EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210137005.X (22)申请日 2012.05.02 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 102776276 A (43)申请公布日 2012.11.14 (30)优先权数据 2011-103818 2011.05.06 JP 2012-094081 2012.04.17 JP (73)专利权人 爱科来株式会社 地址 日本京都府 (72)发明人 井口亚希 (74)专利代理机构 北京东方亿思知识产权代理 有限责任公司 11258 代理人 肖善强 (51)I

2、nt.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (56)对比文件 CN 101646786 A,2010.02.10, CN 101675169 A,2010.03.17, 审查员 张蕊 (54)发明名称 EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸 及其用途 (57)摘要 本发明提供EGFR外显子19多态性检测试验 用寡核苷酸及其用途， 所述EGFR外显子19多态性 检测试验用寡核苷酸能够简便且高灵敏度地检 测EGFR外显子19的多态性。 一种作为下述(P1)或 (P1 )的EGFR外显子19多态性检测试验用寡

3、核苷 酸及其用途： (P1)寡核苷酸， 其3 末端侧被进行 了延长抑制处理， 并且其相对于含有序列编号1 所示的碱基序列的至少第115位第123位碱基 的碱基长980的碱基序列具有至少80以上的 同一性； (P1 )寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延 长抑制处理， 并且其与含有序列编号1所示的碱 基序列的至少第115位第123位碱基的碱基长9 80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。 权利要求书1页 说明书23页 序列表7页 附图7页 CN 102776276 B 2016.09.28 CN 102776276 B 1.一种EGFR多态性检测试验用试剂盒， 包含： 具有从序列编号2至4的组中选

4、择的碱基 序列且3 末端侧被进行了延长抑制处理的多态性检测试验用寡核苷酸； 能够与含有作为靶 标的EGFR外显子19的多态性位点的核酸序列杂交且用荧光染料标记了的、 具有序列编号35 的碱基序列的探针； 以及能够扩增含有作为所述靶标的EGFR外显子19多态性位点的核酸序 列的引物对。 2.根据权利要求1所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒， 所述3 末端侧的延长抑制处 理为磷酸基的添加。 3.根据权利要求1所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒， 所述寡核苷酸包含用荧光染 料标记了的碱基。 权利要求书 1/1 页 2 CN 102776276 B 2 EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及

5、其用途 技术领域 0001 本发明涉及EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途。 背景技术 0002 表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor： EGFR)被认为在肺癌中 起重要的作用， 并且在肺癌治疗领域中使用着以抑制EGFR的功能为目的的药剂。 作为这样 的药剂， 已知非小细胞肺癌患者的治疗中使用的吉非替尼或厄洛替尼等EGFR酪氨酸激酶抑 制剂， 除肺癌之外正尝试将这些药剂应用于腺癌。 但是， 在某些范围的患者中， 有时不能充 分获得EGFR酪氨酸激酶抑制剂的效果。 另外， 在另一范围的患者中， 有时虽然对EGFR酪氨酸 激酶抑制剂初期具有反应

6、， 但是随后药剂不能达到所期待的或者更好的效果。 0003 因此， 在使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂时， 为了预测其效果而尝试探索了预测因素， 并发现了EGFR基因突变是重要的因素(非专利文献1、 2)。 0004 作为与药剂的感受性相关的突变， 例如， 已知EGFR的第790位和第858位的取代突 变、 EGFR基因的外显子19中的缺失突变等(非专利文献1、 2)。 尤其是， 所述EGFR基因的外显 子19中的缺失突变已知有在所述外显子19中缺失连续数个碱基十几个碱基的多个突变 型。 0005 另一方面， 近年来， 作为检测基因多态性的检测试验， 进行着利用熔解曲线分析 (Tm分析)的检测。

7、在该方法中， 在通过PCR法扩增含有突变的区域之后， 使用被荧光染料标 记了的核酸探针进行熔解曲线分析， 并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变 (例如， 参见专利文献1)。 0006 另外， 作为简便且灵敏度和可靠性优良的多态性检测方法， 已知一种多态性检测 方法， 包括： 在同一反应体系中使用突变型引物和野生型(正常型)引物来优先扩增含有突 变型碱基的核酸序列(参见专利文献2)。 0007 现有技术文献 0008 专利文献 0009 专利文献1： 日本专利特开2002-119291号公报 0010 专利文献2： 国际公开第2010/001969号小册子 0011 非专利文献 0012

