磷氮霉素的生物合成基因簇.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102061299 A (43)申请公布日 2011.05.18 CN 102061299 A *CN102061299A* (21)申请号 201010547279.7 (22)申请日 2010.11.17 C12N 15/52(2006.01) C12P 17/06(2006.01) (71)申请人 中国科学院上海有机化学研究所 地址 200032 上海市徐汇区枫林路 354 号 (72)发明人 唐功利 陈允亮 潘海学 刘伟 赵娟 (74)专利代理机构 上海新天专利代理有限公司 31213 代理人 邬震中 (54) 发明名称 磷氮霉素的生物合成基因簇 (57) 摘

2、要 本发明公开了一种由链霉菌 Streptomyces platensis SAM-0654产生的磷氮霉素的生物合成 基因簇。整个基因簇共包含 22 个基因 ： 7 个 I 型 线性聚酮合成酶(PKS)基因 ； 2个乙基丙二酸单酰 辅酶A合成酶基因 ； 4个环己甲酰辅酶A合成酶基 因 ； 6 个后修饰酶基因 ； 2 个调节基因 ； 1 个抗性基 因。通过对上述生物合成基因簇的遗传操作可阻 断磷氮霉素的合成。本发明所提供的基因簇可用 于磷氮霉素的产量改变， 聚酮类化合物的组合生 物合成等， 也可用于寻找和发现用于医药、 工业或 农业的化合物或基因。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国

3、国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 15 页 序列表 99 页 附图 5 页 CN 102061304 A1/1 页 2 1.一种磷氮霉素的生物合成基因簇， 该基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 其中编 码磷氮霉素生物合成所涉及的 22 个基因， 包括 I 型线性聚酮合成酶基因 pn1， pn2-3， pn4， pn5， pn6， pn7， pn8共7个基因、 乙基丙二酸单酰辅酶A合成酶基因pnP5和pnP62两个基因、 环己甲酰辅酶 A 合成酶基因 pnP1， pnP2， pnP3， pnP4 共 4 个基因、 后修饰酶基因 pnT1， pnT2，

4、pnT3， pnT4， pnT5， pnT6 共 6 个基因、 2 个调节基因 pnR1 和 pnR2 以及 1 个抗性基因 pnR3。 2. 根据权利要求 1 所述的磷氮霉素的生物合成基因簇中的 I 型线性聚酮合成酶， 其特 征在于包含下述模块或结构域 ： 酮基缩合结构域 KS， 酰基转移结构域 AT， 酰基载体蛋白结 构域 ACP， 脱水结构域 DH， 酮基还原结构域 KR， 硫酯酶结构域 TE。 3. 一种根据权利要求 1 所述的磷氮霉素的生物合成基因簇的用途， 其编码蛋白用于催 化合成磷氮霉素及其类似物或者用于调节磷氮霉素及其类似物的产量。 4. 根据权利要求 3 所述的磷氮霉素的生物

5、合成基因簇的用途， 其编码蛋白催化合成乙 基丙二酸单酰辅酶 A。 5. 根据权利要求 3 所述的磷氮霉素的生物合成基因簇的用途， 其编码蛋白催化合成环 己甲酰辅酶 A。 6. 根据权利要求 3 所述的磷氮霉素的生物合成基因簇的用途， 其中的调节基因经基因 敲除后可以阻断磷氮霉素的合成， 其中的调节基因经回补到该调节基因敲除突变株中可以 恢复磷氮霉素的合成。 7. 根据权利要求 3 所述的磷氮霉素的生物合成基因簇的用途， 其中的调节基因经基因 倍增后可以用于提高磷氮霉素的产量。 权 利 要 求 书 CN 102061299 A CN 102061304 A1/15 页 3 磷氮霉素的生物合成基因

6、簇 技术领域 ： 0001 本发明属于微生物基因资源和基因工程领域， 具体涉及抗真菌、 抗肿瘤抗生素磷 氮霉素的生物合成基因簇的克隆、 分析、 功能研究及其应用。 技术背景 ： 0002 磷氮霉素 (phoslactomycins)， 其结构如图 1 所示， 是上世纪 80 年代中期由我国 沈寅初院士及其他日本学者从链霉菌 Streptomyces RK-803 发酵液中分离得到的一种聚 酮类抗生素， 其对多种植物病原菌具有显著抗菌活性。后来在其它链霉菌如 S.platensis SAM-0654、 S.SPRI-82715 和 S.platensis SANK 6091 中陆续发现了同属于磷

