一种提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811172964.9 (22)申请日 2018.10.09 (71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号 (72)发明人 陈献忠杨海泉沈微卢潇 胡金远王拂祥王浩坤陈媛 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 张勇 (51)Int.Cl. C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 9/26(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)

2、发明名称 一种提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种提高大肠杆菌重组蛋白 胞外分泌水平的方法， 属于基因工程与发酵工程 领域。 本发明通过敲除D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽 酶dacA和dacB基因(单敲除和双敲除)， 获得重组 蛋白胞外分泌水平显著提高的重组大肠杆菌突 变株。 采用绿色荧光蛋白(GFP)和淀粉酶为模式 重组蛋白， 证明了本发明方法可显著提高胞外蛋 白的含量。 单敲除和复合敲除dacA和dacB后， GFP 胞外荧光值分别提高2.1、 2.1和2.7倍； 单敲除和 复合敲除dacA和dacB后， 淀粉酶胞外酶活力占总 酶活力的比例分别由对照菌的40

3、 .7提高至 44.7、 62.1和64.2。 本发明方法对重组蛋 白在大肠杆菌中的高效分泌与生产具有重要指 导意义。 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图3页 CN 109234297 A 2019.01.18 CN 109234297 A 1.一种提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法， 其特征在于， 敲除大肠杆菌中编 码D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因dacA和dacB中的至少一个。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 通过同源重组的方法敲除编码D-丙氨酰- D-丙氨酸羧肽酶的基因dacA和dacB中的至少一个。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述

4、大肠杆菌是E.coli BL21(DE3)。 4.根据权利要求13任一所述的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)设计引物， PCR获得含有卡那抗性基因及待敲除基因上下游同源臂的敲除框； (2)将质粒pKD46质粒导入大肠杆菌， 获得含有pKD46质粒的重组大肠杆菌； (3)将上述敲除框转入大肠杆菌， 在pKD46质粒的作用下进行同源重组， 筛选获得基因 敲除的大肠杆菌， 并利用pCP20辅助质粒消除kan基因。 5.一种重组大肠杆菌， 其特征在于， 敲除大肠杆菌中编码D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的 基因dacA和dacB中的至少一个。 6.根据权利要求5所述的一种重组大肠杆菌， 其特征

5、在于， 通过同源重组的方法敲除编 码D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因dacA和dacB中的至少一个。 7.根据权利要求5或6所述的一种重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述大肠杆菌是 E.coliBL21(DE3)。 8.根据权利要求57任一所述的一种重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述大肠杆菌分泌 表达胞外蛋白。 9.权利要求57任一所述重组大肠杆菌在重组蛋白胞外生产中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述重组蛋白包括淀粉酶。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109234297 A 2 一种提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种提高大

6、肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法， 属于基因工程与发 酵工程领域。 背景技术 0002 大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统， 有操作简单、 成本低廉等优点， 可以快速大规模地生产目的蛋白， 但是在大肠杆菌的异源表达中， 大部分 重组蛋白在信号肽的引导下分泌到周质空间， 会导致中间体大量积聚， 对蛋白质的生产造 成阻碍。 0003 肽聚糖是由双糖单位， 四肽尾还有肽桥聚合而成得多层网状大分子结构。 肽聚糖 层的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过 -1,4糖苷键连接而成， 糖链间由肽链交 联， 构成稳定的网状结构， 这样构成了整个细菌表面的细胞壁。 作为细胞壁的主要成

7、分， 肽 聚糖的组成与细胞结构的完整性、 外膜的通透性的维持、 细菌的抗干燥能力和耐热性等均 密切相关。 发明内容 0004 本发明提供一种提高大肠杆菌重组蛋白保外分泌水平的方法， 是通过敲除dacA和 dacB基因中的至少一个。 0005 本发明还提供敲除dacA和/或dacB基因的方法， 包括以下步骤： 0006 1)获得敲除框片段： 单敲除dacA或dacB基因时， 设计并合成与目的基因有同源片 段的引物， PCR扩增获得含有卡那霉素抗性基因并在其两侧含有FRT位点的片段， 作为dac敲 除框片段； 复合敲除dacA和dacB时， 设计引物， 采用融合PCR的方式得到敲除框片段。 000

