与冠心病相关的多个基因单核苷酸多态性位点与环境因素组合及其应用.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102758010 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102758010 A *CN102758010A* (21)申请号 201210189390.2 (22)申请日 2012.06.07 C12Q 1/68(2006.01) C12M 1/34(2006.01) (71)申请人 中国医学科学院阜外心血管病医院 地址 100037 北京市阜城门外北礼士路 167 号 (72)发明人 顾东风 黄建凤 鲁向锋 王来元 陈恕凤 李宏帆 (74)专利代理机构 北京三友知识产权代理有限 公司 11127 代理人 丁香兰 韩蕾 (54) 发明名称 与冠心病相关

2、的多个基因单核苷酸多态性位 点与环境因素组合及其应用 (57) 摘要 本发明涉及与冠心病相关的多个基因单核 苷酸多态性位点与环境因素组合及其应用， 其 中， 所述的多个基因单核苷酸多态性位点包括 以 下 位 点 ： rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280 ； 所述的环境因素包括 个体吸烟、 饮酒、 体重指数信息以及静脉血中血糖 值和高密度脂蛋白胆固醇值。本发明基于这样的 组合因素建立了个体水平冠心病预测模型， 其在 评估人群冠心病患

3、病风险中具有重要应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 13 页 序列表 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 13 页 序列表 4 页 附图 2 页 1/3 页 2 1. 多个基因单核苷酸多态性位点与环境因素组合， 其中， 所述的多个基因单核苷酸多态性位点包括以下位点 ： rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280 ； 所述的环境因素包括个

4、体吸烟、 饮酒、 体重指数信息以及静脉血中血糖值和高密度脂 蛋白胆固醇值。 2. 根据权利要求 1 所述的多个基因单核苷酸多态性位点与环境因素组合， 其中， 所述 rs2123536 携带 T 等位基因、 rs1842896 携带 T 等位基因、 rs9349379 携带 G 等位 基因、 rs9268402 携带 G 等位基因、 rs12524865 携带 C 等位基因、 rs10757274 携带 G 等位基 因、 rs1333042 携带 G 等位基因、 rs7136259 携带 T 等位基因和 rs11066280 携带 A 等位基 因 ； 所述的环境因素包括个体是否吸烟、 是否饮酒、

5、 体重指数信息以及静脉血中血糖值和 高密度脂蛋白胆固醇值。 3.权利要求1或2的多个基因单核苷酸多态性位点与环境因素组合在制备用于评估待 测个体患冠心病风险的检测装置中的应用。 4. 检 测 单 核 苷 酸 多 态 性 位 点 rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280 的试剂、 以及检测个体环境 因素包括静脉血中血糖值和高密度脂蛋白胆固醇值的试剂组合， 在制备用于体外检测冠心 病相关因素的制剂、 试剂盒或用于评估待测个体患冠心病风险的

6、检测装置中的应用。 5.根据权利要求3或4所述的应用， 其中， 所述用于评估待测个体患冠心病风险的检测 装置包括检测单元以及数据分析单元 ； 所述检测单元是用于检测待测个体遗传信息和环境因素情况， 获得检测结果 ； 其中 检测遗传信息情况包括检测待测个体携带所述 9 个单核苷酸多态性位点的危险等位基 因情况， 所述 9 个单核苷酸多态性位点的危险等位基因分别是 ： rs2123536 多态性位点为 T、 rs1842896 多态性位点为 T、 rs9349379 多态性位点为 G、 rs9268402 多态性位点为 G、 rs12524865 多态性位点为 C、 rs10757274 多态性位

7、点为 G、 rs1333042 多态性位点为 G、 rs7136259 多态性位点为 T、 rs11066280 多态性位点为 A ； 检测环境因素情况包括检测待测 个体是否吸烟、 是否饮酒、 体重指数信息以及静脉血中血糖值和高密度脂蛋白胆固醇值 ； 所述数据分析单元是用于对检测单元的检测结果进行分析处理， 其中包括 ： 按照以下公式计算待测个体冠心病遗传危险因素评分 ： 遗传危险因素评分log(ORi)Ni， 其中ORi指第i个单核苷酸多态性位点的相对危 险度， Ni指待测个体所携带第 i 个单核苷酸多态性位点的危险等位基因数目 ； 按照评分值判断待测个体分组， 第1组G1 ： 0.1151

