细胞穿透肽转染试剂及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410275600.9 (22)申请日 2014.06.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104262466 A (43)申请公布日 2015.01.07 (73)专利权人 山西国信凯尔生物技术有限公司 地址 030006 山西省太原市国家高新技术 产业开发区佳华街7号帅科大厦 (72)发明人 崔雪萍段建雄韩丽 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所(普通合伙) 11350 代理人 汤东凤 (51)Int.Cl. C07K 14/00(200

2、6.01) C12N 15/87(2006.01) (56)对比文件 CN 103096932 A,2013.05.08, WO 2011157715 A1,2011.12.22, 李凤英， 等.细胞穿透肽的研究进展. 中国 新药杂志 .2013,第22卷(第15期), 审查员 苏林 (54)发明名称 细胞穿透肽转染试剂及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种细胞穿透肽转染试剂及 其应用， 所述的细胞穿透肽转染试剂是由23个氨 基酸组成的肽链， 其氨基酸序列为SEQIDNO.1。 本发明的细胞穿透肽转染试剂不仅具备结构简 单， 高转染效率和细胞毒性小的特点， 而且转染 时无需进行培养基更换操作

3、， 尤其适合各种高通 量细胞筛选实验， 方便， 快速， 高效。 该试剂的这 些特点创造性地解决了高效输送各种核酸分子 到达目的地的难题。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图1页 CN 104262466 B 2017.11.24 CN 104262466 B 1.一种细胞穿透肽转染试剂， 其特征在于所述的细胞穿透肽转染试剂是由23个氨基酸 组成的肽链， 其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。 2.根据权利要求1所述的细胞穿透肽转染试剂， 所述的细胞穿透肽转染试剂是通过固 相肽合成法获得的。 3.权利要求1或2所述的细胞穿透肽转染试剂在核酸分子转染中的应用。 4.根据权利要求3所述应用

4、， 所述的转染在转染时无需进行培养基更换操作。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104262466 B 2 细胞穿透肽转染试剂及其应用 技术领域 0001 本发明属于分子生物学技术领域， 具体而言， 涉及一种细胞穿透肽转染试剂及其 应用。 背景技术 0002 细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障， 它保证了细胞内环境的相对稳 定。 也正是因为细胞膜的生物屏障作用阻止了许多生物大分子物质进入细胞内， 从而很大 程度地限制了这些物质在治疗领域的应用。 因此， 如何引导这些物质穿透细胞膜是一个迫 切需要解决的问题。 0003 介导生物大分子穿透细胞膜的方法主要包括细胞穿透肽(cell pene

5、trating peptides， CPPs)、 脂质体(liposome)、 腺病毒(adenovirus)、 纳米颗粒(nanoparticle)等。 其中， 细胞穿透肽是一类以非受体依赖， 非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽， 它富含碱性氨基酸， 氨基酸序列通常带正电荷。 细胞穿透肽的一个重要特点是可以携带多 种不同大小和性质的生物活性物质进入细胞， 包括小分子化合物、 染料、 核酸、 质粒DNA、 siRNA、 多肽、 蛋白质等。 细胞穿透肽作为载体的优势在于低毒性和无细胞类型的限制， 这一 性质为其成为靶向药物的候选载体提供了可能。 其实际应用多集中于各种大分子物质， 包 括

6、siRNA和质粒DNA的细胞转运。 0004 目前被广泛应用的细胞穿透肽包括TAT肽(HIV-1的TAT蛋白功能区)， 穿膜肽 (transportan)， 寡聚精氨酸poly(arginine)9,R9， MPG(融合HIV-1 gp41的蛋白功能区和 SV40T抗原的核定位序列)等， 尽管细胞穿透肽本身可以快速和高效的进入细胞， 但其实际 应用中的主要问题在于如何优化设计细胞穿透肽， 使其能有效的结合siRNA或质粒DNA， 高 效的进入细胞， 快速摆脱内涵体或溶酶体导致的降解， 将siRNA或质粒DNA传递到相应的细 胞内的作用部位。 然而， 现有的细胞穿透肽转染试剂转染效率不高， 因此

7、如何获得高效的细 胞穿透肽转染试剂是本领域的技术人员亟待解决的技术问题。 发明内容 0005 为了克服现有技术特缺陷， 本发明提供一种新型的细胞穿透肽转染试剂及其应 用。 为了实现本发明的目的， 拟采用如下技术方案： 0006 本发明涉及一种细胞穿透肽转染试剂， 其特征在于所述的细胞穿透肽转染试剂是 由23个氨基酸组成的肽链， 其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。 0007 在本发明的一个优选实施方式中， 所述的细胞穿透肽转染试剂是通过固相肽合成 法获得的。 0008 本发明另一方面还涉及所述的细胞穿透肽转染试剂核酸分子转染中的应用。 0009 在本发明的一个优选实施方式中， 所述的转染在转

