mo-miR-877在制备肾毒性生物标志物中的用途.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510405947.5 (22)申请日 2015.07.10 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105039536 A (43)申请公布日 2015.11.11 (66)本国优先权数据 201410328042.8 2014.07.10 CN (73)专利权人 上海益诺思生物技术股份有限公 司 地址 201203 上海市浦东新区张江高科郭 守敬路199号 (72)发明人 邱云良马璟洪敏富欣 汤纳平李华南雅萍 (74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283

2、 代理人 薛琦余化鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 WO 2012/142313 A2,2012.10.18, Caterina Vacchi-Suzzi,et al.Perturbation of microRNAs in Rat Heart during Chronic Doxorubicin Treatment. PLOS .2012,第7卷(第7期),e40395. Melissa A. Bellinger et al.Concordant Changes of Plasma and Kidn

3、ey MicroRNA in the Early Stages of Acute Kidney Injury: Time Course in a Mouse Model of Bilateral Renal Ischemia-Reperfusion. PLOS .2014,第 9卷(第4期),e93297. Tsuneo Kont， et al.A microarray analysis of urinary microRNAs in renal diseases. Clin Exp Nephrol .2013,第18卷 711-717. 审查员 曲凯 (54)发明名称 mo-miR-877在

4、制备肾毒性生物标志物中的 用途 (57)摘要 本发明公开了一种mo-miR-877在制备肾毒 性生物标志物中的用途及试剂盒和引物。 mo- miR-877可以作为唯一的肾毒性生物标志物单独 使用， 也可以与常规的肾毒性生物标志物联合使 用， 并在检测外源性化合物引起的肾损伤中发挥 作用。 所述的试剂盒能够特异性强、 可行性高地 检测肾毒性生物标志物， 从而检测外源性化合物 引起的肾损伤。 所述的引物能够特异性强地扩增 mo-miR-877， 并应用于所述的试剂盒中检测外源 性化合物引起的肾损伤。 权利要求书1页 说明书20页 序列表1页 附图2页 CN 105039536 B 2018.06.

5、29 CN 105039536 B 1.rno-miR-877在制备肾毒性生物标志物中的用途， 其特征在于， 所述的肾毒性来源于 庆大霉素引起的肾损伤。 2.如权利要求1所述的用途， 其特征在于， rno-miR-877作为唯一的肾毒性生物标志物 单独使用或者和常规的肾毒性生物标志物联合使用。 3.如权利要求2所述的用途， 其特征在于， 所述的常规的肾毒性生物标志物是血清肌 酐、 尿素氮、 尿总蛋白和/或丛生蛋白。 4.一种检测庆大霉素引起的肾损伤的试剂盒， 其特征在于， 其包括特异性检测rno- miR-877的引物， 所述的引物为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的DNA片段。

6、 5.如权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 其还包括RNA抽提试剂、 反转录试剂和/或 qPCR试剂。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的RNA抽提试剂包括TRIZOL。 7.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的反转录试剂包括RNA逆转录酶。 8.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的qPCR试剂包括DNA聚合酶。 9.一种特异性检测rno-miR-877的引物在制备检测庆大霉素引起的肾损伤的制剂中的 用途， 其特征在于， 其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的DNA片段。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105039536 B 2

7、mo-miR-877在制备肾毒性生物标志物中的用途 0001 本申请要求申请日为2014年7月10日， 申请号为201410328042.8， 发明名称为 “一 种肾毒性生物标志物及其用途” 的中国专利申请的优先权。 本申请引用该中国专利申请的 全文。 技术领域 0002 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种mo-miR-877在制备肾毒性生物标志物中 的用途及试剂盒和引物。 背景技术 0003 肾脏是体内最重要的排泄器官， 也是外源性毒物在体内的主要靶器官之一。 很多 化合物(药物)进入体内可引起肾脏毒性损伤， 据调查， 急性肾功能衰竭中有32.4是由于 药物肾毒性引起的。 因此急需建立发