8、.200、 第2组G2 ： 1.2011.473、 第 3 组 G3 ： 1.474 1.737、 第 4 组 G4 ： 1.738 2.021、 第 5 组 G5 ： 2.022 2.972 ； 按照以下公式计算患冠心病相对患病风险评分 ： 患冠心病相对患病风险评分 exp(-0.220+0.232G2+0.403G3+0.534G4+0.852 G5+0.178 饮酒 +1.110 吸烟 +0.010 血糖值 +0.074 体重指数 +(-0.080) 高密 度脂蛋白胆固醇值 )/0.222 ； 吸烟、 饮酒为 “是” 或者 “否” ，“是” 为 1，“否” 为 0 ； 体重指数为 BMI

9、 体重 / 身高 2， 单位为 Kg/m2 ； 血糖、 高密度脂蛋白胆固醇测定方法为空腹 12 小时， 单 位为 mg/dl ； 权 利 要 求 书 CN 102758010 A 2 2/3 页 3 其中， 患冠心病相对患病风险评分的高低反映待测个体患冠心病危险性的高低。 6.根据权利要求3或4所述的应用， 其中， 所述多个基因单核苷酸多态性位点组合状态 提供待测个体患冠心病风险率信息， 所述 rs2123536 携带 T 等位基因、 rs1842896 携带 T 等 位基因、 rs9349379 携带 G 等位基因、 rs9268402 携带 G 等位基因、 rs12524865 携带 C

10、等位 基因、 rs10757274 携带 G 等位基因、 rs1333042 携带 G 等位基因、 rs7136259 携带 T 等位基 因和 rs11066280 携带 A 等位基因的个体患冠心病的风险升高 1.13 到 1.36 倍。 7. 体外检测来自待测个体的样品中单核苷酸多态性位点 ： rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280 的 试剂、 以及检测个体静脉血中血糖值和高密度脂蛋白胆固醇值的试剂组合， 在制备预测待 测个体患冠

11、心病的危险性的制剂、 试剂盒或检测装置中的应用， 其中， 所述 rs2123536 携带 T 等位基因、 rs1842896 携带 T 等位基因、 rs9349379 携带 G 等位基因、 rs9268402 携带 G 等 位基因、 rs12524865 携带 C 等位基因、 rs10757274 携带 G 等位基因、 rs1333042 携带 G 等位 基因、 rs7136259 携带 T 等位基因和 rs11066280 携带 A 等位基因的个体患冠心病的危险性 显著升高。 8. 根据权利要求 3、 4 或 7 所述的应用， 其中所述的待测个体为中国汉族人 ； 优选地， 待 测样品来自待测

12、个体的血液、 尿、 唾液、 胃液、 头发或活组织检查。 9. 根据权利要求 4 或 7 所述的应用， 其中所述检测单核苷酸多态性位点 rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280 的试剂为 ： 用于直接测序法的试剂 ； 或用于聚合酶链式反应与限制性片断长度 多态性分析相结合的试剂 ； 或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂 ； 或用于聚 合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂 ； 或用于以下任一种 SNP 分型方法的试剂 ： 基于 杂

13、交的方法、 基于引物延伸的方法、 基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。 10. 一种用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置， 该装置包括检测单元以及数据 分析单元， 其中 ： 所述检测单元是用于检测待测个体遗传信息和环境因素情况， 获得检测结果 ； 其中 检测遗传信息情况包括检测待测个体携带所述 9 个单核苷酸多态性位点的危险等位基 因情况， 所述 9 个单核苷酸多态性位点的危险等位基因分别是 ： rs2123536 多态性位点为 T、 rs1842896 多态性位点为 T、 rs9349379 多态性位点为 G、 rs9268402 多态性位点为 G、 rs12524865 多态性位点