8、 非专利文献1： PLoSMedicine， 2005年， Vol.2， No.3， p.225-235 0013 非专利文献2： JournalofClinicalOncology， 2005年， Vol.23， No.11， p.2513- 2520 发明内容 0014 发明要解决的问题 0015 但是， EGFR外显子19的突变中如上所述存在各种突变。 因此， 在使用针对每个突变 的引物的检测试验中， 需要在反应液中含有许多对突变型特异的引物。 制作许多引物存在 说明书 1/23 页 3 CN 102776276 B 3 设计变复杂的可能性， 另外， 同时使用多个引物有可能导致PCR反应

9、本身不能进行。 另外， 在 存在多个突变的情况下， 若没有含有充分比率的突变则有时无法检测。 0016 因此， 本发明的目的在于提供一种为了在检测EGFR外显子19的多态性的检测试验 中简便且灵敏度良好地检测相应多态性而有用的多态性检测试验用寡核苷酸及其用途。 0017 解决问题的手段 0018 本发明为如下所述。 0019 1一种EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸， 其为从包括下述(P1)和(P ) 的组中选择的至少一种寡核苷酸： 0020 (P1)寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且其相对于含有序列编号1 所示的碱基序列的至少第115位第123位碱基的碱基长980的

10、碱基序列具有至少80以 上的同一性； 以及 0021 (P1 )寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且其与含有序列编号1所 示的碱基序列的至少第115位第123位碱基的碱基长980的碱基序列的互补链在严谨条 件下杂交。 0022 2根据1所述的多态性检测试验用寡核苷酸， 所述多态性检测试验用寡核苷酸 为从包括能够与EGFR外显子19的碱基序列杂交的下述(P2)和(P2 )的组中选择的至少一种 寡核苷酸： 0023 (P2)寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且其相对于含有序列编号1 所示的碱基序列的至少第104123位碱基的碱基长2080的碱基序列具有至少80以上

11、的同一性； 以及 0024 (P2 )寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且其与含有序列编号1所 示的碱基序列的至少第104位第123位碱基的碱基长2080的碱基序列的互补链在严谨 条件下杂交。 0025 3根据2所述的多态性检测试验用寡核苷酸， 其中， 所述(P2)或(P2 )的寡核苷 酸在从5 末端起数第13位的位置具有与所述第104位的碱基对应的碱基。 0026 4根据2所述的多态性检测试验用寡核苷酸， 其中， 所述(P2)或(P2 )寡核苷酸 在5 末端具有与所述第104位的碱基对应的碱基。 0027 5根据14中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸， 其中， 所述多态性

12、 检测试验用寡核苷酸的碱基长为2550。 0028 6根据14中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸， 其中， 所述多态性 检测试验用寡核苷酸的碱基长为2642。 0029 7根据16中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸， 其中， 所述3 末端 侧的延长抑制处理为磷酸基的添加。 0030 8根据17中任一项所述的寡核苷酸， 其中， 所述多态性检测试验用寡核苷 酸的碱基序列上的碱基用荧光染料标记。 0031 9一种多态性检测方法， 用于检测EGFR外显子基因的多态性， 包括： 使用至少一 种18中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸来检测EGFR外显子19的多态性。 0032 10根据9所述的

13、多态性检测方法， 包括： 准备可含有具有序列编号1所示的碱 基序列的单链核酸的核酸试样； 使所述多态性检测试验用寡核苷酸和所述单链核酸接触， 说明书 2/23 页 4 CN 102776276 B 4 来获得含有该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸并且该单链核酸的核酸扩增被抑 制的杂交体； 以及对该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸接触时或者接触后的所述 核酸试样进行核酸扩增。 0033 11根据10所述的多态性检测方法， 其中， 在能够与含有作为靶标的EGFR外显 子19的多态性位点的核酸杂交的探针的存在下进行所述核酸扩增。 0034 12根据11所述的多态性检测方法， 其中， 所述探针