8、现和确证新的肾毒性生物标志物， 能够早期发现肾损 伤， 并可以反映出肾脏损伤的改善或加重， 甚至能反映损伤的机制。 0004 当前常规的肾毒性评价方法， 非临床药物安全性评价和临床上常用的肾损伤指标 为血清肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)， 再进行病理组织学检查。 CRE易受年龄、 性别、 种族、 饮食 和机体内环境的影响， 并且无法预测早期病变， 不能反映肾小管的损伤和坏死； BUN不仅受 肾功能的影响， 还受肾外因素如高蛋白饮食、 消化道出血等的影响。 而且两者需要病人发生 急性肾损伤(AKI)几天后才有限制升高， 会延误肾毒性早期发现、 诊断和治疗。 0005 随着肾毒性研究的深入， 发

9、现了一些新的肾脏毒性损伤的检测指标， 如尿总蛋白 (uTP)、 血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)作为药物肾小球损伤的生物标记物； 丛生蛋白、 肾 损伤分子(KIM-1)、 三叶因子-3(TFF-3)可作为肾小管损伤的生物标志物， 但是存在敏感性、 特异性及检测方法的问题， 难以取代传统的肾毒性检测。 因此， 寻找及时、 可靠、 可行性强的 肾毒性的生物标记物十分有意义。 0006 miRNA是一类内源性、 非编码、 单链小RNA。 它们可以和靶基因mRNA-3 端非翻译区 (3 -UTR)部分或全部互补结合， 在翻译后水平调节基因表达， 导致靶基因出现翻译抑制或 mRNA降解。 成熟miR

10、NA大小约18到25个核苷酸。 它们首先在细胞核内转录形成初级miRNA (pri-miRNA)， 然后在由RNAase III、 Dicer和Drosha形成的蛋白复合体以及RNA聚合酶II的 作用下形成前体miRNA(pre-miRNA)。 pre-miRNA从细胞核进入细胞浆内， 被Dicer酶切为约 22个核苷酸的双链miRNA。 随后双链被切断， 形成一条成熟的单链miRNA。 单链miRNA和RNA诱 导的沉默复合体结合并选择性作用靶基因mRNA的反义互补序列， 最终调控靶基因的表达。 发明内容 0007 因此， 本发明要解决的技术问题是针对现有的肾毒性生物标记物特异性低、 不能

11、早期发现检测、 检测方法过于复杂等的问题， 提供一种mo-miR-877在制备肾毒性生物标志 物中的用途及试剂盒和引物。 所述的用途能够将mo-miR-877应用于肾毒性生物标志物的制 备从而检测外源性化合物引起的肾损伤； 所述的试剂盒能够特异性检测外源性化合物引起 说明书 1/20 页 3 CN 105039536 B 3 的肾损伤； 所述的引物能够特异性扩增用以制备肾毒性生物标志物的mo-miR-877。 0008 本发明提供rno-miR-877作为肾毒性生物标志物的用途。 0009 本发明中， 所述的rno-miR-877是一种miRNA。 本发明中， 大鼠的rno-miR-877，

12、具有 序列表中SEQ ID No.1所述的碱基序列。 0010 本发明中所述的肾毒性较佳地来源于外源性化合物引起的肾损伤。 所述的rno- miR-877作为肾毒性生物标志物可以用于检测外源性化合物引起的肾损伤。 0011 本发明所述的外源性化合物为本领域常规， 较佳的是庆大霉素(GM)、 顺铂、 N-苯基 邻氨基苯甲酸或阿霉素， 更佳的是庆大霉素。 0012 本发明中， 较佳地， rno-miR-877作为唯一的肾毒性生物标志物单独使用， 或者和 常规的肾毒性生物标志物联合使用。 优选的， 所述的常规肾毒性生物标志物是血清肌酐、 尿 素氮、 尿总蛋白和丛生蛋白。 0013 本发明rno-mi

13、R-877作为肾毒性生物标志物用于检测外源性化合物引起的肾损伤 的方法， 可以包括以下步骤， 检测肾组织中rno-miR-877的含量。 0014 本发明还提供一种检测外源性化合物引起的肾损伤的试剂盒， 其包括特异性检测 mo-miR-877的引物， 所述的引物为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的DNA片段。 0015 较佳地， 所述的试剂盒还包括RNA抽提试剂、 反转录试剂和/或qPCR试剂。 所述的 RNA抽提试剂为本领域常规的RNA抽提试剂， 较佳地为TRIZOL。 所述的反转录试剂为本领域 常规的反转录试剂， 较佳地为RNA逆转录酶。 所述的qPCR试剂为本领域常规的所述