14、为 C、 rs10757274 多态性位点为 G、 rs1333042 多态性位点为 G、 rs7136259 多态性位点为 T、 rs11066280 多态性位点为 A ； 检测环境因素情况包括检测待测 个体是否吸烟、 是否饮酒、 体重指数信息以及静脉血中血糖值和高密度脂蛋白胆固醇值 ； 所述数据分析单元是用于对检测单元的检测结果进行分析处理， 其中包括 ： 按照以下公式计算待测个体冠心病遗传危险因素评分 ： 遗传危险因素评分log(ORi)Ni， 其中ORi指第i个单核苷酸多态性位点的相对危 险度， Ni指待测个体所携带第 i 个单核苷酸多态性位点的危险等位基因数目 ； 按照评分值判断待测

15、个体分组， 第1组G1 ： 0.1151.200、 第2组G2 ： 1.2011.473、 第 3 组 G3 ： 1.474 1.737、 第 4 组 G4 ： 1.738 2.021、 第 5 组 G5 ： 2.022 2.972 ； 按照以下公式计算患冠心病相对患病风险评分 ： 患冠心病相对患病风险评分 exp(-0.220+0.232G2+0.403G3+0.534G4+0.852 权 利 要 求 书 CN 102758010 A 3 3/3 页 4 G5+0.178 饮酒 +1.110 吸烟 +0.010 血糖值 +0.074 体重指数 +(-0.080) 高密 度脂蛋白胆固醇值 )/

16、0.222 ； 吸烟、 饮酒为 “是” 或者 “否” ，“是” 为 1，“否” 为 0 ； 体重指数为 BMI 体重 / 身高 2， 单位为 Kg/m2 ； 血糖、 高密度脂蛋白胆固醇测定方法为空腹 12 小时， 单 位为 mg/dl。 权 利 要 求 书 CN 102758010 A 4 1/13 页 5 与冠心病相关的多个基因单核苷酸多态性位点与环境因素 组合及其应用 技术领域 0001 本发明涉及与冠心病相关的多个基因单核苷酸多态性位点与环境因素组合 及其应用， 具体涉及包括 rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、

17、rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280 的单核苷酸多态性位点的遗传因素与待 测个体环境暴露因素包括吸烟、 饮酒等的组合， 以及基于这样的组合因素在评估人群冠心 病患病风险中的应用。 背景技术 0002 动脉粥样硬化性心脑血管病已成为世界范围关注的主要健康问题。 2004年的世界 卫生组织 (WHO) 报告显示， 全世界每年心血管疾病以冠心病和脑卒中为主导致的死亡人数 达高达 1720 万， 占所有死亡人数的三分之一。预计 2020 年这一数字将进一步增加 50， 高达 2500 万， 心血管疾病是全球人类的 “头号杀手” 。在中国进行的一项大

18、规模前瞻性研究 也显示， 心脏疾病已经成为中国人群的主要死亡原因， 分列男、 女性死亡原因的第 2 位和第 1 位。我国每年新发心肌梗死 50 万人， 随着生活方式的改变以及动脉粥样硬化相关的危险 因素持续增加， 冠心病与心肌梗死发病也还将呈持续上升趋势。 0003 目前已确认的冠心病环境危险因素包括 ： 吸烟、 饮酒、 肥胖和血脂异常等。大量的 研究资料表明， 冠心病是一种复杂疾病， 是由多个微效基因与环境因素长期相互作用所致。 因此鉴定出与冠心病相关的易感基因或致病基因并与环境危险因素相结合， 在人群中进一 步筛选增加疾病风险的易感基因确定易感个体， 将有助于冠心病的发病风险预测、 新药开

19、 发、 诊断和个体化治疗。从基础到临床， 人们对此进行了大量的研究， 并在冠心病的危险因 素和冠心病发生的病理生理学方面积累了大量的知识， 但是关于冠心病与心肌梗死发生的 确切遗传分子机制却知之甚少， 对于怎样鉴定遗传易感基因以及鉴定受试者的冠心病遗传 易感性， 一直缺乏全面系统有效的识别方法。 0004 早期识别冠心病高危人群， 采取针对性的生活方式干预， 是减少冠心病发生， 从而 遏制医疗费用增长、 延长期望寿命的关键。 目前， 大家普遍认为在个体水平采用模型方法利 用个体传统危险因素水平是识别冠心病高危人群的有效方法。危险预测已为疾病预防、 政 府决策和卫生干预方案效果评价， 同时也可以