14、相对于所述多态性检测试 验用寡核苷酸的碱基序列具有45以上的同一性。 0035 13根据11或12所述的多态性检测方法， 其中， 所述探针是在未与靶标序列杂 交时发出荧光而与该靶标序列杂交时荧光强度减少的探针。 0036 14一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效判定方法， 包括： 通过913中任一项 所述的多态性检测方法来检测EGFR外显子19中的多态性； 以及基于所述检测结果来判定对 EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效。 0037 15一种EGFR多态性检测试验用试剂盒， 包含至少一种18中任一项所述的 多态性检测试验用寡核苷酸。 0038 16根据15所述的EG

15、FR多态性检测试验用试剂盒， 还包含： 能够与含有作为靶 标的EGFR外显子19的多态性位点的核酸序列杂交的探针。 0039 17根据16所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒， 其中， 所述探针相对于所述 多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列具有45以上的同一性。 0040 18根据1517中任一项所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒， 还包含： 能 够扩增含有作为所述靶标的EGFR外显子19多态性位点的核酸序列的引物对。 0041 发明效果 0042 通过本发明， 能够提供为了在检测EGFR外显子19的多态性的检测试验中简便且灵 敏度良好地检测相应多态性而有用的多态性检测试验用寡核苷酸及其用途

16、。 附图说明 0043 图1的(A)为核酸混合物的熔解曲线的示例， 图1的(B)为微分熔解曲线的示例； 0044 图2的(A)(D)为本发明实施例1涉及的试样的熔解曲线； 0045 图3的(A)(D)为本发明实施例2涉及的试样的熔解曲线； 0046 图4的(A)(D)为本发明实施例3涉及的试样的熔解曲线； 0047 图5的(A)(D)为本发明比较例1涉及的试样的熔解曲线； 0048 图6的(A)和(B)为本发明比较例2涉及的试样的熔解曲线； 0049 图7的(A)(D)为本发明比较例3涉及的试样的熔解曲线； 0050 图8的(A)和(B)为本发明比较例4涉及的试样的熔解曲线； 0051 图9的

17、(A)(E)为本发明实施例4涉及的试样AE的熔解曲线； 0052 图10的(A)(E)为本发明实施例4涉及的试样FJ的熔解曲线； 0053 图11的(A)(E)为本发明的实施例5和比较例5涉及的试样5-15-5的熔解曲线。 具体实施方式 0054 本发明涉及的EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸(以下有时仅称为 “多态 说明书 3/23 页 5 CN 102776276 B 5 性检测试验用寡核苷酸” )是一种寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且是相 对于含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位第123位碱基的碱基长980的碱基 序列具有相同的碱基长并且同源的序列，

18、即是从包括下述(P1)和(P )的组中选择的至少一 种EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸。 0055 (P1)寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且相对于含有序列编号1所 示的碱基序列的至少第115位第123位碱基的碱基长980的碱基序列具有至少80以上 的同一性； 0056 (P1 )寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且与含有序列编号1所示 的碱基序列的至少第115位第123位碱基的碱基长980的碱基序列的互补链在严谨条件 下杂交。 0057 本发明涉及的多态性检测试验用试剂盒包含所述EGFR外显子19多态性检测试验 用寡核苷酸。 0058 本发明涉及的

19、EGFR基因多态性检测方法包括： 使用至少一种所述EGFR外显子19多 态性检测试验用寡核苷酸来检测EGFR外显子19的多态性。 0059 本发明涉及的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效判定方法包括： 通过所述EGFR外显子 19多态性检测方法来检测EGFR基因中的多态性； 以及基于所述检测结果来判定对EGFR酪氨 酸激酶抑制剂的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效。 0060 通过本发明， 具有相对于序列编号1所示的EGFR基因的特定的一部分具有相同的 碱基长并且同源的碱基序列、 即具有至少80以上的同一性和/或可与该特定的一部分碱 基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列、 并且3 末端侧被进行

20、了延长抑制处理的寡核苷 酸， 由于与可含有多态性的野生型EGFR外显子19的碱基序列的该一部分具有高亲和性， 因 此比突变型EGFR外显子19的核酸更优先并且牢固地与野生型EGFR外显子19的核酸杂交。 另 外， 所述多态性检测试验用寡核苷酸由于3 末端侧进行了延长抑制处理， 因此在与野生型 EGFR基因的核酸杂交之后， 即使应用DNA聚合酶也不延长。 0061 所述多态性检测试验用寡核苷酸为优选用于EGFR外显子19多态性检测试验的寡 核苷酸。 在将所述多态性检测试验用寡核苷酸用于EGFR基因多态性检测试验的情况下， 所 述多态性检测试验用寡核苷酸由于与其类似性高而与野生型EGFR基因核酸杂