8、7 2)筛选阳性转化子： 将pKD46质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞， 获得 E.coli BL21(DE3)/pKD46菌株， 制备电转化感受态细胞， 将电转化感受态细胞与步骤(1)制 得的敲除框片段混合后进行电转化， 转化液经过后培养后涂布在含有卡那霉素、 氨苄青霉 素的LB培养基固体平板中培养， 获得转化子； 以菌落为模板， PCR扩增筛选出含有卡那霉素 抗性基因的阳性转化子E.coli BL21(DE3)dac:kan/pKD46； 0008 3)消除抗性基因： 将E.coli BL21(DE3)dac:kan/pKD46接种到无抗性LB培养基 培养， 取菌液在无

9、抗性LB平板上划线， 将单菌落分别对应点在卡那霉素抗性平板和氨苄青 霉素抗性平板上， 在卡那霉素抗性平板上生长而氨苄青霉素抗性平板上不生长的菌株即为 E.coli BL21(DE3)dac:kan； 制备E.coli BL21(DE3)dac:kan电转感受态细胞， 转化 pCP20质粒， 涂布于氨苄青霉素抗性、 氯霉素抗性双抗性LB培养基平板上， 获得含pCP20质粒 的阳性转化子， 将其接种到无抗性LB培养基中培养， 消除pCP20质粒。 0009 有益效果： 0010 dacA基因和dacB基因表达的D,D-羧肽酶能够从肽聚糖五肽上移除最后一个末端 D-Ala， 导致转肽反应中供体不可用

10、， 可以控制肽聚糖的网状交联水平， 对细胞壁肽聚糖层 说明书 1/4 页 3 CN 109234297 A 3 的合成与结构稳定具有调控作用， 从而改变细胞的通透性。 本发明公开了一种提高大肠杆 菌重组蛋白胞外分泌水平的方法， 属于基因工程与发酵工程领域。 本发明通过敲除D-丙氨 酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA和dacB基因(单敲除和双敲除)， 获得重组蛋白胞外分泌水平显著 提高的重组大肠杆菌突变株。 采用绿色荧光蛋白(GFP)和淀粉酶为模式重组蛋白， 证明了本 发明方法可显著提高胞外蛋白的含量。 单敲除和复合敲除dacA和dacB后， GFP胞外荧光值分 别提高2.1、 2.1和2.7倍； 单

11、敲除和复合敲除dacA和dacB后， 淀粉酶胞外酶活力占总酶活力 的比例分别由对照菌的40.7提高至44.7、 62.1和64.2。 本发明方法对重组蛋白在 大肠杆菌中的高效分泌与生产具有重要指导意义。 附图说明 0011 图1敲除了基因dacA、 dacB的菌株的菌落PCR验证图。 (a)基因dacA、 dacB单敲除的 菌株的菌落PCR验证； M： 2000bp DNA Marker； 1： BL21-dacB菌株； 2： BL21-dacB:kan菌 株； 3： BL21-dacA菌株； 4： BL21-dacA:kan菌株。 (b)基因dacA、 dacB复合敲除的菌株的 菌落PCR验

12、证； M： 5000bp DNA Marker； 1： BL21-dacA/B菌株； 2： BL21-dacA/B:kan菌株； 3： BL21-dacB菌株。 0012 图2基因dacA、 dacB敲除对绿色荧光蛋白胞外分泌表达的影响。 内图为SDS-PAGE凝 胶电泳图； CK： BL21-pETDuet-gfp菌株； dacA： BL21-dacA-gfp菌株； dacB： BL21- dacB-gfp菌株； dacA/B： BL21-dacA/B-gfp菌株； M： 标准蛋白Marker。 0013 图3基因dacA、 dacB敲除对淀粉酶胞内外分泌表达的影响。 (a)淀粉酶酶活力；

13、(b) SDS-PAGE凝胶电泳图； (c)淀粉酶比生产速率； (d)胞外淀粉酶酶活力占总酶活比重； CK： BL21-pETDuet-amyk菌株； dacA： BL21-dacA-amyk菌株； dacB： BL21-dacB-amyk菌 株； dacA/B： BL21-dacA/B-amyk菌株； M： 标准蛋白Marker。 具体实施方式 0014 本发明中所用到的材料和方法： 0015 1)培养基 0016 LB固体培养基： 15g/L琼脂， 10g/L胰蛋白胨， 5g/L酵母提取粉， 10g/L NaCl， pH 7.0。 0017 LB液体培养基： 10g/L胰蛋白胨， 5g/L

14、酵母提取粉， 10g/L NaCl， pH 7.0。 0018 TB液体培养基： 12g/L胰蛋白胨， 24g酵母提取粉， 甘油4mL， 2.31g KH2PO4 12.54g K2HPO4， pH 7.5， 定容到1L。 0019 2)培养方法 0020 种子培养： 将平板划线长出的单菌落接到LB液体培养基中， 培养转速200r/min， 在 37下恒温摇床培养8h。 0021 发酵培养： 将重组E.coli在LB培养基中37培养8h， 然后按1(v/v)的接种量接 种到TB培养基中， 37培养至OD6000.8， 加入终浓度为1mmolL-1IPTG， 25诱导表达。 氨 苄青霉素和氯霉素