20、为临床治疗提供可参考的信息。全基因组学 技术与流行病学方法的整合为人类复杂疾病或性状的生物学研究带来了全新的视角。 个体 风险评估是其临床决策的一个重要组成部分， 若据此采取更早或更强的干预措施， 患者有 可能从中受益。目前已发现， 冠心病相关的遗传易感性基因座可对冠心病发病风险发挥独 立影响， 因此应重新评估这些遗传变异在疾病风险预测中的作用。以有效提高疾病风险预 测的能力， 从而在传统危险因素的基础上进一步加强对疾病风险的认识。 发明内容 0005 针对上述问题， 本发明的一个目的是提供一种多个基因单核苷酸多态性位点与环 说 明 书 CN 102758010 A 5 2/13 页 6 境因

21、素的组合 ； 本发明的另一个目的是提供所述的多个基因单核苷酸多态性位点与环境因 素组合的应用， 具体是其在制备用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置中的应用 ； 本 发明的另一个目的是提供一种检测本发明的多个基因单核苷酸多态性位点与环境因素的 方法 ； 本发明的另一目的是提供一种体外检测冠心病相关多个基因单核苷酸多态性位点与 环境因素的方法 ； 本发明的另一目的是提供一种检测本发明的多个基因单核苷酸多态性位 点与环境因素的试剂组合在制备用于体外检测冠心病相关因素的制剂、 试剂盒或检测装置 或模型中的应用 ； 本发明的另一目的是提供一种体外检测来自待测个体的样品中多个基因 单核苷酸多态性位点与环

22、境因素的试剂组合在制备预测待测个体患冠心病的危险性的制 剂、 试剂盒或检测装置或模型中的应用 ； 本发明的另一目的是提供一种体外预测待测个体 患冠心病的危险性的方法。 0006 本发明的另一目的是提供一种用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置， 根据 基因多态性以及环境因素预测个体冠心病发病风险， 能够很好的识别冠心病的高危人群， 从而针对性的进行干预， 达到延缓和预防冠心病发生的目的。 0007 首先， 本发明提供了一种多个基因单核苷酸多态性位点与环境因素组合， 其中， 所述的多个基因单核苷酸多态性位点包括以下位点 ： rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9

23、268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280 ； 所述的环境因 素包括个体吸烟、 饮酒、 体重指数信息以及静脉血中血糖值和高密度脂蛋白胆固醇值。 0008 本发明中， 所述的多个基因单核苷酸多态性位点 ： rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280， 以 及所述的环境因素 ： 个体是否吸烟、 是否饮酒、 体重指数信息以及静脉血中血糖值和高密度 脂蛋白胆

24、固醇值等信息， 是在大量实验的基础上得出的。 在本发明的具体实施方式中， 利用 FludigmEP1TMGENETIC ANALYSIS system， Taqman MGB探针法对7012例冠心病患者和8579 例对照样本进行基因分型实验， 对数据进行大量实验研究分析， 首次得出上述 9 个 SNP 位 点 (rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280) 与冠心病易感性显著相关， 并提出环境因素 ： 个体是否吸烟、 是 否饮酒、 体重

25、指数信息以及静脉血中血糖值和高密度脂蛋白胆固醇值等信息与冠心病易感 性的相关性。 0009 在本发明的大量实验结果基础上， 本发明的进一步研究发现， 这些 SNPs 的危险等 位基因分别是 ： rs2123536 多态性位点为 T、 rs1842896 多态性位点为 T、 rs9349379 多态性 位点为 G、 rs9268402 多态性位点为 G、 rs12524865 多态性位点为 C、 rs10757274 多态性位 点为 G、 rs1333042 多态性位点为 G、 rs7136259 多态性位点为 T、 rs11066280 多态性位点为 A。携带这些危险等位基因的个体发生冠心病的

26、相对风险是没有携带者的 1.13 到 1.36 倍。 另一方面， 在所述环境因素中， 个体吸烟、 饮酒、 体重指数信息以及静脉血中血糖值和高密 度脂蛋白胆固醇值等均与冠心病易感性相关。 0010 从而， 一方面， 本发明提供一种检测本发明的多个单核苷酸多态性位点与环境因 素的方法。其中， 检测所述环境因素包括个体吸烟、 饮酒、 体重指数信息以及静脉血中血糖 值和高密度脂蛋白胆固醇值的方法均是所属领域的常规方法， 本发明不再赘述。检测本发 明的多个单核苷酸多态性位点也可用本领域已知的多种技术在 DNA 水平、 RNA 水平检测本 发明所述的多个单核苷酸多态性位点。例如 ： 说 明 书 CN 10

