一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102604934 A (43)申请公布日 2012.07.25 CN 102604934 A *CN102604934A* (21)申请号 201210093518.5 (22)申请日 2012.03.31 C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 盛司潼 地址 518057 广东省深圳市南山区高新区科 技中二路软件园二期 11 栋 4 楼北 402 室 (72)发明人 盛司潼 (54) 发明名称 一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序 的方法 (57) 摘要 本发明涉及基因工程领域， 提供一种基于固 相载体进行扩

2、增及进行核酸测序的方法。所述固 相载体表面固定有至少一个模板序列， 所述方法 包括以下步骤 ： A. 将引物结合于固相载体表面上 的引物结合位点， 得到固定有引物的扩增载体 ； B. 对扩增载体上的模板序列进行扩增， 得到扩增 产物。该方法基于表面固定有模板序列的固相载 体进行扩增， 能够将扩增产物固定于固相载体表 面， 提高固相载体表面的扩增产物结合量 ； 同时， 利用该扩增方法得到的固相载体进行测序， 能增 强测序的检测信号， 降低对检测仪器的要求， 在同 等检测条件下提高测序的准确性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 20 页 序列表 4 页 附图 5 页 (19)中

3、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 20 页 序列表 4 页 附图 5 页 1/2 页 2 1. 一种基于固相载体进行扩增的方法， 所述固相载体的表面固定有至少一个模板序 列， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤 ： A. 将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点， 得到固定有引物的扩增载体 ； B. 对扩增载体上的模板序列进行扩增， 得到扩增产物。 2.根据权利要求1所述的基于固相载体进行扩增的方法， 其特征在于， 步骤A所述引物 包括用于对所述模板序列进行扩增的上游引物和 / 或下游引物， 所述上游引物是与模板序 列 5 端互补结合的核酸序列， 所

4、述下游引物是与模板序列 3 端序列相同的核酸序列。 3.根据权利要求1所述的基于固相载体进行扩增的方法， 其特征在于， 步骤B中所述的 扩增方式是单分子扩增。 4. 根据权利要求 3 所述的基于固相载体进行扩增的方法， 其特征在于， 所述单分子扩 增方式包括乳液 PCR 扩增、 滚环扩增和桥式 PCR 扩增的任一种。 5.根据权利要求1至4中任一项所述的基于固相载体进行扩增的方法， 其特征在于， 所 述引物结合于固相载体表面的方式为 ： 引物与固相载体表面携带的基团进行配对连接， 实现直接结合 ； 或通过连接子携带的基团分别与引物和固相载体表面携带的基团进行配对连接， 实现 间接结合。 6.

5、根据权利要求 5 所述的基于固相载体进行扩增的方法， 其特征在于， 所述配对连接 的方式采用生物素 - 亲和素 / 链霉亲和素、 纳米金 / 碘乙酰 - 巯基、 氨基 - 醛基 / 羧基 / 异 硫氰基、 丙烯酰胺 - 硅烷基 / 聚丙烯酰胺中的至少一种。 7. 根据权利要求 5 所述的基于固相载体进行扩增的方法， 其特征在于， 所述固相载体 的材质采用玻璃、 硅胶、 陶瓷、 塑料和金属中的至少一种。 8.根据权利要求5所述的基于固相载体进行扩增的方法， 其特征在于， 在步骤A之前还 包括步骤 ： A0. 将模板序列通过基团配对方式结合于固相载体表面， 得到固定有至少一个模板序 列的固相载体。

6、 9. 根据权利要求 8 所述的基于固相载体进行扩增的方法， 其特征在于 ： 所述引物及模板序列与固相载体采用不同的基团配对进行结合， 所述固相载体表面或 连接子带有至少两种基团。 10. 根据权利要求 1 所述的基于固相载体进行扩增的方法， 其特征在于， 步骤 B 之后还 包括步骤 ： B . 对扩增产物进行纯化回收。 11. 一种基于固相载体进行核酸测序的方法， 所述固相载体固定有至少一个模板序列， 其特征在于， 所述核酸测序的方法包括以下步骤 ： A. 将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点， 得到固定有引物的扩增载体 ； B. 对扩增载体上的模板序列进行扩增， 得到扩增产物 ； C.

