序运行的示

16、例性阅读长度直方图。 0018 图12描述了来自使用重组酶介导的扩增反应扩增的多核苷酸模 板的Ion TorrentTM Proton测序运行的示例性阅读长度直方图。 0019 图13包括示例性测量系统的图解。 0020 图14包括示例性测量组件的图解。 0021 图15包括示例性测量组件的阵列的图解。 0022 图16包括示例性孔结构的图解。 0023 图17包括示例性孔和传感器结构的图解。 0024 图18、 图19、 图20和图21包括在通过示例性方法进行处理期 间工作件的图解。 0025 图22、 图23和图24包括在通过示例性方法进行处理期间工作件 的图解。 0026 图25、 图2

17、6和图27包括在通过示例性方法进行处理期间工作件 的图解。 0027 图28显示了根据示例性实施方案的用于核酸测序的系统的组件 的示例性方块 图。 0028 图29显示了根据示例性实施方案的集成电路装置和流动池的部 分的示例性剖面 图。 0029 图30显示了根据示例性实施方案的代表性化学传感器和相应的 反应区的示例性 剖面图。 0030 发明详述 0031 核酸模板的常规扩增通常包括使用适当的合成系统的模板(和/ 或其子代)的重 复复制。 在这样的常规方法中， 复制的每个实例通常 通过使用极端的变性条件变性待被扩 增的模板来开始， 从而使得模板 为基本上单链的。 用于常规扩增的极端变性条件的

18、一些通 常和广泛使 用的实例包括使用远高于待被扩增的核酸模板的解链温度的温度的热 变性 (例如， 常规PCR包括使用远高于90， 通常约94-95的变 性温度的热循环)， 或模板至强 力的变性剂例如NaOH、 胍盐试剂等 的暴露。 这样的方法通常需要专门的设备(例如热循环 仪)， 并且在 扩增过程期间需要额外的操作(例如用于常规PCR的退火步骤； 用于 去除化学 变性剂的洗涤步骤等等)， 从而增加了与这样的扩增相关的 成本、 工作量和时间， 以及限制 了使用这样的方法可最终获得的产率。 此外， 这样的极端变性条件通常使得待被扩增的模 板为基本上单链的， 从而为涉及多重克隆扩增(即多种不同模板在

19、相同的反应混合物内的 克隆扩增)的大量应用提出了挑战。 对于这样的多重应用， 这些极端 变性条件的使用可以 是适得其反的， 因为这通常导致模板的一条链从 其缔合位置的释放， 从而使得释放的链自 由地在溶液内迁移和污染其 它发展得紧密靠近的扩增子。 这样的交叉污染通常导致减少 的单克隆 扩增群的产率并增加多克隆污染物(通常不可用于许多的下游应用) 的产率。 需 要改进的核酸扩增方法(以及相关的组合物、 系统和试剂 盒)以消除与常规扩增方法相关 的缺陷。 说明书 2/105 页 5 CN 104471075 B 5 0032 在一些实施方案中， 本公开内容通常涉及用于核酸扩增的方法以 及相关的组合

20、 物、 系统和装置， 所述方法包括扩增核酸模板以产生包 含基本上单克隆的多核苷酸群的扩 增子。 通常认为单克隆性在核酸测 定中是期望的， 因为多克隆群内不同多核苷酸的不同特 性可使得测定 数据的解释复杂化。 一个实例涉及核酸测序应用， 其中多克隆群的存 在可 使得测序数据的解释复杂化； 然而， 许多测序系统不足以敏感到 从单个多核苷酸模板检测 核苷酸序列数据， 因此在测序前需要模板的 克隆扩增。 0033 在一些实施方案中， 本公开内容的扩增方法可用于任选地使用相 同的反应混合 物和在相同的反应混合物内克隆地扩增两个或更多个不 同的核酸模板， 以产生至少两个 基本上单克隆的核酸群。 任选地，

21、至 少一个基本上单克隆的群通过单个多核苷酸模板的扩 增形成。 0034 任选地， 两个或更多个不同的核酸模板同时地和/或平行地扩增。 0035 在一些实施方案中， 本公开内容通常涉及用于核酸合成的方法(以 及相关的组合 物、 系统和试剂盒)， 所述方法包括： 在反应混合物中 提供至少两个双链核酸模板； 和根据 本文中公开的任何方法克隆地扩 增所述至少两个双链核酸模板， 以形成至少两个基本上 单克隆的核酸 群。 0036 在一些实施方案中， 克隆地扩增任选地包括形成反应混合物。 反 应混合物可包含 连续的液相。 在一些实施方案中， 连续的液相包含单 一连续水相。 液相可包含两个或更多 个多核苷酸