15、工作浓度均为50 gmL-1， 卡那霉素工作浓度为30 gmL-1。 0022 3)分析方法 0023 生物量测定： 测定600nm下的吸光光度值。 说明书 2/4 页 4 CN 109234297 A 4 0024 淀粉酶活性测定： 淀粉酶的一个酶活力单位(U)定义： 在pH 9.5和50下， 每分钟 水解淀粉释放1 mol还原糖(葡萄糖)所需的酶量。 使用改良的二硝基水杨酸(DNS)法测定可 溶性淀粉水解过程中产生的还原糖。 0025 绿色荧光蛋白荧光测定： 将菌液在4、 1104g条件下离心10min， 将上清与细 胞分离， 将菌体细胞用10mmolL-1pH 7.4PBS磷酸盐缓冲液重

16、悬， 测定其菌浓OD600nm； 使用 酶标仪和96孔板测定上清中GFP的荧光强度。 10mmolL-1pH 7.4PBS的荧光值作为空白对 照。 激发和发射波长分别为488nm和533nm。 0026 实施例1本实施例说明dacA和dacB基因敲除的大肠杆菌的构建过程 0027 (1)分别敲除dacA、 dacB： 0028 以质粒pKD13为模板， 设计引物并PCR扩增含有Kan抗性基因的用于替换目的基因 dacA、 dacB的同源片段， 序列分别如SE ID NO.1、 SEQ ID NO.2所示， 电转化进入E.coliBL21 (DE3)/pKD46感受态中， 涂布含有卡那霉素(Ka

17、n)的平板， 获得转化子BL21-dacA:kan、 BL21-dacB:kan。 通过菌落PCR扩增验证dac基因是否成功敲除， 理论上， BL21-dacA: kan、 BL21-dacB:kan应分别含有1504、 1754bp的同源片段， 如图1所示， 菌落PCR获得的片 段大小与理论上同源片段的大小相符。 利用pCP20辅助质粒消除kan基因， 抗性基因消除后 BL21-dacA、 BL21-dacB菌株中的同源片段理论上分别长268、 518bp， 菌落PCR扩增验证 结果与理论值一致。 BL21-dacA、 BL21-dacB菌株在Kan、 氨苄青霉素(Amp)平板上均不生 长，

18、 在无抗性LB平板上正常生长。 0029 (2)同时敲除dacA、 dacB： 0030 在复合敲除dacA和dacB时， 为了提高重组效率， 设计了较长的同源片段， 采用融合 PCR的方式得到敲除框片段， 大小为2113bp， 序列如SEQ ID NO.3所示， 电转化进入E.coli BL21(DE3)/pKD46感受态中， 涂布含有卡那霉素(Kan)的平板， 获得转化子BL21-dacA/B: kan。 利用pCP20辅助质粒消除kan基因。 原目的基因大小为1104bp， 抗性基因消除后BL21- dacA/B菌株的菌落PCR获得片段的大小理论值为877bp。 菌落PCR验证与其片段理

19、论大小相 符， 证明基因敲除成功。 BL21-dacA/B菌株在Kan、 氨苄青霉素(Amp)平板上均不生长， 在无 抗性LB平板上正常生长。 0031 实施例2本实施例说明敲除dacA和dacB对E.coli胞外生产重组绿色荧光蛋白的影 响 0032 本实施例中测定分析了基因敲除对E .coli胞外生产GFP的影响。 将重组质粒 pETDuet-gfp分别转化至实施例1构建的BL21-dacA、 BL21-dacB和BL21-dacA/B菌株 中， 构建重组突变株BL21-dacA-gfp， BL21-dacB-gfp和BL21-dacA/B-gfp。 将重组突 变株BL21-dacA-gf

20、p， BL21-dacB-gfp和BL21-dacA/B-gfp在LB培养基中37培养8h， 然后按1(v/v)的接种量接种到TB培养基中， 37培养至OD6000.8， 加入终浓度为 1mmolL-1IPTG， 25诱导表达。 测定绿色荧光蛋白荧光的含量。 如图2所示， BL21-dacA- gfp、 BL21-dacB-gfp和BL21-dacA/B-gfp突变菌株的胞外GFP荧光值分别为188.0、 179.7和232.1A.U.Lg-1， 而对照菌株BL21-pETDuet-gfp仅为87.5A.U.Lg-1， 敲除 dacA、 dacB基因后均提高至2.1倍， 而复合敲除dacA、