14、的qPCR试 剂， 较佳地为DNA聚合酶。 0016 本发明还提供一种特异性检测mo-miR-877的引物， 其是核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No.2所示的DNA片段。 0017 本发明人发现， rno-miR-877在外源性化合物引起的肾损伤的大鼠血液白细胞中 高表达。 所述的血液白细胞可以来源于各个组织的血液， 较佳的， 后腹主动脉。 0018 本发明寻找肾毒性生物标志物的方法， 包括对miRNA芯片表达谱的分析， 比较雌雄 大鼠分别经外源性化合物处理的不同时间和不做任何处理的对照组的表达谱， 然后根据已 知的功能预测可能的肾毒性生物标志物。 0019 在符合本领域常识的基础上，

15、上述各优选条件， 可任意组合， 即得本发明各较佳实 例。 0020 本发明所用试剂和原料均市售可得。 0021 本发明的积极进步效果在于： 本发明的发明人发现mo-miR-877是外源性化合物引 起的肾损伤的特异性的生物标志物， 在外源性化合物引起的肾损伤的血液白细胞中高表 达， 能够发挥在制备肾毒性生物标志物中用途， 从而可以检测外源性化合物引起的肾损伤。 本发明提供的试剂盒能够特异性强、 可行性高地检测肾毒性生物标志物， 从而检测外源性 化合物引起的肾损伤。 本发明提供的引物能够特异性强地扩增mo-miR-877， 并应用于所述 的试剂盒中检测外源性化合物引起的肾损伤。 附图说明 0022

16、 图1为大鼠连续肌肉注射庆大霉素后肾脏组织病理学改变(阴性对照组D2)。 0023 图2为大鼠连续肌肉注射庆大霉素后肾脏组织病理学改变(80mg/kg组D4)。 说明书 2/20 页 4 CN 105039536 B 4 0024 图3为大鼠连续肌肉注射庆大霉素后肾脏组织病理学改变(80mg/kg组D8)。 具体实施方式 0025 本发明人以rno-miR-877为例， 通过miRNA表达谱芯片数据分析， 发现rno-miR-877 是外源性化合物引起的肾损伤的肾毒性生物标志物。 检测发现rno-miR-877在外源性化合 物引起的肾损伤的肾组织中高表达。 应用rno-miR-877为肾毒性生

17、物标志物， 可以检测外源 性化合物引起的肾损伤。 0026 下面通过实施例的方式进一步说明本发明， 但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 按照常规方法和条件， 或按照商 品说明书选择。 0027 实施例1寻找肾毒性生物标志物 0028 1.1肾损伤模型的建立 0029 1.1.1实验材料和仪器 0030 实验试剂及仪器 0031 阳性药： 硫酸庆大霉素注射液(批号： 20110406， 购自湖北制药有限公司， 规格： 2mL： 8万单位； 80mg即为8万单位)； 0032 溶媒对照品： 0.9氯化钠注射液(生理盐水)(批号11010463：

18、 购自山东长富结晶 药业有限公司) 0033 CRE(R1)(肌酐)测定试剂盒由日本和光纯药工业株式会社(Wako)生产， BUN(尿素 氮)检测试剂盒由德国罗氏诊断有限公司生产。 0034 HITACHI 7060型全自动生化分析仪购于日本日立产业株式会社。 0035 实验动物 0036 SPF级SD大鼠200只， 雌雄各半， 首次给药时体重在170230之间， 周龄在68周之 间。 动物购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司， 许可证号为SCXK(沪)2008-0016。 动物采 用苦味酸和伊红进行标识， 5只/笼， 每笼动物均有笼牌。 动物饲养于国家上海新药安全评价 研究中心的SPF级动物

19、房， 动物房温度控制在2226摄氏度， 湿度控制在4070之间， 每 分钟通气次数15次， 12小时/12小时的明暗光照周期， 动物自由摄食， 饲料为由北京科澳 协力饲料有限公司提供的钴60辐照灭菌SPF大小鼠繁殖颗粒饲料， 动物通过饮水瓶自由饮 用自制的去离子水。 0037 1.1.2实验方法 0038 1.1.2.1阳性药的配制 0039 用生理盐水将阳性药硫酸庆大霉素注射液稀释成所需浓度。 现配现用， 室温保存。 具体见表1： 0040 表1阳性药硫酸庆大霉素注射液配制表 说明书 3/20 页 5 CN 105039536 B 5 0041 0042 1.1.2.2动物试验剂量设置 00