27、2758010 A 6 3/13 页 7 0011 可以采用直接测序的方法， 通过 DNA 直接测序可以直接揭示对照基因和携带突变 基因之间的序列差异， 具体可以是传统的使用商业测序试剂盒或自动测序仪对 DNA 直接进 行测序， 或是近年来发展的焦磷酸测序 (Pyrosequencing)、 微测序 (SNaPshot) 等。焦磷酸 测序技术适于对已知的短序列的测序分析， 其原理是引物与模板DNA退火后， 在DNA聚合酶 (DNA polymerase)、 ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、 荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺 苷双磷酸酶 (Apyrase)4 种酶的协

28、同作用下， 将引物上每一个 dNTP 的聚合与一次荧光信号 的释放偶联起来， 通过检测荧光的释放和强度， 达到实时测定DNA序列的目的。 SnaPshot技 术平台是Applied Biosystems， ABI公司推出了专为检测SNP设计的分析软件和试剂盒， 可 对多个 SNP 位点同时进行基因分型， 也被称为 minisequencing， 该方法针对不同突变位点 设计不同长度的引物 SNaPshot 反应后， 产物通过电泳分离、 五色荧光检测、 Gene mapper 分 析， 可在一次电泳胶内检测多个 SNP 位点。 0012 也可以采用基于杂交的方法， 具体包括Taqman探针法，

29、DNA芯片法等。 TaqMan SNP 基因分型原理 ： 利用核酸外切酶对 5 特异等位基因染色标记的切除产生持续的检验信号， 反应体系包括 ： 以基因组 DNA 或 PCR 产物为模板 ； 一对 PCR 引物， 以及分别用 FAM 和 VIC 标 记的 2 条 MGB 探针检测 SNP 的两种类型 ； 在 PCR 反应终点读取分型数据。DNA 芯片技术 ： 待 测基因经提取后， 被切成长短不一的片段， 经荧光化学物质标记后， 注射到嵌有芯片的载片 上， 由于 DNA 和探针杂交的程度与荧光强度相关， 因此通过激光扫描， 即可根据荧光强弱测 出被检测序列的变异。 0013 还可以采用基于引物延

30、伸的方法， 如基质辅助激光解析离子飞行时间质谱 (MALDI-Tof-MS)。基质辅助激光解析离子飞行时间质谱检测原理 ： 紧挨 SNP 位点设计一段 探针， 在反应体系中以 ddNTP 替代 dNTP， 使探针仅在 SNP 位点处延伸一个碱基即终止， 根据 SNP 位点的不同， 探针将结合不同的 ddNTP， 从而具有不同的分子量， 质谱仪即可检测出这 种分子量差异， 从而实现 SNP 分型的目的。 0014 还可以采用基于构象的方法， 具体例如限制性片段长度多态性 (RFLP) 分析、 单链 构象多态性 (single-strand conformational polymorphism，

31、 SSCP) 分析、 变性梯度凝胶 电泳 (denauring gradient gel electrophoresis， DGGE) 分析、 变性高效液相色谱技术 (denaturing high performance liquid chromatography， dHPLC)等分析技术。 其中， RFLP 的原理 ： 有些 SNP 多态位点正好处于限制性内切酶的识别位点处， 其中一种多态对应的 PCR 扩增片断能够被相应的内切酶切动， 而另一种却不能， 因此通过对酶切后的 PCR 产物电泳 后的片断长度分析可知检测样本在该位点处的基因型 ； 如果检测 SNP 位点不存在合适的酶 切位点，