7、氮霉素家族的 一系列化合物， 各发酵组分的结构与来源与 Streptomyces RK-803 的磷氮霉素基本一致 J Antibiot(1989)42， 1019-1025 ； J Antibiot(1989)42， 1026-1036。 0003 1985 年首先报道了磷氮霉素类化合物具有抗植物真菌的活性， 其中磷氮霉素 A-D 表现出相同的抗真菌活性。通过制备型 HPLC 纯化得到的磷氮霉素 A 可以引起真菌菌丝体 涨水， 从而导致菌体生长受到抑制。通过传统琼脂稀释平板法发现纯化的 phosphazomycin C 具有很强的抗真菌活性。此后发现的其它磷氮霉素家族抗生素， 仅在 C-18

8、 取代基团有 差别， 也具有相同的抗真菌谱， 这也进一步说明此处取代基的差异并不影响其生物学活 性 J Antibiot(1985)38， 665-668 ； J Antibiot(1989)42， 1331-1338。 除 了 抗 真 菌 活 性， 另有报道磷氮霉素还具有抗肿瘤活性， 其作用机理也已研究得比较清楚。体外研究表 明磷氮霉素是蛋白磷酸化酶 2A(PP2A) 的高效选择性抑制剂， IC50 值变化范围从 3.7 到 5.8M( 磷氮霉素为 PP1 的弱抑制剂， IC50 1mM)， 这一活性构成了磷氮霉素类化合物 的其它生物学活性的基础， 如 NK 细胞的先天及获得性免疫力对于肿瘤

9、发展都具有重要作 用， 选择性增强 NK 细胞活性可以抑制肿瘤转移， 在小鼠体内磷氮霉素 A 和磷氮霉素 H 能 增强 NK 细胞活性， 抑制肺转移， 这一现象支持了此类化合物在 NK 细胞里具有抑制 PP2A 的 功 能 J Biochem(1999)125， 960-965 ； Curr Med Chem(2002)9， 2005-2032 ； JAm Chem Soc(2003)125， 15694-15695。近年来 Teruya et al. 利用化学遗传学方法描述了 PP2A 的 催化亚基和其抑制剂磷氮霉素 A 之间的直接作用 FEBS Lett(2005)579， 2463-24

10、68。 0004 鉴于磷氮霉素良好的生物活性， 已有通过化学全合成方法获得磷氮霉素及其类似 物的研究。 D.L.Boger等于2001年通过49步反应完成了对Fostriecin的化学全合成， 其产 率不足3J Am Chem Soc(2001)123， 4161-4167。 2003年Tohru Fukuyama课题组通过48 步反应完成了对 Leustroducsin B 的化学全合成 J Am Chem Soc(2003)125， 4048-4049。 2006 年 Yuichi Kobayashi 等完成了对 Phoslactomycin B 的化学全合成 Angew Chem Int

11、 Ed(2006)45， 3320-3323， 总产率为 0.61， 2008 年 Susumi Hatakeyama 等以 26 步反应， 总 成率1.3再次完成了Phoslactomycin B的化学全合成Org Lett(2008)10， 2139-2142。 全合成方法得到的大量结构类似物可以用于构效关系的研究等， 对药物发展具有重要意 义。然而由于这些合成路线非常复杂， 产率不高， 因此还不能真正应用到药物生产中。而 通过基因工程改造， 利用微生物发酵的方法在提高磷氮霉素的产量以及获得新的类似物方 说 明 书 CN 102061299 A CN 102061304 A2/15 页 4

12、 面都具有优势。据研究， 天然的磷氮霉素的生物合成主要包括以下步骤 ： 起始单元环己甲 酰辅酶 A 的合成， 特殊延伸单元乙基丙二酸单酰辅酶 A 的合成， I 型线性聚酮合成酶 (PKS) 负责催化的大环骨架的合成， 然后经过一系列的后修饰酶的作用形成磷氮霉素 J Biol Chem(2003)278， 35552-35557。 0005 我 们 以 链 霉 菌 来 源 的 磷 氮 霉 素 为 目 标 分 子， 从 克 隆 其 在 S.platensis SAM-0654( 购自日本微生物保藏中心， 保藏号码为 FERM BP-1668) 中的生物合成基因簇出 发， 采用微生物学、 分子生物学