21、dacB基因后提高至2.7倍， 说明E.coli D,D-羧肽酶dacA、 dacB基因敲除后， 有利于GFP的胞外生产。 同时， 还通过SDS-PAGE分析了突 变菌株BL21-dacA-gfp、 BL21-dacB-gfp、 BL21-dacA/B-gfp和对照菌株BL21-gfp的重 说明书 3/4 页 5 CN 109234297 A 5 组GFP的胞外浓度， 结果表明， BL21-dacA/B-gfp的胞外重组GFP的浓度高于BL21-dacA- gfp、 BL21-dacB-gfp， BL21-dacA-gfp、 BL21-dacB-gfp的胞外重组GFP的浓度高于 BL21-gf

22、p， 再次验证了敲除dacA、 dacB基因后重组GFP的胞外分泌水平提高。 0033 实施例3本实施例说明敲除dacA和dacB对E.coli胞外生产重组淀粉酶的影响 0034 本实施例中将重组质粒pETDuet-amyk分别转化到BL21-dacA、 BL21-dacB和 BL21-dacA/B突变菌株中， 获得重组突变菌株BL21-dacA-amyk、 BL21-dacB-amyk和 BL21-dacA/B-amyk。 将BL21-dacA-amyk、 BL21-dacB-amyk和BL21-dacA/B-amyk分 别在LB培养基中37培养8h， 然后按1(v/v)的接种量接种到TB培

23、养基中， 37培养至 OD6000.8， 加入终浓度为1mmolL-1IPTG， 25诱导表达。 发酵结束后， 离心、 收集发酵上清 液， 检测发酵上清液中的淀粉酶活力， 分析在E.coli中敲除dacA、 dacB基因对细胞外重组淀 粉酶产生的影响。 0035 如图3(a)所示， 诱导36h时， 突变株BL21-dacA-amyk、 BL21-dacB-amyk和BL21- dacA/B-amyk的胞外重组淀粉酶酶活力分别达到1492.9、 1857.4和640.5Ug-1， 而对照菌 株(BL21-amyk)仅为592.7Ug-1， 可见， 敲除dacA、 dacB基因后可以显著提高重组淀

24、粉酶胞 外生产水平。 通过SDS-PAGE分析dacA、 dacB基因敲除对细胞外重组淀粉酶表达的影响(图3 (b)， 在突变菌株中发现了对应于AmyK分子量(62.8kDa)的明显蛋白质条带， 再次表明敲除 dacA、 dacB基因可以促进重组淀粉酶分泌到胞外。 0036 同时， 通过对突变菌株的胞外淀粉酶比生产速率进行测定分析， 与对照菌株相比， BL21-dacA-amyk、 BL21-dacB-amyk和BL21-dacA/B-amyk突变菌株的胞外淀粉酶比生 产速率显著提高， 其中BL21-dacB-amyk最高， 为0.17UmL-1h-1(图3(c)。 进一步分析 了D,D-羧肽

25、酶dacA、 dacB基因敲除对E.coli生产胞外重组淀粉酶所占比例的影响。 诱导28h 时， BL21-dacA-amyk、 BL21-dacB-amyk和BL21-dacA/B-amyk突变菌株的胞外重组淀 粉酶占总淀粉酶活分别由对照菌株的40.7提高至44.7、 62.1和64.2(图3(d)， 进 一步说明敲除dacA、 dacB基因有利于E.coli重组淀粉酶的胞外生产。 0037 对比例： 0038 设计引物并PCR扩增含有Kan抗性基因的用于替换目的基因dacD的同源片段， 采用 实施例1中记载的敲除dacA或dacB的方法， 敲除大肠杆菌中的基因dacD， 获得突变株BL21

26、- dacD。 将重组质粒pETDuet-gfp转化至突变株BL21-dacD后， 突变菌株的胞外GFP荧光值 为88.1A.U.Lg-1， 而对照菌株BL21-pETDuet-gfp为87.5A.U.Lg-1。 可以看出， D,D- 羧肽酶dacD基因敲除对大肠杆菌胞外蛋白生产几乎没有效果。 0039 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 4/4 页 6 CN 109234297 A 6 SEQUENCE LISTING 江南

27、大学 一种提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法 3 PatentIn version 3.3 1 1404 DNA 人工合成 1 ggctctttgc acagccttta tctctgctgc acatgccgat gacctgaata gtgtaggctg 60 gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa 120 gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg 180 gagcggcgat accgtaaagc acg