32、 往往可以通过在 PCR 引物 3 端改变个别碱基引入限制性内切酶酶切位点， 通过这 种引物修饰法可以实现绝大多数 SNP 位点的分型都能用 RFLP 分析来实现。SSCP ： 在非变性 的条件下， 单链 DNA 具有一定的折叠结构， 这种折叠结构是由它的核苷酸序列决定的， SSCP 的灵敏性依赖于 SNP 对折叠的影响和折叠如何影响目的序列的电泳迁移率， 其策略是， 将 PCR 扩增的待测片段与去离子甲酰胺混合， 接着 95变性解链， 再骤冷到冰中， 然后通过非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ； 稳定的理想条件下， 凝胶电泳分离的结果是在某一位置范 围内杂合子包含分隔很近的两条带， 正常的 D

33、NA 片段居于其中一条带， 纯合突变 SNP 的 DNA 片段居于另一条带。 DGGE ： 利用双链DNA分子在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳时， 会在 一定变性剂浓度下发生部分解链， 导致电泳迁移率下降 ； 分别具有一种 SNP 等位基因型的 说 明 书 CN 102758010 A 7 4/13 页 8 两种 DNA 分子间即使只有一个碱基对的差异， 也会在不同时间发生部分解链， 从而被分离 成两条带。DHPLC ： 该技术是一项在 SSCP 和 DGGE 基础上发展起来的检测 SNP 的突变技术， 此技术将未知的DNA片段与野生型DNA混和， 经加热变性后再使其降温重退火， 若为有突变

34、的 DNA， 此时所形成的双螺旋有两种， 即为同源双螺旋和异源双螺旋， 基于同源双螺旋和异 源双螺旋解链温度的不同， 通过控制 DHPLC 的温度， 使其维持在接近 DNA 分子 Tm 值下运行， 然后进行洗脱， 越小的 DNA 分子与柱的亲和力越小， 就越容易洗脱下来 ； DNA 经过 PCR 扩后， 由于错配碱基的存在而形成异源双链， 因为单链 DNA 所带的电荷比双链少， 先被洗脱下来， 而与正常的配对双链分开， 最后根据色谱峰的峰型或数目来确定 SNP 的有或无。 0015 还可以采用高分辨率溶解曲线分析技术 (HRM)。该分析技术是依据在一定的温度 范围内将 PCR 扩增的产物进行变

35、性， 期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化， 可绘制溶解曲线。每一段 DNA 都有其独特的序列， 因而也就有了独特的熔解曲线形状， 如同 DNA指纹图谱一样， 具有很高的特异性、 稳定性和重复性。 根据曲线准确区分野生型纯合子、 杂合子和突变性纯合子。 0016 在具体实施时， 本领域的技术人员可以根据实际情况选择上述的任一种技术体外 检测本发明所述多个基因标签单核苷酸多态性位点。也可以采用多种技术的组合来体外 检测所述多个基因标签单核苷酸多态性位点。例如， 当限制性片断长度多态性分析方法与 PCR 结合后， 检测灵敏性和特异性更高。当直接测序法与 PCR 结合使用时， 检测灵敏性大

36、 大提高。在本发明的一个具体实施方式中， 应用的是 Taqman MGB 方法， 使用的是 Fludigm EP1TMGENETIC ANALYSIS system平台， 由于该平台是属于较高通量的基因分型平台， 在样本 数为 96 个样本检测 96 个位点 ( 使用 96.96 动态芯片 ) 或 48 个样本检测 48 个位点 ( 使用 48.48 动态芯片 ) 时， 具有经济高效的优点。而在具体到本发明的方案应用于少量待测样 品的分析检测时， 采用 FludigmEP1TMGENETIC ANALYSIS system 平台就不具备经济性和效 率上的优势， 此时可采用实时荧光定量 PCR

37、系统， 如 Applied Biosystems 的 7900HT(Fast) real time PCR系统、 7500real time PCR系统等， 应用Taqman-MGB探针法对单个位点进行 基因分型 ； 也可以应用 PCR-RFLP、 HRM 等其他基因分型方法。 0017 此外， 本发明还可进一步包括对所述多个单核苷酸多态性位点的检测结果进行统 计分析。 例如， 在本发明的一个实施方式中， 对由本发明的标签单核苷酸多态性位点的结果 进行统计分析， 并建立了用于评估待测个体患冠心病风险的模型， 进而提供了一种用于评 估待测个体患冠心病风险的检测装置。 0018 根据本发明所提供的