20、43 硫酸庆大霉素注射液的临床用法为， 成人采用肌肉注射或者稀释后静脉滴注， 1次 80mg(即8万单位)或者按照体重一次11.7mg/kg， 每8小时1次， 稀释采用生理盐水或者5 葡萄糖注射液。 本实验给予硫酸庆大霉素后希望导致： .动物肾脏出现不同程度的损伤； .在不同时间出现不同程度的损伤： 轻微的至严重的肾脏损伤； .出现一定的剂量依懒 性和时间依赖性损伤。 因此本实验设置5、 20和80mg/kg组， 同时设置阴性对照组， 给予生理 盐水， 具体见表2： 0044 表2实验剂量设计 0045 0046 1.1.2.3给药及观察检查 0047 阴性对照组和硫酸庆大霉素3个剂量组的给药

21、途径均为肌肉注射， 给药部位为大 鼠左右后腿股四头肌， 每天给药1次， 给药容量为2mL/kg。 每次每只动物的左右后腿各注射 1mL/kg， 每次的给药体积均根据最近一次测得的体重计算。 0048 试验期间每天上下午各观察1次动物死亡及濒死情况。 给药期间每天观察2次临床 征状， 上、 下午各1次。 0049 给药第1、 3、 5、 7和14天给药前称重， 以及恢复期7、 14、 21和28天称重， 每次解剖前 称重仅用于计算脏器系数。 0050 在首次给药后24小时、 3天、 7天、 14天以及给药14天恢复期28天后， 每个时间点分 别取10只动物(雌性各半)， 均从颈静脉采血约0.5m

22、L， 以1660g离心15min后吸取上清液， 用 尿素酶法检测BUN、 肌酐酶法检测CRE浓度。 0051 1.1.2.4血清生化检测结果 0052 给药1天(D2)和3天(D4)后， 给予庆大霉素组动物的血清BUN和CRE均值与阴性对照 说明书 4/20 页 6 CN 105039536 B 6 组相比均未见明显统计学差异。 给药7天(D8)后， 5和20mg/kg组的血清BUN和CRE均值与阴性 对照组相比均未见明显统计学差异， 而80mg/kg组的雌性动物的血清BUN和CREA均明显高于 阴性对照组(P0.05)， 雄性动物血清CRE也明显高于阴性对照组(P0.05)。 给药14天(D

23、15) 后， 5mg/kg组雌雄动物的血清BUN和CRE均值也仍未见明显差异， 20mg/kg组雌性动物的血清 CRE明显高于同期阴性对照组(P0.05)， 20mg/kg组雄性动物的血清BUN和CRE与阴性对照组 相比未见明显差异， 而80mg/kg组雌雄性动物的血清BUN和CRE均明显高于阴性对照组(P 0.05)， 结果见表3， 表4。 0053 给药14天恢复期28天(R29)后， 5和20mg/kg组雌雄动物的血清BUN和CRE与阴性对 照组相比均未见明显统计学差异。 80mg/kg组雌雄性动物的血清CRE均值均明显低于阴性对 照组(P0.05)， 而血清BUN均值与阴性对照组相比均

24、未见明显异常。 0054 表3雌性动物肌肉注射庆大霉素后血清生化结果 0055 0056 0057 *P0.05,*P0.01， 与0mg/kg组比较； BUN单位mmol/L； CRE单位umol/L； D： 给药天 数， R恢复天数。 0058 表4雄性动物肌肉注射庆大霉素后血清生化结果 说明书 5/20 页 7 CN 105039536 B 7 0059 0060 *P0.05,*P0.01， 与0mg/kg组比较； BUN单位mmol/L； CRE单位umol/L； D： 给药天 数， R恢复天数。 0061 1.1.2.5组织病理学检查结果 0062 组织病理学的改变见图1-3。 给