22、模板， 所述多核苷酸 模板可任选地具有相同的核苷酸序列或可具有彼此不同 的核苷酸序列。 在一些实施方案中， 所述两个或更多个多核苷酸模板的至少一个可包 含 至少一个与反应混合物内的至少一个其它的多核苷酸模板基本上不 相同或基本上不互补 的核酸序列。 0037 在一些实施方案中， 两个或更多个不同的核酸模板在扩增前局限 于、 置于或位于 不同的位点。 0038 在一些实施方案中， 在溶液中， 任选地在单个反应混合物内克隆 地扩增两个或更 多个不同的核酸模板， 并且在这样的克隆扩增之后， 所得的两个或更多个基本上单克隆的 核酸群随后局限于、 置于或位于 不同的位点。 0039 不同的位点任选地是位

23、点阵列的成员。 阵列可包含在表面(例如 流动池、 电子装 置、 晶体管芯片、 反应室、 槽等的表面)上的位点二 维阵列或基质或其它媒介物(例如固体、 半固体、 液体、 流体等)内 的位点三维阵列。 0040 任选地， 两个或更多个不同的核酸模板在相同反应混合物的连续 液相， 通常地连 续水相内被扩增， 从而产生两个或更多个不同的和基 本上单克隆的多核苷酸群， 其中每一 个多核苷酸群通过存在于反应混 合物中单个多核苷酸模板的扩增来产生。 0041 任选地， 连续液相包含在反应混合物的单个相或相同相之内。 0042 在一些实施方案中， 本公开内容通常涉及用于核酸合成的方法(以 及相关的组合 物、

24、系统和试剂盒)， 所述方法包括： 提供双链核酸模 板； 和通过扩增所述双链核酸模板来 形成基本上单克隆的核酸群。 任 选地， 扩增包括克隆地扩增双链核酸模板。 0043 任选地， 扩增包括在基本上等温条件下进行至少一个扩增回合。 0044 任选地， 扩增包括在基本上等温条件下进行至少两个连续的核酸 合成循环。 0045 在一些实施方案中， 扩增包括重组酶聚合酶扩增(RPA)。 例如， 扩增可包括进行至 说明书 3/105 页 6 CN 104471075 B 6 少一个RPA回合。 0046 在一些实施方案中， 扩增包括模板行走。 例如， 扩增可包括进行 至少一个模板行 走回合。 0047 在

25、一些实施方案中， 扩增任选地包括在位点或反应室内进行两种 不同的扩增回 合。 例如， 扩增可包括以回合的任何顺序或组合在位点 或反应室内进行至少一个RPA回合 并在位点或反应室内进行至少一 个模板行走回合。 在一些实施方案中， 任一个或多个扩增 回合中的至 少两个连续循环在基本上等温条件下进行。 在一些实施方案中， 扩增 回合的 至少一个在基本上等温条件下进行。 0048 任选地， 待被扩增的核酸模板是双链的， 或在扩增前利用适当的 程序使得所述模 板为至少部分双链的。 (在本文中待被扩增的模板与 核酸模板或多核苷酸模板可互换使 用)。 在一些实施方案中， 模板是 线性的。 或者， 模板可以是

26、环状的， 或包含线性和环状区域 的组合。 0049 任选地， 双链核酸模板包含正向链。 双链核酸模板还可包含反向 链。 正向链任选 地包含第一引物结合部位。 反向链任选地包含第二引 物结合部位。 0050 在一些实施方案中， 模板已包含第一和/或第二引物结合部位。 或 者， 模板任选地 最初不包含引物结合部位， 公开的方法任选地包括在 扩增前将引物结合部位连接至或引 入模板。 例如， 方法可任选地包括 将包含引物结合部位的接头连接至或以其它方式引入模 板。 可将接头 连接至或以其它方式引入线性模板的末端或线性或环状模板的主体内。 任 选地， 在连接上或引入接头后可环化模板。 在一些实施方案中，