21、交。 当在杂交 了的野生型EGFR基因核酸和与该杂交了的区域对应的区域内含有缺失或单核苷酸多态性 的突变型(多态性)EGFR基因核酸混合存在的环境下进行了核酸扩增等处理时， 野生型基因 的核酸序列的扩增由于多态性检测试验用寡核苷酸的存在而被抑制。 另一方面， 由于多态 性检测试验用寡核苷酸不与突变型EGFR基因的核酸序列杂交， 因此突变型EGFR基因的核酸 扩增不被抑制， 突变型EGFR基因的核酸序列优先扩增。 结果， 试样中比起野生型EGFR基因的 核酸序列存在更多的突变型EGFR基因的核酸序列， 从而能够高灵敏度地检测EGFR外显子19 的多态性。 可与所述多态性检测试验用寡核苷酸杂交的野

22、生型EGFR基因核酸是具有序列编 号1所示的碱基序列的互补序列的核酸。 0062 另外， 通过本发明， 由于如此能够简便且高灵敏度地检测EGFR外显子19的多态性， 因此能够简便且高灵敏度地判定基于EGFR外显子19多态性的、 对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的 耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效。 0063 本发明的 “EGFR基因” 具体是指EGFR外显子19。 本发明中的EGFR外显子19是已公知 说明书 4/23 页 6 CN 102776276 B 6 的， 其碱基序列是指NCBI登录号No.NT_033968(版本： NT_033968.6)的48317174832003的 序列。

23、序列编号1的碱基序列相应于EGFR外显子19的核酸的碱基序列的一部分。 0064 在本说明书中， 特别将可与所述多态性检测试验用寡核苷酸杂交的野生型EGFR基 因的碱基序列的区域称为 “扩增抑制靶标区域” 。 0065 在本说明书中， 作为检测对象的EGFR基因的多态性中， 包括在野生型EGFR基因的 对应序列中缺失了由多个连续的碱基构成的区域的多态性， 只要可以检测， 也可以包括缺 失一个碱基的多态性、 碱基连续一个或者两个以上被其他的碱基取代的多态性。 此外， 本发 明中的作为检测对象的EGFR基因的多态性只要其一部分中含有扩增抑制靶标区域， 也可以 同时含有两个以上的多态性。 0066

24、在本发明中，“多态性检测试验” 是指为了检测特定的基因多态性而被使用的试 验， 不拘泥于试验、 测定、 检测方法、 评价方法、 判定方法等表述， 意指判定核酸试样中的核 酸中是否含有具有多态性的突变型的一切行为。 0067 在本发明中， 关于作为检测对象的试样中的试样核酸、 多态性检测试验用寡核苷 酸、 引物或者探针的每个的序列， 基于它们的相互互补的关系所描述的事项， 只要不特别指 出， 也适用于各个序列和相对于各序列互补的序列。 在将本发明的事项适用于相对于各序 列互补的该序列时， 在本领域技术人员的技术常识的范围内， 由该互补的序列识别的序列， 视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记

25、载的序列互补的序列。 0068 在本说明书中，“模板核酸序列” 意指在进行核酸扩增时被引物识别为模板并退火 的碱基序列。 0069 在本发明中，“Tm值” 是指双链核酸解离的温度(解离温度： Tm)， 一般定义为260nm 处的吸光度达到吸光度总上升量的50时的温度。 即， 当加热含有双链核酸(例如双链核酸 DNA)的溶液时， 260nm处的吸光度上升。 这是因为双链核酸DNA中的两条双链之间的氢键由 于加热而断裂， 解离成单链DNA(DNA的熔解)。 并且， 全部双链核酸DNA解离成单链DNA时， 其 吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链核酸DNA的吸光度)的约1.5倍左右， 由此可以判