25、药1天后， 阴性对照组和各剂量组动物肾组织病理 学未见明显与给药相关的改变(图1)； 给药3天后， 阴性对照组和5mg/kg组动物肾组织病理 学未见明显与给药相关的改变， 20和80mg/kg组部分雌雄动物肾可见轻微至轻度局灶性肾 小管扩张(图2)， 其余未见明显异常； 给药7天和14天后雌雄动物肾组织病理学改变类似， 阴 性对照组和5mg/kg组动物肾均未见明显给药相关的改变， 20mg/kg组雌雄动物均可看到部 分动物轻微至轻度的炎细胞浸润， 轻微至轻度的局灶性肾小管扩张等轻微的改变， 80mg/kg 组所有动物可见明显的局灶性肾小管上皮细胞变性坏死， 局灶性肾小管嗜碱性变， 不同程 度的

26、炎细胞浸润， 不同程度的局灶性肾小管扩张以及不同程度的局灶性管型等异常改变 (图3)； 给药14天恢复28天组， 阴性对照组、 5和20mg/kg组未见明显与给药有关的异常， 但各 组均偶见自发的轻微炎细胞浸润、 轻微嗜碱性小管等病变， 高剂量组雌雄动物仍可见局灶 性炎细胞浸润和不同程度的嗜碱性小管及肾小管管型。 0063 1.1.2.6结论 0064 本部分实验采用SD大鼠肌肉注射给予庆大霉素5、 20和80mg/kg和生理盐水对照， 同时设置给药1天(D2)、 3天(D4)、 7天(D8)、 14天(D15)和给药14天恢复28天(R29)后五个时 间点采血进行血清生化检测、 大体解剖观察

27、、 肾脏称重和组织病理学观察， 以观察庆大霉素 诱导的肾损伤情况。 0065 血清生化检测， 给药7天(D8)后， 80mg/kg组动物BUN和CRE均升高。 给药14天(D15) 后， 80mg/kg组动物BUN和CRE均升高， 20mg/kg组动物CRE也升高。 给药14天恢复28天(R29)后 BUN和CRE末可基本恢复。 说明书 6/20 页 8 CN 105039536 B 8 0066 病理组织学检查主要可见肾小管的损伤， 包括坏死、 肿胀、 脱落等。 肾组织病理学 检查发现， 给药3天(D4)后， 20和80mg/kg组肾见局灶性肾小管扩张； 给药7天(D8)和14天 (D15)

28、后， 20mg/kg组肾脏见炎性细胞浸润和局灶性肾小管扩张， 80mg/kg组肾见局灶性肾小 管上皮细胞变性坏死、 炎性细胞浸润、 局灶性管型(轻度)等。 给药14天恢复28天(R29)后， 仅 见80mg/kg组肾见嗜碱性小管、 肾小管管型。 0067 综上可见， SD大鼠肌肉注射给予庆大霉素后成功地诱导大鼠肾损伤， 并且出现了 明显的时间依赖性和剂量依赖性的改变， 因此庆大霉素诱导肾损伤模型成立， 可用于肾毒 性生物标志物进一步探索。 0068 1.2miRNA表达谱芯片的制备 0069 1.2.1取样 0070 分别取相同品种属种、 年龄相近大小均一一致的正常大鼠和已经建立好的肾损伤 模

29、型中有肾损伤的大鼠各三只。 大鼠解剖后立刻去肾脏称重， 称重后取约0.5*0.5cm大小的 肾脏组织， 立刻加入至装有约1mL RNAlater液的4预冷过夜的EP管， 并剪成小块， 再放入4 冰箱， 使其充分浸润， 随后转入-80保存备用。 0071 1.2.2总RNA的提取 0072 采用mirVanaTM PARISTM(Cat#AM1556,Ambion,Austin,TX,US)并且根据生产厂商 提供的标准操作流程进行样品的total RNA抽提， 抽提所得total RNA经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies,Santa Cl

30、ara,CA,US)电泳质检合格后备用。 0073 操作步骤如下： 0074 (1)配制70乙醇： 35mL无水乙醇与15mL无核酸酶水混匀。 0075 (2)离心均应4条件下进行， 离心速度为13200rpm。 0076 (3)匀浆： 每100mg组织加入1mL TRIZOL试剂， 并用匀浆器匀浆。 0077 (4)取已经加入1mL的TRIZOL的白细胞； 0078 (5)每1mL的TRIZOL， 加入约1/5体积的氯仿， 上下颠倒充分混匀1min左右， 室温静 置5min。 离心15min。 小心取出上清液， 避免触及中间层， 将上清夜转入新的1.5mL离心管， 加 入等体积的异丙醇， 轻

