快速检测食品中单核增生李斯特菌的方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102719535 B (45)授权公告日 2014.02.26 CN 102719535 B (21)申请号 201210177173.1 (22)申请日 2012.06.01 C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 南昌大学 地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学府 大道 999 号 (72)发明人 魏华 徐锋 杨友均 郭亮 许恒毅 赖卫华 熊勇华 (74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有 限公司 36115 代理人 施秀瑾 (54) 发明名称 快速检测食品中单核增生李斯特菌的方法 (57) 摘要

2、本发明公开了一种单核增生李斯特菌的环介 导等温扩增的检测方法。本发明针对单核增生李 斯特菌设计和筛选了一套特异性检测引物， 采用 LAMP 对待检测食物样品进行检测， 确认是否存在 单核增生李斯特菌的特异性基因片段， 进而确定 待检测样品是否受到单核增生李斯特菌污染。此 外， 在进行 LAMP 检测前， 本发明还通过叠氮溴化 丙锭处理食物样品以去除死菌的干扰， 从而在随 后进行的LAMP检测中只会有活菌的检测信号。 本 发明的检测方法具有灵敏度高、 特异性强、 检测时 间短， 不需要昂贵的实验仪器， 操作过程简单， 并 且不会被食物样品中残留的 DNA 或死菌的干扰， 特别适合在野外和基层检测

3、机构和食品企业中自 检使用。 (51)Int.Cl. 审查员 周茂新 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102719535 B CN 102719535 B 1/1 页 2 1. 一种快速检测食品中活的单核增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes） 的检测方 法， 其特征在于包括如下步骤 ： （1） 取食物样本， 加缓冲液碾磨制成匀浆液， 离心去除大的食物残渣， 取上清得菌悬液， 过程均为无菌操作 ； （2） 取

4、制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶溶液， 使叠氮溴化丙啶的终质量浓度为 3 g/ mL， 混匀后室温避光培养 38min， 卤素灯曝光， 光照交联时样品置于冰上， 交联后的悬浮液 离心， 所得沉淀用沸水浴法提取 DNA ； （3） 取 DNA， 进行 LAMP 反应， LAMP 反应所用的引物为 ： 上游外引物 F3（5 3 ） ： AAGCTGCTTTTGATGCTG 下游外引物 B3（5 3 ） ： TCGATTAAAAGTAGCGCCTT 上游内引物 FIP（5 3 ） ： CGGCTTTGAAGGAAGAATTTTTGAT-CGTAAGCGGAAAATCTGTC 下游内引物 BIP（5 3

5、） ： TACGGAGGTTCCGCAAAAGA-TTTTCAAAATATCGCGTAAGTCTC 上游环引物 LF（5 3 ） ： ATTTGTTAGTTCTACATCACCTG 下游环引物 LB（5 3 ） : AAGTTCAAATCATCGACGGC （4） LAMP 反应结束后， 取反应液检测单核增生李斯特菌存在。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 所述的缓冲液为 PBS 磷酸盐缓冲 液。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 所述叠氮溴化丙啶溶液配制方法为 叠氮溴化丙啶溶解于二甲亚砜 (DMSO) 中， 配制成 0.5 mg/mL

6、 的叠氮溴化丙啶溶液， -20 避光保存。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中混匀后室温避光培养 5min。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 所述 LAMP 反应条件为 ： 0.8 M 甜 菜碱 , 2 mM MgSO4, 1.4 mM dNTP, 1.6 uM 内引物 FIP/BIP, 0.4 uM 外引物 F3/B3, 0.8 uM 环引物 LF/LB ； 将扩增反应体系于 62 oC 孵育 45 min， 85 oC 孵育 5 min， 终止反应。 6.如权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （4） 所述取反应液

7、检测单核增生李斯特 菌存在为取反应液用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果， 若有梯度条带处在， 且最小条带 为 180 bp， 则说明有单核增生李斯特菌存在 ； 或取反应液加入 SYBR green I 荧光检测， 若 反应液出现绿色， 则说明有单核增生李斯特菌存在。 权 利 要 求 书 CN 102719535 B 2 1/5 页 3 快速检测食品中单核增生李斯特菌的方法 技术领域 0001 本发明属于微生物检测领域， 尤其涉及一种快速检测食品中单核增生李斯特菌的 方法。 技术背景 0002 目前， 李斯特菌属共包含 8 个种， 而绝大多数人体感染的李斯特菌都与单核增生 李斯特菌 （L.