8、染时无需进行培养基更换操 作。 0010 本发明的细胞穿透肽转染试剂不仅具备结构简单， 高转染效率和细胞毒性小的特 说明书 1/3 页 3 CN 104262466 B 3 点， 而且转染时无需进行培养基更换操作， 尤其适合各种高通量细胞筛选实验， 方便， 快速， 高效。 该试剂的这些特点创造性地解决了高效输送各种核酸分子到达目的地的难题。 附图说明 0011 图1： FITC萤光标记的细胞穿透肽广泛分布于细胞浆内呈绿色荧光。 (B， 20 gFAM- 标记的细胞穿透肽与180 L细胞培养基混合后加入到A549细胞中； A.作为对照， 相同量的 PBS溶液与PBS混合后加入到A549细胞中，

9、细胞核由DAPI染色后呈现蓝色。 ) 0012 图2： 细胞穿透肽介导的DY547萤光标记的siRNA广泛分布于细胞浆内呈红色荧光。 B为细胞穿透肽与180 L细胞培养基混合后加入到A549细胞中。 作为对照， 相同量的PBS溶液 与PBS混合后加入到A549细胞中， 细胞浆中无红色荧光显现。 细胞核由DAPI染色后呈现蓝色 (A)。 具体实施方式 0013 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。 0014 实施例1： 0015 多肽合成 0016 多肽合成之后， 在美国金斯特科技股份有限公司(Piscataway,NJ)利用高效液相 色谱法进行纯化(纯度95)。 配制FAM(0.1mM)、

10、 二异丙基乙胺(0.5mM)和二氨基甲酰胺 (DMF)混合液， 将树脂固定的多肽(0.1mM)在混合液中孵育12h， 使得荧光素集团(FAM)通过 氨基乙酸标记在多肽的N端。 在色谱柱C18中利用反相高效液相层析法对多肽混合物进行分 析纯化后， 将纯化的多肽利用电喷雾电离质谱法(ESI-MS)分析。 0017 siRNAs合成 0018 抗PPIB蛋白的DY547标记的siRNA由赛默飞世尔科技合成。 DY547标记的对照siRNA 购买自赛默飞世尔科技Dharmacon。 0019 细胞穿透肽在A549细胞中的转运(图1) 0020 将20 l FAM标记的细胞穿透肽加入到180 l的培养基

11、(DMEM)中， 随后将混合液加 入到A549细胞中。 作为对照组， 利用等量的PBS将细胞穿透肽代替。 37下， 将A549细胞培养 24h， 利用荧光显微技术进行观察。 0021 在小鼠NRK52细胞中由细胞穿透肽介导的siRNA转运 0022 常温下， 将100nM抗PPIB的siRNA和对照siRNA/多肽分别在混合液DMEM+2mM谷氨 酰胺+1非必需氨基酸(NEAA)+5-10胎牛血清(FBS)， Life Technologies中共同孵育 15min。 同时， 将胶原蛋白 包被的八孔小室载玻片(BD Biosciences,San Jose,CA)上生长 至融合状态达到60的N

12、RK52E细胞用培养基清洗3次。 然后， 将细胞与siRNA或多肽/ siRNA混合液共同孵育24h， 最后利用荧光显微技术观察。 0023 荧光显微技术 0024 在常温下， 将固定在胶原蛋白包被的八孔小室载玻片(BD Biosciences,San Jose,CA)上的细胞利用含3多聚甲醛的PBS缓冲液中清洗10min， 然后将滴有抗荧光衰减 剂和4 ,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI,VECTOR Laboratories,Burlingame,CA)的盖 玻片盖在载玻片上。 利用Zeiss(Thornwood,NY)Axio Observer D1显微镜进

13、行荧光信号和 说明书 2/3 页 4 CN 104262466 B 4 图像采集。 利用倒置显微镜LDA-Plan20/0.3Ph1 objective对固定后的细胞拍照， 转染效 率超过90。 0025 以上所述是本发明的优选实施例， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来 说， 在不脱离本发明所述原理的前提下， 还可以作出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 0026 参考文献： 0027 1.Vidal,P.,Chaloin,L.,Mry,J.,Lamb,N.,Lautredou,N.,Bennes,R.andHeitz, F.(1996)J.Pep.Sci.

14、,2,125133. 0028 2 .M e r y ,J . ,G ra n i e r ,C . ,J u i n ,M .a nd B r ug id o u ,J .(1 9 9 3) .Int.J.PeptideProtein Res.,42,4452. 0029 3.Juliano R,Alam MR,Dixit V,KangH(2008)Mechanisms and strategies for effectivedelivery of antisense and siRNA oligonucleotides.Nucleic Acids Res 36:41584171 0030

15、4.Akhtar S,Benter IF(2007)Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo.J Clin Invest117:36233632 0031 5.Lv H,Zhang S,Wang B,Cui S,Yan J(2006)Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.J Control Release 114:100109 0032 6.Meade BR,Dowdy SF(2008)Enhancing the cellular uptake of

16、 siRNA duplexes following noncovalent packaging with protein transduction domain peptides.Adv Drug Deliv Rev 60:530536 0033 7.Futaki S,Suzuki T,Ohashi W et al(2001)Arginine-rich peptides.An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery.J Biol Chem 276:58365840 。 说明书 3/3 页 5 CN 104262466 B 5 0001 序列表 1/1 页 6 CN 104262466 B 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 104262466 B 7