7、 根据碱基互补原则对扩增产物进行核酸测序， 得核酸序列信息。 12.根据权利要求11所述的基于固相载体进行核酸测序的方法， 其特征在于， 步骤A中 所述引物包括肿瘤类易感基因引物、 心血管疾病类易感基因引物、 营养指导基因引物和单 基因疾病检测引物中的任一种。 权 利 要 求 书 CN 102604934 A 2 2/2 页 3 13. 根据权利要求 11 所述的基于固相载体进行核酸测序的方法， 其特征在于， 所述步 骤 C 包括以下步骤 ： C1. 将扩增产物变性形成单链， 得固定于固相载体的单链核酸片段 ； C2. 根据碱基互补原则对单链核酸片段进行核酸测序， 得核酸序列信息。 14.根据

8、权利要求11至13中任一项所述的基于固相载体进行核酸测序的方法， 其特征 在于， 所述核酸测序的方法是大规模循环平行测序的方法。 15. 根据权利要求 14 所述的基于固相载体进行核酸测序的方法， 其特征在于， 所述大 规模循环平行测序的方法为基于聚合酶合成为基础的合成测序法， 或者是基于络合连接为 基础的连接测序法。 权 利 要 求 书 CN 102604934 A 3 1/20 页 4 一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法 技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域， 更具体地说， 涉及一种基于固相载体进行扩增及进行 核酸测序的方法。 背景技术 0002 聚合酶链式反应(Polym

9、erase Chain Reaction， PCR)是体外酶促合成扩增DNA片 段的一种方法， 由高温变性、 低温退火及适温延伸等反应组成一个周期， 循环进行， 使目的 DNA 得到扩增。PCR 技术出现之后， 根据不同的需要被不断改进， 广泛应用于基因分离、 克隆 和核酸序列检测等领域。 0003 现有技术提供了一种基于固相载体进行扩增的方法， 其实现步骤包括 ： (1) 将待 测样品与带有亲水性正离子的固相载体混合， 使得待测样品中含有的一种或多种靶标核酸 以单链核酸片段的形式结合到固相载体上 ； (2) 将引物与带有靶标核酸的固相载体混合， 使引物与靶标核酸杂交结合， 得到带有引物 -

10、靶标核酸的固相载体 ； (3) 利用带有引物 - 靶 标核酸的固相载体进行 PCR 扩增， 得到扩增产物。该技术利用固相载体进行扩增， 采用引物 直接与固相载体上固定的靶标核酸杂交结合， 因此扩增反应之后， 扩增产物游离于液相中， 未结合于固相载体表面， 因此固相载体表面结合的扩增产物量少。 0004 利用该现有技术进行扩增， 需以大量核酸分子为模板， 当固相载体表面的模板较 少时无法保证扩增的顺利进行， 因此降低了固相载体的利用率， 提高了成本 ； 若以扩增反应 结束后的固相载体进行测序， 很容易出现由于固相载体表面带有的靶标核酸过少， 检测信 号过弱而无法准确读取靶标核酸序列的现象， 因此

11、该现有技术对检测仪器要求高， 测序的 准确性存在局限性。 0005 因此需要一种新的基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法， 能够提高固相 载体表面的扩增产物结合量， 确保扩增的顺利进行， 从而提高固相载体的利用率， 降低成 本， 进而增强核酸测序的检测信号， 降低对检测仪器的要求， 在同等检测条件下可以提高测 序的准确性。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法， 能够 提高固相载体表面的扩增产物结合量， 确保扩增的顺利进行， 从而提高固相载体的利用率， 降低成本， 进而增强核酸测序的检测信号， 降低对检测仪器的要求， 在同等检测条件下提高 测

12、序的准确性。 0007 为实现本发明的目的之一， 一种基于固相载体进行扩增的方法， 所述固相载体表 面固定有至少一个模板序列， 所述方法包括以下步骤 ： 0008 A. 将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点， 得到固定有引物的扩增载体 ； 0009 B. 对扩增载体上的模板序列进行扩增， 得到扩增产物。 0010 其中， 步骤 A 所述引物包括用于对所述模板序列进行扩增的上游引物和 / 或下游 说 明 书 CN 102604934 A 4 2/20 页 5 引物， 所述上游引物是与模板序列 5 端互补结合的核酸序列， 所述下游引物是与模板序列 3 端序列相同的核酸序列。 0011 其中，