26、断熔解完成。 Tm值基于该现象而设定。 本发明中的Tm值只要不特别指出， 均是指吸光度达到 吸光度总上升量的50时的温度。 0070 在本发明中， 关于寡核苷酸的序列， 当称为 “从3 末端起数第13位” 时是以寡核 苷酸链的3 末端为第1位起数的。 同样地， 当称为 “从5 末端起数第13位” 时是以寡核苷酸 链的5 末端为第1位数的。 0071 本说明书中 “步骤” 一词， 不仅包含独立的步骤， 而且例如在不能与其他的步骤明 确区别的情况下， 只要达到了本步骤预期的效果， 则包含在本术语之内。 0072 另外， 在本说明书中， 使用 “” 表示的数值范围表示分别包含 “” 的前后记载的 数

27、值作为最小值和最大值的范围。 0073 另外， 在本发明中， 组成物中的各成分的量， 在所述组成物中存在多种相当于各成 分的物质的情况下， 只要不特别指出， 是指组成物中存在的该多种物质的合计量。 0074 下面说明本发明。 0075 0076 所述多态性检测试验用寡核苷酸是一种EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷 酸， 其为从包括下述(P1)和(P )的组中选择的至少一种寡核苷酸： 说明书 5/23 页 7 CN 102776276 B 7 0077 (P1)寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且其相对于含有序列编号1 所示的碱基序列的至少第115位第123位碱基的碱基长9

28、80的碱基序列具有至少80以 上的同一性； 0078 (P1 )寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且其与含有序列编号1所 示的碱基序列的至少第115位第123位碱基的碱基长980的碱基序列的互补链在严谨条 件下杂交。 0079 所述多态性检测试验用寡核苷酸需要是： 与含有序列编号1所示的碱基序列的至 少第115123位碱基的预定区域的碱基序列具有至少80以上的同一性、 或者与该预定区 域的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列。 通过含有第115位第123位的碱基， 例 如能够高灵敏度地检测具有在序列编号1所示的碱基序列的第115位或其之后缺失一个或 多个碱基的多态性。 此外，

29、 序列编号1所示的第115位的碱基对应于EGFR外显子19的第744位 的密码子的3 侧的碱基。 0080 所述P1寡核苷酸的相对于所述预定区域的碱基序列的同一性需要是至少80以 上。 另外， 从检测灵敏度的观点来说， 可以为85以上、 可以为90以上、 可以为95以上、 另外可以为96以上、 可以为97以上、 可以为98以上、 可以为99以上。 0081 所述P1 寡核苷酸为与所述序列编号1所示的碱基序列中的所述预定区域的碱基 序列的互补链在严谨条件下杂交的序列。 0082 杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法， 例如MolecularCloning 3rd(J.Sambrooket

30、al.， ColdSpringHarborLab.Press， 2001)中记载的方法等来进行。 该文献通过参考被并入本说明书中。 0083 严谨条件是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。 典型的严谨条 件例如可以举出在钾浓度约25mM约50mM以及镁浓度约1.0mM约5.0mM中进行杂交的条 件。 作为本发明的条件的示例， 可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、 25mM的KCl以及1.5mM的MgCl2 下进行杂交的条件， 但不限于此。 此外， 严谨条件被记载在MolecularCloning3rd (J.Sambrooketal.， ColdSpringHarborLab

31、.Press， 2001)中。 该文献通过参考被并入 本说明书中。 本领域技术人员可以通过改变杂交反应、 杂交反应液的盐浓度等来容易地选 择上述条件。 0084 另外， 本发明中的所述P1或所述P1 寡核苷酸还包括在所述P1或所述P1 寡核苷酸 被插入、 缺失或者取代了1个或2个以上的碱基的寡核苷酸。 0085 所述被插入、 缺失或者取代了碱基的多态性检测试验用寡核苷酸只要显示出与所 述P1或所述P1 寡核苷酸同等程度的作用即可， 在插入、 缺失或取代了1个或2个以上的碱基 的情况下， 该插入、 缺失或取代的位置无特别限定。 作为插入、 缺失或者取代的碱基的数量 可以举出1个碱基或2个碱基以上

32、， 所述碱基的数量根据多态性检测试验用寡核苷酸总体的 长度而不同， 例如可以为1个碱基10个碱基、 或者1个碱基5个碱基、 或者1个碱基3个 碱基。 0086 所述多态性检测试验用寡核苷酸所具有的碱基序列的第1位碱基的位置不限于序 列编号1的第115位的位置， 例如既可以是序列编号1所示的碱基序列的第60位第115位的 任何碱基， 也可以是第100位第110位的任何碱基， 也可以是第102位第106位的任何碱 基。 说明书 6/23 页 8 CN 102776276 B 8 0087 所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长需要为与含有所述序列编号1所示的碱 基序列的至少第115位第123位碱基的