13、、 生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成， 通过 体内基因操作的方法， 提高其发酵产量， 并合理修饰磷氮霉素的生物合成途径， 探索结构稳 定、 活性更好、 并能通过微生物发酵大量生产的新型磷氮霉素类化合物。 发明内容 ： 0006 本发明涉及一种由链霉菌 Streptomyces platensis SAM-0654 产生的具有抗真 菌、 抗肿瘤活性的聚酮类抗生素一磷氮霉素的生物合成基因簇的克隆、 测序、 分析、 功能研 究及其应用。 0007 本发明中整个基因簇共包含 22 个基因的核苷酸序列或互补序列 ( 序列 1)， 其中 7 个基因 (pn1， pn2-3， pn4， pn5，

14、 pn6， pn7， pn8) 用于编码 I 型线性聚酮合成酶 (PKS)， 共包含 8 个模块， 35 个功能域， 负责催化磷氮霉素聚酮链的生物合成 ； 2 个基因 (pnP5， pnP6) 编码的 蛋白负责催化乙基丙二酸单酰辅酶 A 的生物合成 ； 4 个基因 (pnP1， pnP2， pnP3， pnP4) 编码 环己甲酰辅酶 A 合成酶 ； 6 个基因 (pnT1， pnT2， pnT3， pnT4， pnT5， pnT6) 编码的蛋白负责对 聚酮链分子骨架的进一步修饰 ； 还包括 2 个调节基因 (pnR1， pnR2) ； 1 个抗性基因 (pnR3)。 0008 本发明还提供了一

15、个编码包含 AT ACP KS AT DH KR ACP 功能域的聚酮合成酶的 核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列位于序列 2 中， 命名为 Pn1， 其基因的核苷酸序列位于序 列 1 中第 43626-50951 个碱基处。 0009 本发明还提供了一个编码包含 KS AT DH KR ACP KS AT KR ACP 功能域的聚酮合 成酶的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列位于序列 3 中， 命名为 Pn2-3， 其基因的核苷酸序 列位于序列 1 中第 51069-61151 个碱基处。 0010 本发明还提供了一个编码包含 KS AT KRACP 功能域的聚酮合成酶的核苷酸序 列， 其编码的

16、氨基酸序列位于序列 4 中， 命名为 Pn4， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 11283-16271 个碱基处。 0011 本发明还提供了一个编码包含KS AT DH KR ACP功能域的聚酮合成酶的核苷酸序 列， 其编码的氨基酸序列位于序列 5 中， 命名为 Pn5， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 16314-219081 个碱基处。 0012 本发明还提供了一个编码包含 KS AT KRACP 功能域的聚酮合成酶的核苷酸序 列， 其编码的氨基酸序列位于序列 6 中， 命名为 Pn6， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 21965-26908 个碱基处。 0013 本发明

17、还提供了一个编码包含KS AT KR ACP TE功能域的聚酮合成酶的核苷酸序 列， 其编码的氨基酸序列位于序列 7 中， 命名为 Pn7， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 26973-32414 个碱基处。 0014 本发明还提供了一个编码游离硫酯酶的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列位于序 说 明 书 CN 102061299 A CN 102061304 A3/15 页 5 列 8 中， 命名为 Pn8， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 10314-11084 个碱基处。 0015 本发明还提供了一个编码酮基合成酶的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列位于序 列 9 中， 命名为

18、PnP5， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 32835-33854 个碱基处。 0016 本发明还提供了一个编码巴豆酰辅酶 A 还原酶的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序 列位于序列 10 中， 命名为 PnP6， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 35699-37051 个碱基 处。 0017 本发明还提供了一个编码环己基羧酸 - 辅酶 A 连接酶的核苷酸序列， 其编码的氨 基酸序列位于序列 11 中， 命名为 PnP1， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 61281-64283 个碱基处。 0018 本发明还提供了一个编码短链辅酶 A 脱氢酶的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列 位

19、于序列12中， 命名为PnP2， 其基因的核苷酸序列位于序列1中第64307-65473个碱基处。 0019 本发明还提供了一个编码环己甲酰辅酶 A 还原酶的核苷酸序列， 其编码的氨基酸 序列位于序列 13 中， 命名为 PnP3， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 65470-66312 个碱 基处。 0020 本发明还提供了一个编码 FAD 依赖的氧化还原酶的核苷酸序列， 其编码的氨基酸 序列位于序列 14 中， 命名为 PnP4， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 66332-68410 个碱 基处。 0021 本发明还提供了一个编码氨基转移酶的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列位