31、轻颠倒混匀， 室温静置5min。 离心15min吸去上清， 保留沉淀， 并向沉 淀中加入1mL 70乙醇， 离心10min洗涤沉淀。 吸去上清， 沉淀室温自然晾干后适量无RNA酶 的水， 用Tip头吹吸， 充分溶解沉淀。 0079 (6)样品储存在-80。 0080 1.2.3RNA质量鉴定 0081 使用NanoDrop ND-1000分光光度计测量RNA浓度。 使用Agilent 2100Bioanalyzer 验证RNA质量。 结果显示所有样品均合格， 可用于RT-PCR和芯片杂交分析。 0082 1.2.4miRNA标记和纯化 0083 实验样品RNA采用Agilent miRNA芯片

32、配套的试剂盒， miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Cat#5190-0456,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)， 对样品中的 miRNA分子进行荧光标记。 0084 操作步骤如下： 使用前稀释Spike-In溶液； Dephosphorylation去磷酸化； 按如下 所示的顺序配制去磷酸化混合液： 说明书 7/20 页 9 CN 105039536 B 9 0085 0086 取上述的混合液2 L至样本管中， 总体积为4 L。 混匀， 离心， 置于37金属浴中孵 育30min； 样本变性： 在每管样本中添加2

33、.8 L 100DMSO， 置于100金属浴中孵育7min； 连 接： 冰上， 按如下所示配制连接反应混合液： 0087 0088 取4.5 L反应混合液移至样本管中， 总体积为11.3 L， 混匀， 离心， 16孵育2小时； 干燥样本： (1)16孵育2小时反应结束后， 需彻底干燥样本； (2)45真空浓缩仪中抽干3小 时。 0089 1.2.5芯片杂交和洗涤 0090 按照Agilent miRNA芯片配套提供的标准操作流程和配套试剂盒， miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Cat#5190-0456,Agilent technologies,Santa

34、 Clara, CA,US)的杂交部分， 进行样品的杂交实验。 在滚动杂交炉中， Hybridization Oven(Cat# G2545A,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)， 55， 20rpm， 滚动杂交20小时。 杂交 完成后在洗缸staining dishes(Cat#121,Thermo Shandon,Waltham,MA,US)中洗片， 洗片 所用的试剂为Gene Expression Wash Buffer Kit(Cat#5188-5327 ,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)。 00

35、91 操作步骤如下： 0092 准备杂交样本 0093 1、 如下将抽干的样本重新溶解在22.5 L混合液中； 0094 0095 2、 每管中加入22.5 L 2Hi-RPM Hybridization Buffer， 轻微涡旋混匀； 0096 3、 100金属浴中孵育5min； 0097 4、 反应结束后， 迅速将其转至冰水浴中冷却5min； 0098 5、 离心收集反应液并立即进行下面的步骤。 0099 准备杂交装置 说明书 8/20 页 10 CN 105039536 B 10 0100 1、 缓慢吸取45 L反应液至围栏中央； 0101 2、 将芯片点样面(带有 “Agilent”

36、字样面)朝下缓慢放置在盖片上； 0102 3、 将组装好的杂交仓放置在杂交炉的架子上， 温度设定在55， 转速为20rpm； 0103 4、 杂交20小时。 0104 芯片洗涤 0105 具体的洗涤时间和温度如下： 0106 0107 0108 1.2.6芯片扫描 0109 芯片结果采用Agilent Microarray Scanner(Cat#G2565BA， Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)进行扫描， 用Feature Extraction software10.7 (Agilent technologies,Santa Clara,CA,U

37、S)读取数据， 最后采用Gene Spring Software 11.0(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)进行归一化处理， 所用的算法为 Quantile。 0110 具体设置扫描参数如下： 0111 0112 1.2.7芯片实验质控 0113 变异系数(CV值)是通过两组数据之间的比较分析来判断该体系是否是稳定的。 本 芯片用重复探针点(10次重复)信号的CV值来计算芯片的稳定性和技术的稳定性。 结果显 示， 除个别样品外， 大部分样品的CV值均控制在10以内， 结果可靠， 可用于进一步分析。 0114 1.3miRNA表达谱芯片的分析与肾毒性