27、 可 将第一接头连接至或引 入线性模板的第一末端， 并且可将第二接头连 接至或引入模板的第二末端。 0051 在一些实施方案中， 扩增包括将部分变性的模板与第一引物、 与 第二引物或与第 一引物和第二引物以任意顺序或组合进行接触。 0052 在一些实施方案中， 第一引物包含第一引物序列。 第一引物任选 地包含可延伸的 末端(例如3 含OH的末端)。 可任选地将第一引物 连接至化合物(例如 “阻力标签(drag tag)” )或连接至支持物(例 如小珠或位点或反应室的表面)。 0053 在一些实施方案中， 第二引物包含第二引物序列。 第二引物任选 地包含可延伸的 末端(例如3 含OH的末端)。

28、可任选地将第二引物 连接至化合物(例如 “阻力标签” )或连接 至支持物(例如小珠或位点 或反应室的表面)。 0054 任选地， 第一引物结合至第一引物结合部位以形成第一引物-模板 双链。 第二引 物可结合至第二引物结合部位以形成第二引物-模板双链。 0055 在一些实施方案中， 扩增包括延伸第一引物以形成延伸的第一引 物。 例如， 扩增 可包括延伸第一引物-模板双链的第一引物以形成延伸 的第一引物。 0056 在一些实施方案中， 扩增包括延伸第一引物以形成延伸的第一引 物。 例如， 扩增 可包括延伸第一引物-模板双链的第一引物以形成延伸 的第一引物。 0057 任选地， 通过聚合酶进行延伸。

29、 聚合酶可以是链置换聚合酶。 0058 在一些实施方案中， 扩增包括将待被扩增的模板与重组酶接触。 0059 在一些实施方案中， 扩增包括形成部分变性的模板。 例如， 扩增 可包括部分变性 双链核酸模板。 0060 任选地， 部分变性包括使双链核酸模板经历部分变性条件。 说明书 4/105 页 7 CN 104471075 B 7 0061 在一些实施方案中， 部分变性条件包括小于核酸模板的Tm的温 度， 包括例如低于 核酸模板的Tm 5、 10、 15、 20、 25 或50的温度。 在一些实施方案中， 部分变性条 件包括高于(例如 至少5、 10、 15、 20、 25或50更高)第一引物

30、、 第 二引物或第 一和第二引物的Tm的温度。 在一些实施方案中， 部分变 性条件包括高于(例如至少5、 10 、 15、 20、 25或50 更高)第一引物结合部位、 第二引物结合部位或第一引物结合 部位和 第二引物结合部位的Tm的温度。 在一些实施方案中， 核酸模板可在 一个或两个末 端包含接头序列， 并且部分变性条件可包括高于接头序 列的Tm的温度。 在一些实施方案 中， 部分变性条件(特别地部分变 性温度)用于在 “模板行走” 过程中选择性扩增核酸模板， 如在本文中 进一步描述的。 0062 在其它实施方案中， 部分变性条件包括用一种或多种能够任选地 以序列特异性 或序列定向方式部分变

31、性核酸模板的酶处理待被扩增的 核酸模板或使其接触。 在一些实 施方案中， 至少一种酶任选地以序列 特异性方式催化链侵入和/或解旋。 任选地， 一种或多 种酶包括一种或 多种选自重组酶、 拓扑异构酶和解旋酶的酶。 在一些实施方案中， 部 分变 性模板可包括将模板与重组酶接触并形成包含重组酶的核蛋白复 合物。 任选地， 在存在第 一引物、 第二引物或第一和第二引物的情况 下将模板与重组酶接触。 部分变性可包括使用 重组酶催化链交换和将 第一引物与第一引物结合部位杂交(或将第二引物与第二引物结 合部 位杂交)。 在一些实施方案中， 部分变性包括使用重组酶进行链交换 和将第一引物与 第一引物结合部位和

32、将第二引物与第二引物结合部位 进行杂交。 0063 在一些实施方案中， 部分变性的模板包含单链部分和双链部分。 在一些实施方案 中， 单链部分包含第一引物结合部位。 在一些实施方 案中， 单链部分包含第二引物结合部 位。 在一些实施方案中， 单链部 分包含第一引物结合部位和第二引物结合部位。 0064 在一些实施方案中， 部分变性模板包括将模板与一种或多种核蛋 白复合物接触。 核蛋白复合物的至少一种可包含重组酶。 核蛋白复合 物的至少一种可包含引物(例如， 第 一引物或第二引物， 或包含与模 板中对应的引物结合序列互补的序列的引物)。 在一些实 施方案中， 部分变性模板可包括将模板与包含引物的