20、于序 列 15 中， 命名为 PnT1， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 42131-43228 个碱基处。 0022 本发明还提供了一个编码 NAD 依赖的差向异构酶 / 脱水酶的核苷酸序列， 其 编码的氨基酸序列位于序列 16 中， 命名为 PnT2， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 41400-42047 个碱基处。 0023 本发明还提供了一个编码 P450 氧化酶的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列位于 序列 17 中， 命名为 PnT3， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 38540-39751 个碱基处。 0024 本发明还提供了一个编码磷酸基转移酶 / 激酶的核苷

21、酸序列， 其编码的氨基酸序 列位于序列 18 中， 命名为 PnT4， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 37691-38482 个碱基 处。 0025 本发明还提供了一个编码铁氧还蛋白的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列位于序 列 19 中， 命名为 PnT5， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 37098-37328 个碱基处。 0026 本发明还提供了一个编码氧化还原酶的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列位于序 列 20 中， 命名为 PnT6， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 33919-35634 个碱基处。 0027 本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列， 其编

22、码的氨基酸序列位于 序列 21 中， 命名为 PnR1， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 68480-71296 个碱基处。 0028 本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列位于 序列 22 中， 命名为 PnR2， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 72166-75813 个碱基处。 0029 本发明还提供了一个编码转运蛋白的核苷酸序列， 其编码的氨基酸序列位于序列 23 中， 命名为 PnR3， 其基因的核苷酸序列位于序列 1 中第 39940-41151 个碱基处。 0030 序列 1 的互补序列可根据 DNA 碱基互补原则随时得到。序列 1 的核

23、苷酸序列或部 分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或 说 明 书 CN 102061299 A CN 102061304 A4/15 页 6 使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分序列 1 中 DNA 序列的重组 DNA 质粒的途径。 0031 本发明还提供了产生磷氮霉素生物合成基因被中断或加倍的微生物体的途径， 至 少其中之一的基因包含有序列 1 中的核苷酸序列。 0032 本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列， 可利用聚合酶链式反应 (PCR) 的 方法或包含本发明序列的 DNA 作为探针以 Southern 杂交等方法从其他

24、生物体中得到与磷 氮霉素生物合成基因相似的基因。 0033 包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆 DNA 可用于从链 霉菌 Streptomyces platensis SAM-0654 基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质 粒至少包含本发明中的部分序列， 也包含有 Streptomyces platensis SAM-0654 基因组中 以前邻近区域未克隆的 DNA。 0034 包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这 些途径包括插入、 置换或缺失， 聚合酶链式反应， 错误介导聚合酶链式反应， 位点特异性突 变， 不同序列的重新连接， 序列

25、的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化 (DNA shuffling)， 或通过紫外线或化学试剂诱变等。 0035 包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合 适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或得到其他致力于得到的产物。这些外 源宿主包括链霉菌、 小单孢菌、 糖多饱菌、 假单孢菌、 大肠杆菌、 芽孢杆菌、 酵母、 植物和动物 等。 0036 本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。 0037 包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些 氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性， 或者提高了产量或优

26、化了蛋白动力学特 征或其他致力于得到的性质。 0038 包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在 异源宿主中表达并通过 DNA 芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。 0039 包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成乙基丙二酸单酰辅酶 A 和环己甲酰辅酶 A 及磷氮霉素聚酮骨架， 进一步催化合成抗生素磷氮霉素。 0040 包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通 过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径， 也可以通过插入、 置换、 缺失或失活 进而获得新型生物合成途径。 0041 包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核

27、苷酸序列的克隆基因或 DNA 片段 可以通过中断磷氮霉素生物合成的一个或几个步骤而得到新的磷氮霉素结构类似物或前 体。包含 DNA 片段或基因可以用来提高磷氮霉素或其衍生物的产量。 0042 包含本发明所提供的 I 型线性聚酮合成酶可以通过缺失、 插入或失活来自于相同 或不同的 I 型线性聚酮合成酶系统的一个或多个 I 型线性聚酮合成酶结构域、 模块或基因 而产生新的聚酮化合物。 0043 本发明所提供的乙基丙二酸单酰辅酶A合成酶基因和环己甲酰辅酶A合成酶基因 可用于导入外源宿主菌产生具有相应结构单元或相似结构单元的化合物， 或其他致力于得 到的产物。 这些外源宿主包括链霉菌、 小单孢菌、 糖