38、生物标志物的确定 0115 1.3.1差异miRNA的筛选 0116 采用Gene Spring Software 11.0(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US) 说明书 9/20 页 11 CN 105039536 B 11 对每个时间点各组间进行主成分分析(Principle component analysis， PCA)， 同时对组内 动物进行相关性分析等。 组间差异miRNA的选择采用倍数变化(Fold changes， FC)大于2或 者小于0.5且P0.05。 对所选的差异miRNA同时进行聚类分析。 0117 miRNA可以结合在靶基因

39、的3 UTR， 下调靶基因。 miRNA靶基因预测利用TargetScan 数据库、 miRbase数据库、 PicTar数据库、 MirTarget 2.0以及PITA数据库关联microRNA的靶 基因。 由于不同数据库有很多相同的靶基因， 因此本实验采用去除重复的靶基因方法， 留下 合并的靶基因结果进行后续的分析。 0118 1.3.2GO分析 0119 对于预测的靶基因采用由上海生物芯片公司提供的在线SAS软件(http:/ sas.ebioservice.)， 基于GO的在线数据库(http:/www.geneontology.org/)对DEGs进行 生物学过程的GO分类分析， 包

40、括DEGs的GO功能注释和GO功能富集分析。 本研究中主要列出 的是生物学过程的分类。 0120 miRNA-GO Network利用靶基因的功能注释与miRNA-mRNA靶向调控关系， 构建 miRNA功能调控的网络图。 网络图可发现miRNA调控的多种基因功能， 并通过网络分析， 希望 得到核心调控miRNA以及miRNA调控的核心基因功能。 0121 1.3.3Pathway分析 0122 对于预测的靶基因采用上海生物芯片公司提供的在线SAS软件对差异基因进行生 物学通路(Pathway)分析， Pathway分析主要包括靶基因的KEGG代谢通路、 BioCarta或细胞 信号转导通路(

41、Signal Pathway)Pathway富集分析图等， 但在本文中主要列出了KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， http:/www.genome.adjp/kegg)的分析结 果。 0123 同时进行miRNAPathway Network的工作， miR-Pathway Network与miR-GO Network类似， 利用靶基因的Pathway间相互作用关系， 与microRNA-mRNA靶向调控关系， 构 建miR-Pathway调控的网络图。 网络图可发现MicroRNA调控的多种信号通路， 并通过网络分 析， 得到核心调

42、控microRNA以及microRNA调控的核心信号通路。 0124 1.3.4芯片分析结果 0125 1.3.4.1概述 0126 由表1可见， 差异miRNA的选择标准不一， 差异的miRNA数也有差别， 但是整体的趋 势一致。 本实验采用FC大于2或者小于0.5且P0.05， 不同时间点动物差异miRNA基因， 给药1 天后(D2)雌雄动物的差异miRNA数分别为9和8个， 给药3天后(D4)雌雄动物的差异miRNA数 均为7个， 给药7天后(D8)雌雄动物的差异miRNA数分别为28和9个， 给药14天后(D15)雌雄动 物的差异miRNA数分别为44和51个， 给药14天恢复28天后

43、(R29)雌雄动物的差异miRNA数分 别为13和11个。 可见差异的miRNA数也随着给药时间的增加而增加， 其中给药14天后的差异 miRNA数量最多。 而恢复28天后， 差异miRNA数量接近给药1天后的数量。 进一步在P0.05的 条件下， 对D2、 D4、 D8和D15的肾脏差异miRNA进行交集分析， 雌雄动物的差异miRNA数分别发 现7和8个。 0127 表1庆大霉素诱导肾损伤后对大鼠肾脏miRNA差异数 说明书 10/20 页 12 CN 105039536 B 12 0128 说明书 11/20 页 13 CN 105039536 B 13 0129 说明书 12/20 页

44、 14 CN 105039536 B 14 0130 0131 2mean3表示FC大于2， 且平均的信号值大于3。 0132 1.3.4.2GO分析结果 0133 给予庆大霉素后， 于D2、 D4、 D8、 D15和R29时间点取大鼠肾脏， 并与阴性对照组比较 说明书 13/20 页 15 CN 105039536 B 15 获得差异miRNA。 差异miRNA的靶基因数非常多， 对靶基因进行GO分析和KEGG通路分析， 可能 注释到所有的功能和通路， 因此集中对D4、 D8和D15时间点进行交集， 并对交集的差异miRNA 预测的靶基因进一步作GO分析和KEGG通路分析。 0134 表2庆