8、monocytogenes） 有关。对于非孕妇的的个体， 单核增生李斯特菌感染会引起 脑膜炎和脑膜脑炎 ； 对于孕妇， 主要感染还未出生的婴儿。 在感染过程中单核增生李斯特菌 可以从一个细胞扩散到邻近的其他细胞。 通常单核增生李斯特菌会在腐烂的植物体和泥土 中发现， 同时它也会通过饮水和食物进入家畜的体内并定植在其胃肠道。人体会因食用受 感染的家畜的肉或奶而患病。食用受单核增生李斯特菌污染的食物， 例如干酪、 香肠、 牛奶 等， 是其感染的主要途径， 其致死率可高达 30%。 0003 供食用的家畜及其相关产品是单核增生李斯特菌污染的主要来源。因此， 为了确 保食品安全， 在食物生产的各个环节

9、控制微生物的污染相当重要。 目前， 对于单核增生李斯 特菌检测主要的方法还是培养法和血清学的检测方法， 包括富集、 选择性培养、 生化鉴定。 血清分型， 有时还要进行毒性检测。如 ( 杨瑞军 , 生肉食品中致病菌检测结果分析 J 中 国卫生检验杂志 .2009:19（9） 2122-2125)， 传统的方法具有劳动强度高、 耗时、 费用高等缺 点。此外， 传统方法检测灵敏度比较低而且特异性不强， 尤其对于来源相近的菌株， 传统方 法很难通过生理生化的方式加以区分。 因此， 为了确保食品安全， 急需快速、 简单、 准确的方 法来检测食品中的单核增生李斯特菌。 发明内容 0004 本发明是目的是针

10、对现有技术的不足， 提供一种检测成本低、 使用方便、 检测快速 高效、 灵敏度高的单核增生李斯特菌快速检测方法。 0005 本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的 ： 0006 包括如下步骤 ： 0007 （1） 取食物样本， 加缓冲液碾磨制成匀浆液， 离心去除大的食物残渣， 取上清得菌 悬液， 整过程均为无菌操作 ； 缓冲液为 PBS 磷酸盐缓冲液。 0008 （2） 取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶 （PMA） 溶液， 使 PMA 的终质量浓度为 3 g/ mL， 混匀后室温避光培养 3 8min（优选为 5min） ， 卤素灯曝光， 光照交联时样品置于冰上， 交联后的悬浮液离心， 所

11、得沉淀用沸水浴法提取 DNA ； PMA 溶液配制方法为 PMA 溶解于二甲 亚砜 ( DMSO) 中， 配制成 0.5 mg/mL 的 PMA 溶液， -20避光保存。 0009 （3） 取 DNA， 进行 LAMP 反应， LAMP 反应所用的引物为 ： 0010 上游外引物 F3（5 3 ） ： AAGCTGCTTTTGATGCTG 0011 下游外引物 B3（5 3 ） ： TCGATTAAAAGTAGCGCCTT 0012 上游内引物 FIP（5 3 ） ： CGGCTTTGAAGGAAGAATTTTTGAT-CGTAAGCGGAAAATCTGTC 说 明 书 CN 10271953

12、5 B 3 2/5 页 4 0013 下游内引物 BIP（5 3 ） ： TACGGAGGTTCCGCAAAAGA-TTTTCAAAATATCGCGTAAGTCTC 0014 上游环引物 LF（5 3 ） ： ATTTGTTAGTTCTACATCACCTG 0015 下游环引物 LB（5 3 ） :AAGTTCAAATCATCGACGGC 0016 为了达到更好的反应效果， LAMP 反应条件为 ： 0.8 M 甜菜碱 , 2 mM MgSO4, 1.4 mM dNTP, 1.6 uM 内引物 FIP/BIP, 0.4 uM 外引物 F3/B3, 0.8 uM 环引物 LF/LB ； 将扩增

13、反应体系于 62 oC 孵育 45 min， 85 oC 孵育 5 min， 终止反应。 0017 （4） LAMP 反应结束后， 取反应液检测单核增生李斯特菌存在。取反应液检测单核 增生李斯特菌存在可以为取反应液用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果， 若有梯度条带处 在， 且最小条带为180 bp， 则说明有单核增生李斯特菌存在 ； 或取反应液加入SYBR green I 荧光检测， 若反应液出现绿色， 则说明有单核增生李斯特菌存在。 0018 与现有技术相比， 本发明有如下有益效果 ： 0019 1、 采用本发明的检测单核增生李斯特菌的时间更短， 可在 2.5 个小时内得到结 果， 同时