28、多饱菌、 假单孢菌、 大肠杆菌、 芽孢杆菌、 说 明 书 CN 102061299 A CN 102061304 A5/15 页 7 酵母、 植物和动物等。 0044 包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来 构建 I 型线性聚酮合成酶库或 I 型线性聚酮合成酶衍生库或组合库。 0045 本发明所提供的磷氮霉素骨架的后修饰基因可用于通过遗传修饰得到磷氮霉素 类似物。 0046 总之， 本发明所提供的包含磷氮霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮 助人们理解磷氮霉素类天然产物的生物合成机制， 为进一步遗传改造提供材料和知识。本 发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来

29、寻找和发现可用于医药、 工业或农业的化合物或 基因、 蛋白。 附图说明 ： 0047 图 1 ： 磷氮霉素 (Phoslactomycins， PLMs) 的化学结构。 0048 图 2 ： 磷氮霉素生物合成基因簇的基因结构和限制性内切酶酶切谱。 0049 (A)3个交叠的粘粒包含了链霉菌S.platensis SAM-0654基因组中90kb的DNA区 域， 字母B代表限制性内切酶BamHI， 黑实体表示磷氮霉素生物合成基因簇部分 ； (B)磷氮霉 素生物合成基因簇的基因组成。 0050 图 3 ： 磷氮霉素在链霉菌 S.platensis SAM-0654 中的生物合成途径。 0051 图

30、 4 ： S.platensis SAM-0654 野生型菌株发酵产物的液相色谱 - 质谱 (LC-MS) 分 析。 0052 图 5 ： S.platensis SAM-0654 野生型菌株及 pn1 基因置换突变菌株发酵产物的高 效液相色谱 (HPLC) 分析 0053 (A) 野生型菌株 ； (B)pn1 基因置换突变体 (pn1)。 0054 图 6 ： S.platensis SAM-0654 野生型菌株及 pnT4 和 pnP3 基因置换突变菌株发酵 产物的 HPLC 分析 0055 (A) 野生型菌株 ； (B)pnT4 基因置换突变体 (pnT4) ； (C)pnP3 基因置换

31、突变体。 0056 图 7 ： S.platensis SAM-0654 野生型菌株及 pnR1 基因置换突变菌株发酵产物的 HPLC 分析 0057 (A) 野生型菌株 ； (B)pnR1 基因置换突变体 (pnR1)。 0058 图 8 ： S.platensis SAM-0654 野生型菌株及 pnR2 基因置换突变菌株发酵产物的 HPLC 分析 0059 (A) 野生型菌株 ； (B)pnR2 基因置换突变体 (pnR2) ； (C)pnR2 基因回补突变株。 0060 符号说明 ： 0061 图 1 0062 Phoslactomycin ： 磷氮霉素。 0063 图 2 0064

32、PKS ： 聚酮合酶 ； postpolyketide modification ： 聚酮后修饰 ； transporter ： 转运 蛋白 ； precursor CHC-CoA ： 前体环己甲酰辅酶 A ； precursor ethylmalonyl-CoA ： 前体乙基 丙二酸单酰辅酶 A ； regulation ： 调节基因。 0065 图 3 说 明 书 CN 102061299 A CN 102061304 A6/15 页 8 0066 LD ： 起始模块 ； M1， M2， M3， M4， M5， M6， M7 ： 模块 1， 模块 2， 模块 3， 模块 4， 模块 5，

33、模 块 6， 模块 7 ； AT ： 酰基转移酶 ； ACP ： 酰基载体蛋白 ； KS ： 酮基合酶 ； DH ： 脱水酶 ； KR ： 酮基还原 酶 ； TE ： 硫酯酶 ； CHC-CoA ： 环己甲酰辅酶 A ； m-CoA ： 丙二酸单酰辅酶 A ； Em-CoA ： 乙基丙二酸 单酰辅酶 A ； PLMs ： 磷氮霉素。 0067 图 4 0068 PLM A ： 磷氮霉素A ； PLM B ： 磷氮霉素B ； PLM C ： 磷氮霉素C ； PLM D ： 磷氮霉素D ； PLM E ： 磷氮霉素 E ； PLM F ： 磷氮霉素 F。 0069 图 5 0070 WT ： 野生