33、碱基长9mer80mer的碱基序列相同的9mer 80mer。 在所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长为8mer以下或81mer以上时， 不能期待 目标的检测灵敏度。 多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长可以设为20mer80mer， 也可以 设为10mer70mer， 也可设为25mer50mer， 也可以设为26mer42mer。 碱基长较短的多态 性检测试验用寡核苷酸例如具有更可靠地抑制野生型核酸的核酸扩增从而检测灵敏度变 高的倾向。 0088 作为这样的多态性检测试验用寡核苷酸， 例如可以为： 以序列编号1所示的碱基序 列的第60115位的任一碱基为第1位碱基的10mer80mer的寡核苷

34、酸， 也可以为以第100 第110位的任一碱基为第1位碱基的25mer50mer的寡核苷酸， 也可以为以第102第106 位的任一碱基为第1位碱基的26mer42mer的寡核苷酸。 这种寡核苷酸例如具有更可靠地 抑制野生型核酸的核酸扩增从而检测灵敏度变高的倾向。 0089 作为这种多态性检测试验用寡核苷酸， 例如可以举出从包括下述(P2)和(P2 )的 组中选择的至少一种寡核苷酸。 0090 (P2)寡核苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且其相对于含有序列编号1 所示的碱基序列的至少第104123位碱基的碱基长2080的碱基序列具有至少80以上 的同一性； 0091 (P2 )寡核

35、苷酸， 其3 末端侧被进行了延长抑制处理， 并且其与含有序列编号1所 示的碱基序列的至少第104位第123位碱基的碱基长2080的碱基序列的互补链在严谨 条件下杂交。 0092 如果所述P2或P2 寡核苷酸为含有序列编号1所示的碱基序列的第104位第123 位碱基的碱基长20mer80mer的碱基序列， 则P2或P2 寡核苷酸的第1位的碱基可以是与序 列编号1所示的碱基序列的任何碱基对应的碱基。 例如， P2或P2 寡核苷酸可以在从P2或P2 寡核苷酸的5 末端起数第13位的位置具有所述第104位的碱基， 也可以是5 末端侧、 即P2 或P2 寡核苷酸的第1位的碱基为所述第104位的碱基。 在

36、从3 末端起第13位、 尤其是在3 末端侧具有所述第104位碱基的寡核苷酸例如具有能够更可靠地抑制野生型核酸的核酸扩 增的倾向。 0093 所述P2 寡核苷酸中的严谨条件与所述P1 寡核苷酸中的严谨条件相同。 0094 另外， 本发明中的所述P2或所述P2 寡核苷酸中还包含所述P2或所述P2 寡核苷酸 被插入、 缺失或者取代了1个或多个碱基的寡核苷酸。 0095 所述P2或所述P2 寡核苷酸的碱基序列中插入、 缺失或取代的1个或2个以上的碱 基与所述P1和P1 寡核苷酸的碱基序列中插入、 缺失或取代的1个或2个以上的碱基相同。 0096 所述多态性检测试验用寡核苷酸还可以以检测多态性检测试验用

37、寡核苷酸或其 互补链等为目的而被标记。 0097 作为多态性检测试验用寡核苷酸上附加的标记物质一般可以举出荧光染料和荧 光团等。 标记物质一般被附加在寡核苷酸的碱基上， 但不限于此。 附加了所述标记物质的碱 基只要是多态性检测试验用寡核苷酸的任意碱基即可， 可以是任何位置。 通过将多态性检 测试验用寡核苷酸的任何位置的碱基作为用荧光染料标记的碱基， 具有可以有效地检测有 没有与多态性检测试验用寡核苷酸杂交的核酸等的优点。 说明书 7/23 页 9 CN 102776276 B 9 0098 所述多态性检测试验用寡核苷酸的3 末端侧需要被进行延长抑制处理。 这里，“延 长” 是指由使用了DNA聚