28、aggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag 240 caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac 300 agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc 360 catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt 420 cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc c

29、tgatcgaca agaccggctt 480 ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag 540 ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag 600 gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc 660 ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc

30、 720 acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga 780 caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga 840 ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg 900 cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc 960 ttgatcccct gcgc

31、catcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg 1020 gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata 1080 aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc tttctctttg 1140 cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc 1200 gtttctgcgg actggctttc tacgtgttc

32、c gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt 1260 gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct agagaatagg 1320 aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaatacaacg cccgttggtt gtactgcaag 1380 aaatcccgga aggtaacttc ttcg 1404 2 1404 DNA 人工合成 序列表 1/3 页 7 CN 109234297 A 7 2 gattaccaca gtcagcagat ggcgcagccc gccagt

33、acgc agaaagtgat gtgtaggctg 60 gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa 120 gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg 180 gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag 240 caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccg

34、gccac 300 agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc 360 catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt 420 cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt 480 ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag 540 ccggatcaag

35、 cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag 600 gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc 660 ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc 720 acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga 780 caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctga

36、ca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga 840 ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg 900 cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc 960 ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg 1020 gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggtt

37、cgctt gctgtccata 1080 aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc tttctctttg 1140 cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc 1200 gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt 1260 gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct agagaatagg

38、 1320 aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaattgacgg ctctttgcag taccgtgcag 1380 gtctgcatca ggcgggcgtg gatg 1404 3 2013 DNA 人工合成 3 gctctttgca cagcctttat ctctgctgca catgccgatg acctgaatat caaaactatg 60 atcccgggtg taccgcagat cgatgcggag tcctacatcc tgattgacta taactccggc 120 aaagtgctcg ccgaacagaa cgcagatgtc c

39、gccgcgatc ctgccagcct gaccaaaatg 180 atgaccagtt acgttatcgg ccaggcaatg aaagccggta aatttaaaga aactgattta 240 gtcactatcg gcaacgacgc atgggccacc ggtaacccgg tgtttaaagg ttcttcgctg 300 atgttcctcg tgtaggctgg agctgcttcg aagttcctat actttctaga gaataggaac 360 ttcggaatag gaacttcaag atccccttat tagaagaact cgtcaagaag

40、 gcgatagaag 420 gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat 480 tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc 540 序列表 2/3 页 8 CN 109234297 A 8 gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc ggccattttc caccatgata 600 ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct c

41、gccgtcggg catgcgcgcc 660 ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc 720 tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg 780 tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg 840 atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg

42、 900 cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga 960 acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt cctgcagttc attcagggca 1020 ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg 1080 gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat agccgaatag cctctccacc 1140 caagcggccg g

43、agaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa tcatgcgaaa cgatcctcat 1200 cctgtctctt gatcagatct tgatcccctg cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc 1260 atccagttta ctttgcaggg cttcccaacc ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc 1320 ggttcgcttg ctgtccataa aaccgcccag tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa 1380 gctacctgct ttctctttgc gcttgc

44、gttt tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca 1440 ttcatccggg gtcagcaccg tttctgcgga ctggctttct acgtgttccg cttcctttag 1500 cagcccttgc gccctgagtg cttgcggcag cgtgagcttc aaaagcgctc tgaagttcct 1560 atactttcta gagaatagga acttcgaact gcaggtcgac ggatccccgg aatccttgtt 1620 gcttctgcga ctgaaggcca gatgcgcttg atctctgcgg

45、tgatgggcgg acgtactttt 1680 aaaggccgtg aagccgaaag taaaaaactg ctgacctggg gcttccgttt cttcgaaacc 1740 gttaacccac tgaaagtagg taaagagttc gcctctgaac cggtttggtt tggtgattct 1800 gatcgcgctt cgttaggggt tgataaagac gtgtacctga ccattccgcg tggccgcatg 1860 aaagatctga aagccagcta tgtgctgaac agcagtgaat tgcatgcgcc gctgcaaaag 1920 aatcaggtcg tcggtactat caacttccag cttgatggca aaacgatcga acaacgcccg 1980 ttggttgtac tgcaagaaat cccggaaggt aac 2013 序列表 3/3 页 9 CN 109234297 A 9 图1 图2 说明书附图 1/3 页 10 CN 109234297 A 10 说明书附图 2/3 页 11 CN 109234297 A 11 图3 说明书附图 3/3 页 12 CN 109234297 A 12