34、型 ； pn1 ： PKS 基因 pn1 置换的突变株。 0071 图 6 0072 WT ： 野生型 ； pnT4 ： 后修饰基因 pnT4 置换的突变株 ； pnP3 ： 前体合成基因 pnP3 置换的突变株。 0073 图 7 0074 WT ： 野生型 ； pnR1 ： 调节基因 pnR1 置换的突变株。 0075 图 8 0076 WT ： 野生型 ； pnR2 ： 调节基因 pnR2 置换的突变株 ； pnR2， +pnR2 ： pnR2 置换的突 变株经 pnR2 基因互补的突变株。 具体实施方式 ： 0077 以下结合图 1- 图 8 对本发明进一步详细说明。 0078 1.

35、磷氮霉素基因簇中环己甲酰辅酶 A 还原酶基因片断的克隆 ： 0079 根据发酵产物分析， S.platensis SAM-0654 发酵产物中的磷氮霉素组分与链 霉菌 Streptomyces sp.HK-803 发酵产生的 Phoslactomycin 的组分基本一致 ( 图 1， 图 4)， 属于同一类化合物， 其中都含有独特的六元环单元 J.Antibiot.(Tokyo)(1993)46， 1512-1519 ； J.Antibiot.(Tokyo)(1993)46， 1503-1511。 安 莎 三 烯 (Ansatrienin) 由 链 霉菌 Streptomyces collin

36、us 产生， 是另一个与磷氮霉素具有相同六元环单元的化合物。 Reynolds 等从 S.collinus 中克隆得到了环己甲酰辅酶 A 还原酶基因， 并在体内做了基因 中断实验， 阻断了安莎三烯的产生 ； 表达的环己甲酰辅酶 A 还原酶蛋白经体外测活证实， 能 够催化环己甲酸生物合成中三步还原反应 J.Bacteriol.(1996)178， 6873-6881。Osada 等人于 2003 年进行的同位素标记实验表明， 磷内酯霉素生物合成中的六元环起始单元是 环己甲酸来源 Tetrahedron(2003)59， 7465-7471。在同时进行的其生物合成研究中， Reynolds等利用来

37、源于S.collinus中的环己甲酰辅酶A还原酶基因作为异源探针， 克隆得 到了Phoslactomycin的生物合成基因簇J.Biol.Chem.(2003)278， 35552-35557。 利用该 基因簇中相关基因序列将有助于我们从磷氮霉素产生菌 S.platensis SAM-0654 中克隆其 基因簇。 0080 本发明人基于已有的 Streptomyces collinus 和 Streptomyces sp.HK-803 中 的环己甲酰辅酶 A 还原酶氨基酸序列， 设计了兼并性引物， 希望从 S.platensis SAM-0654 中克隆得到目标基因片段， 从而可以作为探针用于

38、基因簇的克隆。采用兼并性引物 (ChcA-For ： 5 -C TCC CTC ATC ACM GGS GCY TCG C-3 和 ChcA-Rev ： 5 -CCGTC G AC GAC 说 明 书 CN 102061299 A CN 102061304 A7/15 页 9 SAG GGT CTG MCC-3 )， 从 S.platensis SAM-0654 基因组 DNA 中 PCR 扩增得到 750bp 序列， 克隆入 pGEM-T Easy 载体， 经 DNA 序列分析表明与 Streptomyces sp.HK803 的 chcA 基因片 段具有很高同源性。 0081 2. 磷氮霉

39、素的生物合成基因簇的克隆， 序列分析及功能分析 ： 0082 将上述克隆得到的基因片段进行地高辛标记， 用于文库筛选。将筛选得到的粘粒 用 BamHI 酶切分组并对其相对位置进行关联， 选取 fCYL-2 端基 1.9kb BamHI 片段作为探针 进行染色体步移， 得到粘粒fCYL-T1-3、 fCYL-T3-10， 继续选取fCYL-T1-3端基的620bp PCR 片段作为探针进行第二次染色体步移， 得到粘粒 fCYL-VIII-14。这样经过 3 次文库筛选得 到的粘粒 fCYL-2、 fCYL-T3-10 和 fCYL-VIII-14 涵盖了染色体约 90kb 的区域。分别用 PKS