38、用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置， 包括检测单元 以及数据分析单元， 其中 ： 0019 所述检测单元是用于检测待测个体遗传信息和环境因素情况， 获得检测结果 ； 其 中检测遗传信息情况包括检测待测个体携带所述 9 个单核苷酸多态性位点的危险等位基 因情况， 所述 9 个单核苷酸多态性位点的危险等位基因分别是 ： rs2123536 多态性位点为 T、 rs1842896 多态性位点为 T、 rs9349379 多态性位点为 G、 rs9268402 多态性位点为 G、 rs12524865 多态性位点为 C、 rs10757274 多态性位点为 G、 rs1333042 多态性位点为

39、G、 rs7136259 多态性位点为 T、 rs11066280 多态性位点为 A ； 检测环境因素情况包括检测待测 个体是否吸烟、 是否饮酒、 体重指数信息以及静脉血中血糖值和高密度脂蛋白胆固醇值 ； 0020 所述数据分析单元是用于对检测单元的检测结果进行分析处理， 其中包括 ： 说 明 书 CN 102758010 A 8 5/13 页 9 0021 按照以下公式计算待测个体冠心病遗传危险因素评分 ： 0022 遗传危险因素评分log(ORi)Ni， 其中ORi指第i个单核苷酸多态性位点的相 对危险度， Ni指待测个体所携带第 i 个单核苷酸多态性位点的危险等位基因数目 ； 0023

40、按照评分值判断待测个体分组， 第 1 组 G1 ： 0.115 1.200、 第 2 组 G2 ： 1.201 1.473、 第 3 组 G3 ： 1.474 1.737、 第 4 组 G4 ： 1.738 2.021、 第 5 组 G5 ： 2.022 2.972 ； 0024 按照以下公式计算患冠心病相对患病风险评分 ： 0025 患冠心病相对患病风险评分 exp(-0.220+0.232G2+0.403G3+0.534G4+0. 852G5+0.178饮酒+1.110吸烟+0.010血糖值+0.074体重指数+(-0.080)高 密度脂蛋白胆固醇值 )/0.222 ； 吸烟、 饮酒为 “

41、是” 或者 “否” ，“是” 为 1，“否” 为 0 ； 体重指数 为 BMI 体重 / 身高 2， 单位为 Kg/m2 ； 血糖、 高密度脂蛋白胆固醇测定方法为空腹 12 小时， 单位为 mg/dl。 0026 本发明所述的用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置， 可以是虚拟装置， 只 要能实现所述检测单元以及数据分析单元的功能即可。 所述的检测单元可以是包括各种检 测试剂、 试剂盒或检测仪器 ； 所述的数据分析单元可以是任何可以实现对检测单元的检测 结果进行分析处理而得出待测个体冠心病遗传危险因素评分的运算仪器、 模块或是虚拟设 备， 例如可以是预先按照上述遗传危险因素评分公式而制定的数据

42、图表， 将检测单元的检 测结果对照该数据图表即能得出遗传危险因素评分数值。 0027 根据本发明的具体实施方案， 本发明中， 所述患冠心病相对患病风险评分的高低 反映待测个体患冠心病危险性的高低。 0028 在本发明的具体实施方式中， 为了实际应用中方便评估待测个体患冠心病风险， 检测了 8579 个健康人和 7012 个冠心病患者携带所述 9 个 SNP 基因单核苷酸多态性位点的 危险等位基因情况， 按照以下公式计算每个研究对象进行冠心病遗传危险因素评分 ： 遗传 危险因素评分 log(ORi)Ni， 其中 ORi指第 i 个 SNP 的相对危险度， Ni指研究对象 ( 待 测个体 ) 所携

43、带第 i 个 SNP 的危险等位基因数目 ； 并根据所有研究对象冠心病遗传危险因 素评分将研究对象等分为 5 组， 建立了冠心病患病风险对照模型。在本发明的具体实时方 式中， 所述的 5 组分别为第 1 组 0.115 1.200、 第 2 组 1.201 1.473、 第 3 组 1.474 1.737、 第 4 组 1.738 2.021 和第 5 组 2.022 2.972 ； 冠心病遗传危险因素评分最低组 到最高组， 冠心病患病风险逐渐升高。在此基础上， 进一步结合环境因素， 建立了预测模 型， 可以计算患冠心病相对患病风险评分 ： 患冠心病相对患病风险评分 exp(-0.220+0.