13、步骤 B 中所述的扩增方式是单分子扩增。 0012 进一步的， 所述单分子扩增方式包括乳液PCR扩增、 滚环扩增和桥式PCR扩增的任 一种。 0013 其中， 所述引物结合于固相载体表面的方式为 ： 0014 引物与固相载体表面携带的基团进行配对连接， 实现直接结合 ； 0015 或通过连接子携带的基团分别与引物和固相载体表面携带的基团进行配对连接， 实现间接结合。 0016 进一步的， 所述配对连接的方式采用生物素 - 亲和素 / 链霉亲和素、 纳米金 / 碘乙 酰 - 巯基、 氨基 - 醛基 / 羧基 / 异硫氰基、 丙烯酰胺 - 硅烷基 / 聚丙烯酰胺中的至少一种。 0017 其中， 所

14、述固相载体的材质采用玻璃、 硅胶、 陶瓷、 塑料和金属中的至少一种。 0018 其中， 在步骤 A 之前还可以包括步骤 ： 0019 A0. 将模板序列通过基团配对方式结合于固相载体表面， 得到固定有至少一个模 板序列的固相载体。 0020 进一步的， 所述引物及模板序列与固相载体采用不同的基团配对进行结合， 所述 固相载体表面或连接子带有至少两种基团。 0021 其中， 步骤 B 之后还可以包括步骤 ： 0022 B . 对扩增产物进行纯化回收。 0023 为实现本发明的目的之二， 一种基于固相载体进行核酸测序的方法， 所述固相载 体固定有至少一个模板序列， 所述核酸测序的方法包括以下步骤

15、： 0024 A. 将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点， 得到固定有引物的扩增载体 ； 0025 B. 对扩增载体上的模板序列进行扩增， 得到扩增产物 ； 0026 C. 根据碱基互补原则对扩增产物进行核酸测序， 得核酸序列信息。 0027 其中， 步骤 A 中所述引物包括肿瘤类易感基因引物、 心血管疾病类易感基因引物、 营养指导基因引物和单基因疾病检测引物中的任一种。 0028 其中， 所述步骤 C 包括以下步骤 ： 0029 C1. 将扩增产物变性形成单链， 得固定于固相载体的单链核酸片段 ； 0030 C2. 根据碱基互补原则对单链核酸片段进行核酸测序， 得核酸序列信息。 0031

16、 其中， 所述核酸测序的方法是大规模循环平行测序的方法。 0032 进一步的， 所述大规模循环平行测序的方法为基于聚合酶合成为基础的合成测序 法， 或者是基于络合连接为基础的连接测序法。 0033 由上可知， 本发明提供的基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法， 利用固 相载体上固定的至少一个模板序列， 将引物直接结合于固相载体表面上的引物结合位点， 使得扩增产物结合于固相载体表面， 提高了固相载体表面的扩增产物结合量 ； 利用扩增载 体上同时存在的模板序列和引物进行单分子扩增时， 可以避免由于没有引物或没有模板序 列而使得固相载体无法用于扩增， 从而提高了固相载体的利用率， 降低了成本 ；

17、 同时， 利用 该扩增方法得到的固相载体进行测序， 因其表面固定有大量扩增产物， 测序时增强了检测 信号， 降低了对检测仪器的要求， 在同等检测条件下提高了测序的准确性。 说 明 书 CN 102604934 A 5 3/20 页 6 附图说明 0034 附图 1 是本发明一个实施例中基于固相载体进行扩增的方法流程图 ； 0035 附图 2 是本发明一个实施例中基于固相载体进行核酸测序的方法流程图 ； 0036 附图 3 是本发明一个实施例中对扩增产物进行核酸测序的方法流程图 ； 0037 附图 4 是本发明一个实施例中基于固相载体进行扩增并进行核酸测序的方法示 意图 ； 0038 附图 5