45、大霉素诱导肾损伤后对大鼠肾脏差异miRNA预测的靶基因数 0135 0136 雌性动物各时间点交集的差异miRNA之一为rno-miR-877(其核苷酸序列如序列表 中SEQ ID No.1所示)， 其调控的靶基因的核心基因功能主要为氮磷化合物代谢、 RNA代谢和 转录、 蛋白激酶调节、 基因表达调控、 胚胎生长发育等(表3)。 0137 雄性动物各时间点交集的差异miRNA之一为rno-miR-877， 其调控的靶基因的核心 基因功能主要为氮磷化合物代谢、 RNA代谢和转录、 蛋白激酶调节、 胚胎生长发育、 神经元发 育分化等， 可见雌雄动物的涉及到的主要基因功能类似(表4)。 0138 表

46、3雌性动物各时间点交集的靶基因GO分析 说明书 14/20 页 16 CN 105039536 B 16 0139 说明书 15/20 页 17 CN 105039536 B 17 0140 0141 表4雄性动物各时间点交集的靶基因GO分析 0142 说明书 16/20 页 18 CN 105039536 B 18 0143 0144 1.3.4.3Pathway分析结果 0145 由表5可见， 雌性大鼠交集miRNA的靶基因富集的生物学通路的改变， 主要涉及癌 症信号通路， 如前列腺癌、 小细胞肺癌， 黑素生成、 细胞周期、 朊病毒疾病、 MARK信号通路等。 0146 由表6可见， 雄性

47、大鼠交集miRNA的靶基因富集的生物学通路的改变， 主要也涉及 癌症信号通路， 如前列腺癌、 肾细胞癌、 小细胞肺癌， 黑素生成、 细胞周期、 吞噬作用、 MARK、 p53、 TGF- 和T细胞受体信号通路、 蛋白分解、 白细胞移动等。 可见雌雄动物的涉及到的生物 学通路类似。 0147 表5雌性动物各时间点交集的靶基因的Pathway分析 0148 说明书 17/20 页 19 CN 105039536 B 19 0149 0150 表6雄性动物各时间点交集的靶基因的Pathway分析 0151 说明书 18/20 页 20 CN 105039536 B 20 0152 0153 1.3.

48、4.4总结 0154 本实验肾组织的miRNA芯片结果显示， 每个组动物的miRNA表达模式是相近的， 每 组内样品的相关性比全基因表达检测结果稍差， 可能是由于miRNA数较少有关。 但是本实验 给药14天后(D15)的动物miRNA表达模式与阴性对照组动物的表达模式相差最远， 其次给药 7天后(D8)的动物miRNA表达模式。 差异miRNA数也随着给药时间的增加而增加， 而恢复28天 后， 差异miRNA数量接近给药1天后的数量， 可见miRNA的改变与给予庆大霉素损伤肾脏有关 联。 0155 肾组织每个时间点差异miRNA的靶基因数非常多， 但是对雌性动物各时间点交集 的差异miRNA

49、之一为rno-miR-877， 调控的靶基因的核心基因功能主要为氮磷化合物代谢、 RNA代谢和转录、 蛋白激酶调节、 基因表达调控、 胚胎生长发育等。 而雄性动物各时间点交集 的差异miRNA之一为rno-miR-877， 调控的靶基因的核心基因功能与雌性动物类似。 进一步 的通路分析显示， 雌性主要涉及癌症信号通路， 如前列腺癌、 小细胞肺癌、 黑素生成、 细胞周 期、 朊病毒疾病、 MARK信号通路等。 而雄性大鼠主要也涉及癌症信号通路， 如前列腺癌、 肾细 胞癌、 小细胞肺癌、 黑素生成、 细胞周期、 吞噬作用、 MARK、 p53、 TGF- 和T细胞受体信号通路、 蛋白分解、 白细胞移动等。 可见雌雄动物涉及到的生物学通路类似。 可见上述的差异miRNA 可以为检测肾毒性的新生物标志物， 尤其是雌雄动物共有差异的rno-miR-877。 0156 实施例2检测肾损伤大鼠中血液中mo-miR-877的表达量 0157 取实施例1中， 给药(80mg/kg， 庆大霉素)7天后的大鼠三只和相同品种正常生长的 大鼠三只。 分别抽取它