44、2 32G2+0.403G3+0.534G4+0.852G5+0.178 饮酒 +1.110 吸烟 +0.010 血糖值 +0.074 体重指数 +(-0.080) 高密度脂蛋白胆固醇值 )/0.222。 0029 本发明中， 所述多个基因单核苷酸多态性位点组合状态能提供待测个体患冠心病 风险率信息， 所述 rs2123536 携带 T 等位基因、 rs1842896 携带 T 等位基因、 rs9349379 携 带 G 等位基因、 rs9268402 携带 G 等位基因、 rs12524865 携带 C 等位基因、 rs10757274 携带 G 等位基因、 rs1333042 携带 G 等

45、位基因、 rs7136259 携带 T 等位基因和 rs11066280 携带 A 等位基因的个体患冠心病的风险升高 1.13 到 1.36 倍。所述环境因素对于个体患冠心病的 风险也有一定相关性。 0030 从而， 另一方面， 本发明还提供了所述的多个基因单核苷酸多态性位点与环境因 素组合在制备用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置和模型中的应用。 说 明 书 CN 102758010 A 9 6/13 页 10 0031 另一方面， 本发明还提供了检测单核苷酸多态性位点 rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10

46、757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280 的试剂以及检测所述环境因素的试剂组合在制备用于体外检测冠心病相关因素 ( 包括冠 心病相关基因、 环境因素 ) 的制剂、 试剂盒或用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置 或模型中的应用。其中所述检测单核苷酸多态性位点 rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280 的试剂可以前 述方法中用到的试剂， 例如为 ： 用于直接测序法的试剂 ； 或用于聚合酶链式反应

47、与限制性 片断长度多态性分析相结合的试剂 ； 或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂 ； 或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂 ； 或用于以下任一种 SNP 分型方法的试 剂 ： 基于杂交的方法、 基于引物延伸的方法、 基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技 术。检测所述环境因素的试剂可以为所属领域中的常规试剂。 0032 另一方面， 本发明还提供了体外检测来自待测个体的样品中单核苷酸多态性位 点 ： rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和

48、 rs11066280 的试剂以及检测所述环境因素的试剂组合在制备预测待测个体 患冠心病的危险性的制剂、 试剂盒或检测装置中的应用， 其中， 所述 rs2123536 携带 T 等位 基因、 rs1842896 携带 T 等位基因、 rs9349379 携带 G 等位基因、 rs9268402 携带 G 等位基 因、 rs12524865 携带 C 等位基因、 rs10757274 携带 G 等位基因、 rs1333042 携带 G 等位基 因、 rs7136259 携带 T 等位基因和 rs11066280 携带 A 等位基因的个体患冠心病的危险性显 著升高。 0033 含有本发明的基因的待

49、测样品可以从受试者的细胞获得， 如来自血液、 尿、 唾液、 胃液、 头发或活组织检查。优选来自血液。可以先从受试者的细胞获得含有本发明的基因 的待测样品， 然后按照常规方法提取基因的 DNA。所述待测个体优选为中国汉族人。 0034 在本发明大样本的统计分析的基础上， 可以单独使用本发明的方法， 体外检测来 自待测个体的样品中单核苷酸多态性位点 rs2123536、 rs1842896、 rs9349379、 rs9268402、 rs12524865、 rs10757274、 rs1333042、 rs7136259 和 rs11066280 的携带等位基因情况以及 所述的环境因素情况， 以体外预测待测个体患冠心病的危险性， 达到体外预测待测个体患 冠心病危险性的目的。 0035 根据本发明的具体实施方案， 在利用本发明的技术评估待测个体患冠心病风险 时， 可按照以下操作进行 ： 0036 (1)收集研究对象(待测个体)环境暴露因素包括吸烟、 饮酒、 体重指数信息， 其中 体重指数等于体重 (Kg) 除以身高 (m) 的平方。抽取静脉血， 测定血糖和高密度脂蛋白胆固 醇。 0037 (2) 获取个体遗传危险因素评分。对 9 个冠心病患病风险的多态性位点 (SNP) (2p24.1 区域 rs2123536、 4q32.1 区域 r