33、核蛋白复合物接触。 部分变 性可包 括将核蛋白复合物的引物与模板中对应的引物结合部位杂交， 从而形成引物-模板双链。 0065 在一些实施方案中， 部分变性模板可包括将模板与包含第一引物 的第一核蛋白 复合物接触。 部分变性可包括将第一核蛋白复合物的第 一引物与正向链的第一引物结合 部位杂交， 从而形成第一引物-模板双 链。 0066 在一些实施方案中， 部分变性模板可包括将模板与包含第二引物 的第二核蛋白 复合物接触。 部分变性可包括将第二核蛋白复合物的第 二引物与反向链的第二引物结合 部位杂交， 从而形成第二引物-模板双 链。 0067 在一些实施方案中， 公开的方法(及相关的组合物、 系

34、统和试剂 盒)还可包括一个 或多个引物延伸步骤。 例如， 方法可包括通过使用 聚合酶并入核苷酸来延伸引物。 0068 在一些实施方案中， 聚合酶是链置换聚合酶。 0069 任选地， 延伸引物包括将引物与聚合酶和一种或多种类型的核苷 酸在核苷酸并 入条件下进行接触。 在一些实施方案中， 一种或多种类 型的核苷酸不包含外源标记， 特别 地光学上可检测的标记， 例如荧光 部分或染料。 任选地， 反应混合物包含核苷酸， 其是天然 存在的核苷 酸。 任选地， 核苷酸不包含终止核酸合成的基团(例如双脱氧基团、 可逆终止 说明书 5/105 页 8 CN 104471075 B 8 子等)。 通常地， 延伸

35、引物以模板依赖性方式发生。 0070 任选地， 公开的方法(及相关的组合物、 系统和试剂盒)包括通 过使用聚合酶将一 个或多个核苷酸并入第一引物-模板双链的第一引 物来延伸第一引物， 从而形成延伸的第 一引物。 0071 任选地， 公开的方法(及相关的组合物、 系统和试剂盒)包括通 过任何适当的方法 (例如连接或杂交)将第二引物结合至第一延伸的 引物的第二引物结合部位。 0072 任选地， 公开的方法(及相关的组合物、 系统和试剂盒)包括通 过使用聚合酶将一 个或多个核苷酸并入第二引物-模板双链的第二引 物来延伸第二引物， 从而形成延伸的第 二引物。 0073 在一些实施方案中， 延伸第一引物

36、导致第一延伸的引物的形成。 第一延伸的引物 可包含模板的反向链序列的一些或全部。 任选地， 第 一延伸的引物包含第二引物结合部 位。 0074 在一些实施方案中， 延伸第二引物导致第二延伸的引物的形成。 第二延伸的引物 可包含模板的正向链序列的一些或全部。 任选地， 第 二延伸的引物包含第一引物结合部 位。 0075 在一些实施方案中， 在不使双链核酸模板在扩增期间经历极端变 性条件的情况 下进行方法。 例如， 可在不使核酸模板在扩增期间经历 大于或等于模板的Tm的温度的情况 下进行方法。 在一些实施方案中， 可在不使模板在扩增期间与化学变性剂例如NaOH、 尿素、 胍盐等接 触的情况下进行方

37、法。 在一些实施方案中， 扩增包括等温扩增。 0076 在一些实施方案中， 在不使核酸模板在至少两个、 三个、 四个或 多于四个的连续 的核酸合成循环期间经历极端变性条件的情况下进行 方法。 例如， 方法可包括两个、 三个、 四个或多于四个的连续的核酸 合成循环而不使核酸模板与化学变性剂接触。 在一些实施 方案中， 方 法可包括进行两个、 三个、 四个或多于四个的连续的核酸合成循环而 不使核酸 模板经历高于模板或模板群的实际或经计算的Tm(或模板 或模板群的实际或经计算的平 均Tm)之下25、 20、 15、 10、 5、 2或 1的温度。 两个、 三个、 四个或多于四个的连续的核酸合成 循环

38、可 包括介入其间的部分变性和/或引物延伸步骤。 0077 在一些实施方案中， 公开的方法(及相关的组合物、 系统和试剂 盒)还可包括将一 个或多个延伸的引物链连接至支持物。 可任选地在 扩增期间或可选择地在扩增完成后进 行连接。 在一些实施方案中， 支 持物包含多个第二引物， 并且方法可包括将至少一个延伸 的第一引物 链与支持物的第二引物杂交。 0078 在一些实施方案中， 公开的方法(及相关的组合物、 系统和试剂 盒)还可包括将一 个或多个延伸的第二引物链连接至支持物。 在一些 实施方案中， 支持物连接至第一引物。 例如， 支持物可包含多个第一 引物， 并且方法可包括将至少一个延伸的第二引物