14、本发明克服了一般的分子生物学检测方法无法区分死菌与活菌的缺陷 ； 0020 2、 本发明针对单核增生李斯特菌的特异性基因设计特异性引物， 并特定的反应条 件， 可在 62 C, 45 min 内的出结果。 0021 3、 取反应液检测单核增生李斯特菌存在， 可以无需电泳检测， 直接可通过荧光观 察， 操作简便， 结果判定简单， 降低了检测成本。 0022 单核增生李斯特菌作为一种主要的食源性致病菌， 在公共卫生、 食品安全。 兽牧兽 医和出入境检验检疫中必须的检测指标。随着社会经济的发展和国际贸易量的与日俱增。 急需建立一种从田园到餐桌的一种快速、 准确、 简便的细菌检测方法。结合了 PMA

15、处理的 LAMP 检测技术更具有重要意义。 附图说明 0023 图 1 LAMP 扩增结果， PC 为阳性对照， NC 为阴性对照。 （A） 在自然光照条件下 PC 在管底出现白色沉淀， NC 反应液为澄清液 ；（B） 在自然光照条件下， 加入 SYBR green I 后， PC 出现绿色， NC 呈淡黄色 ；（C） 在紫外光照条件下， 加入 SYBR green I 后， PC 出现亮绿色， NC 呈淡黄色 ；（D） 经 2% 琼脂糖凝胶电泳后， PC 出现阶梯状条带， NC 物任何条带。 0024 图 2 PMA 处理去除死的单核增生李斯特菌的干扰。 （A） 经 PMA 处理或不处理的活

16、 单核增生李斯特菌与热致死单核增生李斯特菌基因组 DNA 提取结果 ；（B） （C） 各组合所提 取的基因组作为模板进行的 LAMP 检测的结果。各组单核增生李斯特菌的浓度为 106 CFU/ mL。 0025 图 3 LAMP 检测的特异性验证。 0026 图4 LAMP检测的灵敏度验证。 1-5非别是10梯度稀释的单核增生李斯特菌， 其浓 度从 1.2105 到 1.2101 CFU/mL。 具体实施方案 0027 下面结合具体实施例， 进一步阐释本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法， 通常按照常规条 件中的条件，

17、或按照制造厂商的建议条件， 实施例中涉及的菌株均属于现有技术， 本领域的 说 明 书 CN 102719535 B 4 3/5 页 5 技术人员可很容易地从公开是商业渠道获得。 实施例 0028 1. 食物样本预处理 0029 称取1 g的食物样本， 加入9ml的磷酸盐缓冲液 （PBS） ， 碾磨制成匀浆液， 900 g 离 心 5 min， 去除大的食物残渣， 取上清 （该过程必须无菌操作） 。 0030 2.PMA 处理 0031 PMA 溶解于二甲亚砜 ( DMSO) 中， 配制成 0.5 mg/mL 的 PMA 溶液， -20避光保存。 取500 L制备好的菌悬液置于1.5 mL微量离

18、心管中， 加入3 L 0.5 mg/mL的PMA溶液， 使 PMA 的终质量浓度为 3 g/mL ； PMA 与菌悬液混合均匀后在室温条件下避光培养 5 min， 利用500 W的卤素灯曝光5 min， 光照交联时样品置于冰上(避免过热)， 且在距光源20 cm 处， 交联后的悬浮液于 10000 g 离心 5 min， 所得沉淀用于 DNA 的提取。 0032 3. 基因组 DNA 的提取 0033 经步骤 2 获得的样品在 10000 g， 4 oC条件下离心 5 min， 弃上清， 并小心吸走残余 液体， 加入 30 l 无菌的去离子水 100oC 煮沸 10 min， 待冷却后 120

19、00 g， 4 oC条件下离心 5 min， 取上清作为 LAMP 反应模板， 制备的模板应立即用于检测。 0034 4. 选取靶点及设计引物 0035 （2） LAMP 检测 ： 将扩增反应体系于 62 oC 孵育 45 min， 85 oC 孵育 5 min， 终止反 应 ： 0036 所述 25 L 扩增反应体系包括 ： 2.5 L 10 thermal buffer (200 mM Tris HCl, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 80 mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100, pH 8.8 ), 0.8 M 甜菜碱 (Sigma,

20、 Santa Clara, CA), 2 mM MgSO4, 1.4 mM/dNTP (TaKaRa, Dalian, China), 1.6 uM FIP/BIP, 0.4 uM F3/B3, 0.8 uM LF/LB, 1.0 L (8 U) Bst DNA 聚合 酶 (8000 U/mL, New England Biolabs, 北京 , 中国 ), 5 L 模板 DNA， 添加无菌水至 25 L。 0037 LAMP 反应所用的引物对用在线软件 （http:/primerexplorer.jp/e/index. html） 设计 ： 0038 上游外引物 F3（5 3 ） ： AAG