18、是本发明一个实施例中基于固相载体进行扩增及核酸测序得到的荧光信 号图 ； 0039 附图 6 是本发明另一个实施例中基于固相载体进行扩增及核酸测序得到的荧光 信号图。 具体实施方式 0040 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 0041 本发明提供了一种基于固相载体进行扩增及进行测序的方法， 该方法是基于表面 固定有至少一个模板序列的固相载体完成的， 包括以下步骤 ： 首先将扩增所用的引物结合 于固相载体表面的引物结合位点处， 得到固定有引物的扩增载体 ； 然后对扩增载体上的模 板序列进行扩增， 可以得到表面固定结合有大量

19、扩增产物的固相载体 ； 利用扩增载体上同 时存在的模板序列和引物进行单分子扩增时， 可以避免在独立空间里由于没有引物或没有 模板序列而使得固相载体无法用于扩增， 从而提高了固相载体的利用率， 降低了成本 ； 利用 这种扩增后得到的固相载体进行核酸测序， 可以增强测序时的检测信号， 降低对检测仪器 的要求， 在同等检测条件下提高测序的准确性。 0042 图 1 示出了本发明一种基于固相载体进行扩增的方法流程， 该方法包括以下步 骤 ： 0043 S101. 将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点， 得到固定有引物的扩增载 体 ； 0044 S102. 对扩增载体上的模板序列进行扩增， 得到扩增

20、产物。 0045 利用本发明记载的基于表面固定有至少一个模板序列的固相载体进行扩增的技 术方案， 可以通过固定于固相载体表面的引物将扩增产物固定到固相载体表面， 从而可以 提高固相载体表面结合的模板序列数量。 0046 针对本技术方案， 需要说明的是 ： 0047 步骤 S101 中所述引物， 是用于对固相载体表面固定的模板序列进行扩增的核酸 序列， 包括上游引物和下游引物中的至少一种。所述上游引物， 是与模板序列的 5 端互补 结合的核酸序列 ； 所述下游引物， 是与模板序列的 3 端序列相同的核酸序列。在本发明的 一个具体实施例中， 将上游引物或下游引物结合于固相载体表面的引物结合位点，

21、与上游 引物和下游引物同时固定于固相载体表面的方案相比， 可以在实现发明目的的同时减少试 剂的种类 ； 在本发明的另一个具体实施例中， 将上游引物、 下游引物按照一定的比例同时结 合于固相载体表面的引物结合位点， 可以在实现发明目的的同时加快扩增的速度。其中上 说 明 书 CN 102604934 A 6 4/20 页 7 游引物与下游引物的混合比例根据需要可变， 优选为 1 2 至 2 1 的比例之间， 更优选为 1 1。上述对于上游引物与下游引物之间的混合比例只是本发明所用的一些具体实施方 式， 并不用以限制本发明的保护范围。 0048 其中， 本发明所述模板序列， 是指固定于固相载体表面

22、， 用于作为扩增模板的单链 核酸序列， 可以是 DNA、 RNA 或 eDNA， 其来源可以是通过固相载体从混合样品中捕获得到， 也 可以是通过直接将模板序列样品结合于固相载体表面得到。 0049 本发明所述引物结合位点， 是指固相载体表面用于固定引物的结合位点。 0050 其中， 本发明所述固相载体， 可以是由不同材质构成的， 其材质可以采用玻璃、 硅 胶、 陶瓷、 塑料和金属中的任意一种， 而固相载体的表面无特殊要求， 优选带有平滑表面的 固相载体， 固相载体的具体类型可以是现有技术中常用的固相载体， 包括但不限于塑料珠、 玻璃珠、 玻片、 磁珠和纳米金颗粒。本发明中优选采用磁珠作为固相载

23、体， 以使得扩增反应 结束后扩增产物的分离纯化更加方便。上述只是本发明对于固相载体的一些具体实施例， 并不用以限制本发明的保护范围。 0051 本发明所述的扩增载体， 是指表面固定有至少一个模板序列， 且同时还结合有引 物的固相载体， 此时模板序列和引物同时固定于固相载体表面， 能够直接应用于扩增。 0052 本发明中所述引物结合于固相载体表面时， 不排除引物同时也与模板序列互补结 合， 这并不影响本发明的发明目的的实现。 0053 上述引物结合于固相载体表面可以采用多种方式实现。在本发明的一个具体实 施方案中， 引物通过与固相载体表面携带的基团进行配对连接， 实现直接结合， 可以简化操 作。