40、 引物等对几个粘粒进行 PCR 检测， 都扩增得到了特异性条带， 证实该基因簇包括我们预期 的基因。 0083 选择粘粒 fCYL-2、 fCYL-T3-10 和 fCYL-VIII-14 进行全测序， 本发明人得到了 92， 440bp 连续核苷酸序列， 生物信息学分析表明其中包含了 40 个开放式读码框 (open reading frame， ORF)， 推测其中至少有 22 个 ORF 与磷氮霉素生物合成相关。各基因功能的 分析结果见表 1。 0084 表 1 磷氮霉素生物合成基因簇功能分析 0085 说 明 书 CN 102061299 A CN 102061304 A8/15 页

41、10 0086 3. 磷氮霉素的生物合成基因簇边界的确定 ： 0087 根据基因编码的蛋白的功能分析， 通过与已有的同类化合物的生物合成基因簇的 对比， 磷氮霉素的生物合成基因簇被确定为从基因 pn8 到 pnR2( 图 2)， 涵盖染色体 65.5kb 的区域， 包含 22 个开放读码框。整个磷氮霉素的生物合成基因簇共 22 个基因， 其中 7 个 (pn1， pn2-3， pn4， pn5， pn6， pn7， pn8) 用于编码 I 型聚酮合酶 (PKS) ； 2 个 (pnP5， pnP6) 用 于编码乙基丙二酸单酰辅酶 A 合成酶 ； 4 个 (pnP1， pnP2， pnP3， p

42、nP4) 用于编码环己甲酰辅 酶 A 合成酶 ； 6 个 (pnT1， pnT2， pnT3， pnT4， pnT5， pnT6) 用于编码后修饰酶基因 ； 还包括 2 个调节基因 (pnR1， pnR2) 和 1 个抗性基因 (pnR3)。 0088 4. 磷氮霉素缩合单元中的乙基丙二酸单酰辅酶 A 的生物合成 ： 0089 根据基因簇中的基因 pnP5 和基因 pnP6 所编码的蛋白的生物信息学分析， 发现 说 明 书 CN 102061299 A CN 102061304 A9/15 页 11 pnP5 负责编码酮基合成酶 KSIII， pnP6 负责编码巴豆酰辅酶 A 还原酶 (CCR

43、)， 它们负责催化 乙基丙二酸单酰辅酶 A 合成途径中的两个关键步骤。两分子丙二酸单酰辅酶 A 在 KSIII 的 的作用下缩合得到 2 酮中间产物， 然后经外在 KR 和 DH 的作用得到巴豆酰辅酶 A， 然后在巴 豆酰辅酶 A 还原酶的作用下转化至正丁酰辅酶 A， 最后同样经外在的羧化酶羧化形成乙基 丙二酸单酰辅酶 A。 0090 5. 磷氮霉素中环己甲酸起始单元的生物合成 ： 0091 磷氮霉素基因簇中包含 4 个负责环己甲酸起始单元生物合成的基因 ： pnP1， pnP2， pnP3 和 pnP4， 它们编码的蛋白分别与 Streptomyces collinus 中的 ChcJ/K，

44、 ChcL， ChcA 和 ChcM 具有较高同源性。在 S.collinus 中， ChcJ/K， ChcL， ChcA 和 ChcM 负责环己甲酰辅酶 A 的合成 ( 莽草酸途径， Nature Biotechnology， 2000， 980)， 因此在磷氮霉素的生物合成中， 环己甲酸单元由同样的途径合成。莽草酸在 pnP1 编码的双功能酶的作用下得到 2， 4， 5- 三 羟基环己二烯甲酰辅酶 A， 然后依次经过 pnP3 编码的环己烯基甲酰辅酶 A 还原酶、 pnP2 编 码的短链辅酶 A 脱氢酶、 pnP4 编码的 2， 4- 二烯辅酶 A 还原酶以及外在的 1， 2- 二烯酰辅酶