38、合酶或RNA聚合酶等酶的核酸扩增处理引起的核苷酸链的延长。 延 长抑制处理只要是抑制了从寡核苷酸链的5 末端向3 末端的延长的处理则无特别限制， 例 如可以举出对寡核苷酸链的3 末端侧的核酸添加取代基或化合物。 0099 作为这种为抑制延长而添加的取代基的例子， 可以举出磷酸基、 ddNTP基等， 作为 为抑制延长而添加的化合物的例子， 可以举出荧光染料、 2 ， 3 ddA、 2 ， 3 ddC、 2 ， 3 ddG、 2 ， 3 ddT等。 作为寡核苷酸链的延长抑制处理， 例如从可靠地抑制延长等观点来说， 可以是 对3 末端侧的核酸添加磷酸基的处理。 被添加所述取代基或化合物的核酸的位置根

39、据核酸 的延长中所用的手段而不同， 在使用DNA聚合酶或RNA聚合酶的情况下， 可以为(脱氧)核糖 的3位， 但不限于此。 0100 另外， 所述多态性检测试验用寡核苷酸也可以含有用荧光染料标记的碱基作为碱 基序列上的碱基。 0101 作为所述荧光染料无特别限制， 例如可以举出荧光素、 磷光体、 罗丹明、 聚甲炔染 料衍生物等， 作为市售的荧光染料例如可举出PacificBlue、 BODIPYFL、 FluorePrime、 Fluoredite、 FAM、 Cy3和Cy5、 TAMRA等。 0102 本发明涉及的多态性检测试验用寡核苷酸的示例如下所示。 表中的 “(P)” 表示磷 酸基。

40、在序列编号1所示的碱基序列中， Cmp-1为从第104位碱基起40mer的寡核苷酸， Cmp-2 为从第104位碱基起29mer的寡核苷酸， Cmp-3为从第115位碱基起28mer的寡核苷酸， Cmp-4 为第89位碱基起49mer的寡核苷酸， Cmp-5为第79位碱基起47mer的寡核苷酸， Cmp-6为从第 107位碱基起36mer的寡核苷酸， Cmp-7为第104位碱基起20mer的寡核苷酸， Cmp-8为从第104 位碱基起80mer的寡核苷酸， Cmp-9为从第63位碱基起80mer的寡核苷酸， Cmp-10为从第105 位碱基起39mer的寡核苷酸， Cmp-11为从第106位碱

41、基起38mer长的寡核苷酸， Cmp-12为从第 111位碱基起33mer的寡核苷酸， Cmp-13为从第115位碱基起29mer的寡核苷酸， Cmp-14第115 位碱基起10mer的寡核苷酸， Cmp-15为第106位碱基起78mer长的寡核苷酸。 0103 表1 0104 说明书 8/23 页 10 CN 102776276 B 10 0105 使用上述的多态性检测试验用寡核苷酸可检测的EGFR基因的突变(多态性)， 可以 举出序列编号1所示的碱基序列的第115位第123位碱基的区域中缺失了1个或多个碱基 的多态性。 作为此类突变型EGFR基因， 例如可以举出以下基因， 但不限于此。 此

42、外， 在表2中， “-” 表示缺失部， 小写字母表示突变部，“WT” 表示野生型EGFR外显子19(序列编号1的第104 位第151位)， 野生型基因的粗体字带下划线的 “G” 表示取代部。 0106 表2 0107 No. 序列编号 WT野生型CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAAC17 2E746_A750delGCCGTCGCTATCAA-AACATCTCCGAAAGCCAAC18 3E746_A750delGCCGTCGCTATCAAG-ACATCTCCGAAAGCCAAC19 4L747_E749del， A750PGCCGTC

43、GCTATCAAGGAA-CAACATCTCCGAAAGCCAAC20 5L747-T751delGCCGTCGCTATCAAGGAAT-CTCCGAAAGCCAAC21 6L747_S752del， P753SGCCGTCGCTATCAAGGAAT-CGAAAGCCAAC22 7L747-A750delPinsGCCGTCGCTATCAAGGAA-cCATCTCCGAAAGCCAAC23 8L747-S752delSinsGCCGTCGCTATCAAGGAA-CCGAAAGCCAAC24 9E746-T751delVinsGCCGTCGCTATCAAGG-tTCCGAAAGCCAAC25 1