39、与支持物 的第一引 物杂交， 从而将延伸的第二引物连接至支持物。 例如， 第一引物可杂 交至延伸的 第二引物中的第一引物结合部位。 0079 在一些实施方案中， 支持物连接至第二引物。 例如， 支持物可包 含多个第二引物， 并且方法可包括将至少一个延伸的第一引物与支持 物的第二引物杂交， 从而将延伸的第 一引物连接至支持物。 例如， 第 一引物可杂交至延伸的第一引物中的第二引物结合部位。 0080 在一些实施方案中， 支持物包含至少一个第一引物和至少一个第 二引物， 并且公 说明书 6/105 页 9 CN 104471075 B 9 开的方法(及相关的组合物、 系统和试剂盒)包括将 延伸的第

40、一引物和延伸的第二引物连 接至支持物。 0081 任选地， 支持物连接至靶特异性引物。 靶特异性引物任选地杂交 (或能够杂交)至 反应混合物内模板的第一亚组， 但不能结合至反应 混合物内模板的第二亚组。 0082 任选地， 支持物连接至通用引物。 通用引物任选地杂交(或能够 杂交)至反应混合 物内的所有或基本上所有的模板。 0083 任选地， 反应混合物包含共价地连接至第一靶特异性引物的第一 支持物和共价 地连接至第二靶特异性引物的第二支持物， 并且其中第 一和第二靶特异性引物彼此不同。 0084 任选地， 第一靶特异性引物基本上互补于第一靶核酸序列并且第 二靶特异性引 物基本上互补于第二靶核

41、酸序列， 并且其中第一和第二 靶核酸序列是不同的。 0085 在一些实施方案中， 公开的方法包括任选地在反应混合物的相同 连续相内， 在第 一支持物上通过扩增第一模板形成第一扩增子， 和在 第二支持物上通过扩增第二模板形 成第二扩增子。 第一扩增子任选地 连接或附着至第一支持物， 并且第二扩增子任选地连接 或附着至第二 支持物。 0086 公开的方法任选地包括通过克隆地扩增两个或更多个多核苷酸模 板来产生两个 或更多个单克隆或基本上单克隆的扩增子。 任选地在扩 增反应混合物的连续液相内克隆 地扩增两个或更多个多核苷酸模板。 扩增反应混合物的连续液相可包含连续水相。 在一些 实施方案中， 扩 增

42、包括产生至少两个基本上单克隆的扩增的多核苷酸群， 所述多核苷 酸 群的每一个通过单个多核苷酸模板的扩增来形成。 任选地， 克隆地 扩增包括至少一个RPA 回合。 任选地， 克隆地扩增包括至少一个模板 行走回合。 0087 在一些实施方案中， 扩增任选地包括形成包含连续液相的扩增反 应混合物。 在一 些实施方案中， 连续液相是单一的连续水相。 液相可 包含两个或更多个多核苷酸模板， 所 述多核苷酸模板可任选地彼此不 同。 例如， 两个或更多个多核苷酸模板可包含至少一个与 扩增反应混 合物内的至少一个其它的多核苷酸模板基本上不相同或基本上不互补 的核 酸序列。 0088 在一些实施方案中， 扩增任

43、选地包括形成包含具有两个或更多个 多核苷酸模板 的单一连续水相的扩增反应混合物。 扩增任选地包括通 过克隆地扩增单一水相内的两个 或更多个多核苷酸模板来形成两个或 更多个基本上单克隆的核酸群。 任选地， 克隆地扩增 包括至少一个 RPA回合。 任选地， 克隆地扩增包括至少一个模板行走回合。 0089 在一些实施方案中， 本公开内容通常涉及用于使用部分变性条件 任选地平行扩 增一个或多个核酸模板的方法(及相关地组合物、 系统 和试剂盒)。 在一些实施方案中， 任 选地以阵列形式使用这样的方法 来扩增两个或更多个模板。 任选地， 在分配至阵列中之前 在溶液中大 批扩增模板。 或者， 首先将模板分配