45、 A 异构酶的作用得到环己基甲酰辅酶 A， 其中环己烯基甲酰辅酶 A 还原酶负责催化其中的 3 步反应。 0092 6. 磷氮霉素骨架合成及后修饰反应 ： 0093 磷氮霉素生物合成基因簇中有六个基因 (pn1-pn6)， 它们负责编码磷氮霉素骨架 缩合的相关酶(Pn1-Pn6)。 Pn1包括两个模块， 其中加载模块(LD)包含两个功能域(AT-CP)， AT负责将起始环己甲酸单元转移到ACP上 ； 模块一包括五个功能域(KS-AT-DH-DR-ACP)， 负 责第一个延伸单元的掺入。Pn2-3 包括两个模块， 分别包含五个功能域 (KS-AT-DH-DR-ACP) 和四个功能域 (KS-AT

46、-KR-ACP)， 负责第二个和第三个延伸单元的掺入。Pn4、 Pn5、 Pn6 和 Pn7 分别包括四个功能域 (KS-AT-KR-ACP)、 五个功能域 (KS-AT-DH-KR-ACP)、 四个功能域 (KS-AT-KR-ACP) 和五个功能域 (KS-AT-KR-ACP-TE)， 负责第四个到第七个延伸单元的掺 入。在七轮延伸后， 聚酮链在 Pn7 的 TE 功能域的水解作用下从 PKS 上释放下来， 接下来在 PnT2的作用下发生脱水， 在PnT3的作用下发生羟化， 在PnT4的作用下发生C-9羟基的磷酸 化， 在 PnT6 和 PnT1 的作用下发生氨基对 C-8 羟乙基上的羟基的

47、替换， 最终形成完整的磷氮 霉素分子。 0094 7. 磷氮霉素生物合成基因簇的应用通过对磷氮霉素生物合成基因簇中的基 因进行基因敲除可以阻断磷氮霉素的合成 0095 在克隆、 分析了完整的磷氮霉素生物合成基因簇， 研究了各基因编码蛋白的功能 的基础上， 本发明对磷氮霉素生物合成基因簇中的若干基因进行了敲除。利用同源双交 换的方法对 I 型线性聚酮合成酶 (PKS) 基因 pn1， 环己甲酰辅酶 A 合成酶基因 pnP3， 后修 饰酶基因 pnT4， 调节基因 pnR1 和 pnR2 进行了敲除实验， 结果显示相关基因敲除突变株均 不再产生磷氮霉素化合物。对调节基因 pnR2 的基因回补实验恢

48、复了磷氮霉素的合成， 说 明该调节基因在磷氮霉素的生物合成中行驶正调控的作用， 通过 pnR2 在宿主菌中的基因 倍增可以提高磷氮霉素的产量。上述基因敲除及回补实验证实了该基因簇与磷氮霉素在 S.platensis SAM-0654 中的合成相关， 通过对该基因簇的遗传操作可以阻断磷氮霉素的合 成， 同时也为进一步对生物合成基因簇进行遗传操作而获得磷氮霉素结构类似物提供了技 术基础。 说 明 书 CN 102061299 A CN 102061304 A10/15 页 12 0096 以下进一步提供实施实例， 这些实施实例有助于理解本发明， 仅用作说明而不限 制本发明的应用范围。 0097 实

49、施例 1 0098 磷氮霉素产生菌链霉菌 Streptomyces platensis SAM-0654 总 DNA 的提取 ： 0099 将 100L 1x108 Streptomyces platensis SAM-0654 孢 子 悬 液 接 种 到 3mL ISP-2( 酵母提取物 0.4， 麦芽提取物 1.0， 葡萄糖 0.4， pH 7.2) 液体培养基中， 30， 230rpm 培养约 24hr 后达到对数生长期后期， 取 2mL 接种到 50mL ISP-2 中 ( 含 25mM 氯 化镁 )， 30， 250rpm 培养约 23hr 后达到稳定生长期前期， 呈乳黄色浑浊， 将菌液 4， 3500rpm， 离心 15min 收集菌丝， 用裂解液洗涤， 收集淡乳黄色菌丝 0.5mL。向 1mL 菌丝中加 入 10mL 裂解液 ( 含溶菌酶 5mg/mL) 共四管， 涡旋至均一， 37水浴 15min。加入 0.1mL 蛋白 酶 K(10mg/mL， 用裂解液新鲜配制 )， 1mL 10十二烷基硫酸钠， 混匀后迅速放入 70水浴 15min， 呈澄清。置冰上冷却， 加入 2.5mL 5M KAc， 冰上冷却 15min。加入 10mL 饱和酚， 充分 混匀， 加入 10mL 氯仿， 混匀， 12000rpm， 4离心 20min。用破口