44、0L747-A750delGCCGTCGCTATCAAGGAAT-CATCTCCGAAAGCCAAC26 12L747-S752delQinsGCCGTCGCTATCAAGGAA-CaGAAAGCCAAC27 13E747-S752delVinsGCCGTCGCTATCAAGG-tATCTCCGAAAGCCAAC28 14L747_S752del， E746VGCCGTCGCTATCAAGGt-TCCGAAAGCCAAC29 15E746-A750delVinsGCCGTCGCTATCAA-AatTCCGAAAGCCAAC30 17L747-E749， T751-S752deGCCGTCGCT

45、ATCAAGGAA-CAA-CCGAAAGCCAAC31 0108 0109 在后述的EGFR基因多态性检测方法中， 使用用于检测作为检测对象的EGFR基因多 态性的EGFR基因多态性检测探针(以下仅称为 “多态性检测探针” )。 0110 作为所述多态性检测探针， 可以是可检测在与所述多态性检测试验用寡核苷酸的 扩增抑制靶标位点对应的位置具有突变的多态性的多态性检测探针， 另外可以是可检测在 与该扩增抑制靶标位点对应的位置具有缺失的多态性的多态性检测探针。 0111 这样的多态性检测探针具体可以是可与和含有序列编号1所示的碱基序列的第 115位第123位碱基的碱基序列互补的核酸杂交的序列即可

46、。 有时将与含有序列编号1所 示的碱基序列的第115位第123位碱基的碱基序列互补、 并且可与多态性检测探针杂交的 碱基序列称为 “靶标序列” 。 0112 探针的长度无特别制限， 可以为5mer50mer， 也可以为10mer30mer。 若探针的 长度在这样的范围内， 例如能够提高检测灵敏度。 0113 所述多态性检测探针也可以具有相对于所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基 序列具有45以上的同一性的碱基序列。 如此通过将所述多态性检测探针设为相对于所述 多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列具有45以上的同一性的探针， 例如能够提高对含 有突变型的EGFR基因的试样核酸的灵敏度。 所述多态性检

47、测探针相对于所述多态性检测试 验用寡核苷酸的同一性可以设为55以上， 也可以设为65以上， 也可以设为80以上。 0114 另外， 只要多态性检测探针的序列中含有与作为检测对象的突变(例如缺失)位点 的5 末端侧的碱基对应的碱基则无特别限制。 多态性检测探针的碱基序列中， 与作为检测 对象的突变(缺失)位点对应的碱基可以位于从探针的5 末端起数第5位或其以后， 也可以 说明书 9/23 页 11 CN 102776276 B 11 位于第10位或其以后。 若相对于突变位点的碱基在多态性检测探针中的位置为这样的位 置， 例如能够提高检测灵敏度。 0115 另外， 作为多态性检测探针的序列， 可以

48、为与野生型的序列对应的碱基序列， 也可 以进一步含有突变。 作为多态性检测探针， 可以为相对于序列编号1所示的碱基序列或其互 补的序列具有70100的同一性的寡核苷酸， 也可以为具有80100的同一性的寡 核苷酸。 通过将多态性检测探针的序列设为野生型的对应的碱基， 例如能够提高检测灵敏 度。 0116 另外， 作为多态性检测探针， 可以为与序列编号1所示的碱基序列或其互补的序列 在严谨条件下杂交的寡核苷酸， 也可以为插入、 缺失或取代了1个或2个以上碱基的寡核苷 酸。 0117 关于严谨条件， 可以适用与多态性检测试验用寡核苷酸的部分中记载的条件相同 的条件。 另外， 关于同一性、 插入、

49、缺失或取代的范围， 也可以适用与多态性检测试验用寡核 苷酸的部分中记载的范围相同的范围。 0118 另外， 在使多态性检测探针在扩增步骤中与引物共存并使用的情况下， 为了防止 探针自身成为DNA聚合酶的反应对象而延长， 多态性检测探针可以在3 末端侧添加后述的 荧光标记， 也可以在探针的3 末端还添加磷酸基。 0119 从检测效率的观点来看， 多态性检测探针可以为带标记的标记探针。 0120 作为标记探针的标记物质的具体例， 例如可以举出荧光染料和荧光团。 0121 所述多态性检测探针例如可以为与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列 杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记探针。 其中， 可以为与靶标序列杂交时的 荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。 0122 利用了这种荧光淬灭现象(Quenchingphenomeno