21、CTGCTTTTGATGCTG 0039 下游外引物 B3（5 3 ） ： TCGATTAAAAGTAGCGCCTT 0040 上游内引物 FIP（5 3 ） ： CGGCTTTGAAGGAAGAATTTTTGAT-CGTAAGCGGAAAATCTGTC 0041 下游内引物 BIP（5 3 ） ： TACGGAGGTTCCGCAAAAGA-TTTTCAAAATATCGCGTAAGTCTC 0042 上游环引物 LF（5 3 ） ： ATTTGTTAGTTCTACATCACCTG 0043 下游环引物 LB（5 3 ） : AAGTTCAAATCATCGACGGC 0044 摸索 LAMP 反

22、应的条件， 包括反应温度， 反应时间， Mg2+浓度， 甜菜碱浓度等。最终 得出该 LAMP 反应的最优条件为 ： 0.8 M 甜菜碱 , 2 mM MgSO4, 1.4 mM dNTP, 1.6 uM 内 引物FIP/BIP, 0.4 uM 外引物F3/B3, 0.8 uM 环引物LF/LB, 反应温度为 62C， 反应时 间为45 min。 选取最优的条件， 并采表1提供的菌株进行引物特异性验证， 菌株的编号和来 源见表 1。 0045 表 1 供试菌株及检测结果 说 明 书 CN 102719535 B 5 4/5 页 6 0046 0047 a JX-CDC, 江西省疾病预防与控制中心

23、， 中国 ；b NCTC, 国家典型菌种保藏中心， 英国 说 明 书 CN 102719535 B 6 5/5 页 7 0048 c ATCC, 美国典型菌种保藏中心， 美国 ；d CMCC, 中国药物菌种保藏中心， 中国 0049 5.LAMP 扩增结果检测 0050 （1） LAMP 反应结束后， 用枪头吸取 5l 反应液， 加到 2% 琼脂糖凝胶的上样孔里， 85 V 电泳 30 min， 取出凝胶块， 在紫外成像系统中观察电泳条带， 并拍照记录。确定样品中 是否有目的菌的具体标准为 ： 用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果， 若有梯度条带处在， 且 最小条带为 180 bp， 则说明

24、有单核增生李斯特菌存在。 0051 （2） 向反应液中加入 1l SYBR green I， 确定样品中是否有目的菌的具体标准 为 ： 若反应液出现绿色， 则说明有单核增生李斯特菌存在。 0052 图 1 LAMP 扩增结果， PC 为阳性对照， NC 为阴性对照。 （A） 在自然光照条件下 PC 在管底出现白色沉淀， NC 反应液为澄清液 ；（B） 在自然光照条件下， 加入 SYBR green I 后， PC 出现绿色， NC 呈淡黄色 ；（C） 在紫外光照条件下， 加入 SYBR green I 后， PC 出现亮绿色， NC 呈淡黄色 ；（D） 经 2% 琼脂糖凝胶电泳后， PC 出现

25、阶梯状条带， NC 物任何条带。 0053 图 2 PMA 处理去除死的单核增生李斯特菌的干扰。 （A） 经 PMA 处理或不处理的活 单核增生李斯特菌与热致死单核增生李斯特菌基因组 DNA 提取结果 ；（B） （C） 各组合所提 取的基因组作为模板进行的 LAMP 检测的结果。各组单核增生李斯特菌的浓度为 106 CFU/ mL。 0054 图 3 LAMP 检测的特异性验证。 0055 图4 LAMP检测的灵敏度验证。 1-5非别是10梯度稀释的单核增生李斯特菌， 其浓 度从 1.2105 到 1.2101 CFU/mL。 0056 通过表 1 的供试菌株的测试证明， 实施本发明的检测方法

26、进行检测具有很好的特 异性， 有良好的检测效果。检测在 2.5 小时内完成。 说 明 书 CN 102719535 B 7 1/2 页 8 SEQUENCE LISTING 南昌大学 快速检测食品中单核增生李斯特菌的方法 2012 6 PatentIn version 3.3 1 18 DNA 人工序列 1 aagctgcttttgatgctg 18 2 20 DNA 人工序列 TCGATTAAAAGTAGCGCCTT 2 aagttcaaatcatcgacggc 20 3 44 DNA 人工序列 3 cggctttgaaggaagaatttttgatcgtaagcggaaaatctgtc 44 序 列 表 CN 102719535 B 8 2/2 页 9 4 44 DNA 人工序列 4 tacggaggttccgcaaaagattttcaaaatatcgcgtaagtctc 44 5 23 DNA 人工序列 序 列 表 CN 102719535 B 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102719535 B 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102719535 B 11