44、至阵列中的位点， 随后在阵列的 位点处 (或之内)原位扩增模板。 0090 任选地， 模板是单链的或双链的。 模板任选地包含一个或多个引 物结合部位。 0091 在一些实施方案中， 方法可包括使在至少一条链上包含引物结合 部位的双链核 酸模板经历至少一个使用聚合酶的基于模板的复制循环。 0092 任选地， 至少一个基于模板的复制循环包括部分变性步骤、 退火 步骤和延伸步 骤。 说明书 7/105 页 10 CN 104471075 B 10 0093 在一些实施方案中， 方法包括通过使模板经历至少两个连续的基 于模板的复制 循环来扩增双链核酸模板。 0094 在一些实施方案中， 方法包括部分变

45、性模板。 任选地， 方法包括 形成包含单链区 的部分变性模板。 部分变性模板还可包含双链区。 单 链区可包含引物结合部位。 0095 任选地， 部分变性包括使模板经历比引物结合部位的Tm低至少 20、 15、 10、 5、 2或1 的温度。 0096 任选地， 部分变性包括使模板经历与引物结合部位的Tm相同的 或高于所述Tm的 温度。 0097 任选地， 部分变性包括将双链模板与重组酶和引物接触。 重组酶 和引物可形成核 蛋白复合物的部分， 并且部分变性包括将模板与复合 物接触。 0098 在一些实施方案中， 方法包括通过使引物与单链区的引物结合部 位杂交来形成 引物-模板双链。 在一些实施方

46、案中， 待发的模板包含双 链区。 任选地， 双链区不包含引物 结合部位。 0099 在一些实施方案中， 方法包括延伸引物-模板双链的引物。 任选地， 方法包括形成 延伸的引物。 0100 在一些实施方案中， 可在不同的不连续的支持物(流入小珠或颗 粒)上克隆地扩 增不同的模板而无需在扩增前进行划分。 在其它实施 方案中， 在扩增前将模板分区或分配 至乳剂内。 任选地， 将模板分配 至微滴内， 形成具有非连续亲水相和连续疏水相的乳剂的 亲水相的部 分。 在一些实施方案中， 亲水相的乳剂微滴还包含一个或多个进行 PRA所必需 的组分。 例如， 乳剂微滴可包含重组酶。 任选地， 微滴包 含链置换聚合

47、酶。 在一些实施方案 中， 微滴包含支持物固定的引物和/ 或溶液相引物。 任选地， 引物可结合至模板或结合至其 扩增产物。 0101 在一些实施方案中， 本文公开的用于使用基于乳剂的扩增的包括 在模板的部分 变性后进行核酸合成的核酸扩增的组合物、 系统、 方法、 装置和试剂盒提供了相较于常规 扩展方法(包括牵涉传统热循环的基 于乳剂的PCR或emPCR)的有利方面。 例如， 包括基于乳 剂的RPA ( “emRPA” )或基于乳剂的模板行走的核酸扩增反应可产生更长扩增 的多核苷酸 模板、 具有更少的扩增步骤、 减少的制备扩增的多核苷酸 模板的时间和/或增加的测序数 据质量。 用于与本文中公开的

48、扩增方法 一起使用的一些适当的乳剂组合物可见于例如美 国专利号7622280、 7601499和7323305中， 上述专利通过引用整体并入本文。 0102 在一些实施方案中， 方法包括提供包含含有第一引物结合部位的 正向链、 含有第 二引物结合部位的反向链的双链模板； 部分变性模板 和形成包含含有第一引物结合部位 的单链区和至少一个双链区的部分 变性模板； 通过使第一引物与单链区的第一引物结合 部位杂交形成第 一引物-模板双链； 使用聚合酶延伸第一引物-模板双链的第一引物以 形 成包含第二引物结合部位的延伸的第一引物， 其中延伸的第一引物 至少部分杂交于模板 的正向链； 部分变性来自模板的延

49、伸的第一链以 形成包含第二引物结合部位的单链区； 使 第二引物与单链区的第二引 物结合部位杂交并形成第二引物-模板双链， 和延伸第二引 物-模板双 链的第二引物， 从而形成延伸的第二引物。 0103 在一些实施方案中， 本公开内容通常涉及用于从核酸模板合成核 酸的方法的方 法(及相关的组合物、 系统和试剂盒)， 包括： 提供包 含正向链和反向链的第一核酸双链， 其 说明书 8/105 页 11 CN 104471075 B 11 中正向链包含正向引物结合部 位并且反向链包含反向引物结合部位， 以及其中第一双链 具有第一解 链温度( “模板Tm” )， 正向引物结合部位具有第二解链温度( “正向 引物Tm”