24、 在本发明的另一个具体实施方案中， 引物通过与连接子携带的其中一个基团连接， 再通 过连接子携带的另一个基团与固相载体表面携带的基团进行配对连接， 从而实现引物与固 相载体的间接连接 ； 在本实施方案的另一个具体实施例中， 连接子是类似于树脂结构的存 在， 使用该连接子除了可以实现引物与固相载体的间接连接之外， 还可以进一步提高固相 载体表面结合的引物数量。 0054 其中， 所述连接子用于连接引物与固相载体。 所述连接子可以采用多种化合物， 包 括但不限于 ： 烷烃、 单链核苷酸分子或包含多聚物部分的化合物。 0055 上述配对连接的方式多种多样， 可以采用生物素 - 亲和素 / 链霉亲和素

25、、 纳米金 / 碘乙酰 - 巯基、 氨基 - 醛基 / 羧基 / 异硫氰基、 丙烯酰胺 - 硅烷基 / 聚丙烯酰胺中的任意一 种。 0056 在本发明的一个具体实施方案中， 引物带有生物素标记， 而固相载体本身已经经 过链霉亲和素修饰， 因此两者直接通过生物素与链霉亲和素之间的配对连接， 实现直接连 接。 0057 在本发明的另一个具体实施方案中， 固相载体表面带有氨基修饰， 而引物经过羧 基修饰， 两者通过氨基 - 羧基进行配对连接， 实现直接连接。 0058 在本发明的另一个具体实施方案中， 采用多聚化合物如树脂作为连接子， 通过氨 基分别与引物所带的羧基及固相载体表面携带的醛基进行配对连

26、接， 实现引物与固相载体 表面的间接结合。 0059 在本发明的另一个具体实施方案中， 以烷烃分子作为连接子， 其上带有氨基以及 羧基， 因此可以与羧基化的引物以及表面氨基化的固相载体进行配对连接， 实现引物与固 说 明 书 CN 102604934 A 7 5/20 页 8 相载体表面的间接结合。 0060 上述仅是本发明中引物结合于固相载体表面的一些具体实施方式， 并不用以限制 本发明的保护范围。 0061 本发明的发明目实现的基础是表面固定有至少一个模板序列的固相载体， 其表面 固定的模板序列是用于扩增的单链核酸序列， 其来源可以为多种途径， 可以是直接固定有 模板序列的固相载体， 也可

27、以是通过连接反应后固定有模板序列的固相载体， 此时， 需要在 步骤 S101 开始之前， 进行模板序列结合于固相载体表面的操作。 0062 在本发明的一个具体实施方案中， 直接在扩增之前对所要扩增的基因组进行片段 化， 然后利用接头与片段化得到的核酸片段两端连接， 且固相载体表面进行相应的修饰处 理， 再将接完接头之后的片段固定于固相载体表面。 0063 在本发明的另一个具体实施方案中， 用于扩增的模板序列最初位于临床待测血液 样品中。 首先对固相载体表面进行链霉亲和素修饰， 然后连接经过生物素修饰的捕获探针， 得到带有捕获探针的固相载体。将带有捕获探针的固相载体直接与临床待测血液样品混 合，

28、 从中进行模板序列的捕获。捕获结束后， 利用离心分离， 即可得到表面固定有模板序列 的固相载体。 0064 在本发明的另一个具体实施方案中， 用于扩增的模板序列位于临床疾病患者的唾 液中。为得到用于扩增的模板序列， 首先利用相应的引物进行一般的 PCR， 将从患者的唾液 中得到的模板序列进行放大， 然后以凝胶电泳进行分离回收， 回收产物再进行生物素化接 头的连接， 而固相载体采用链霉亲和素修饰的磁珠， 两者混合结合， 即可得到表面固定有至 少一个模板序列的磁珠。 0065 上述仅是本发明中固相载体表面固定的模板序列来源的一些具体实施例， 并不用 以限制本发明的保护范围。 0066 固相载体表面

29、进行模板序列的固定操作之后， 在进行步骤 S101 的操作时， 引物与 固相载体表面的结合方式， 可以与模板序列与固相载体表面的结合方式一致， 也可以采取 不一样的结合方式。在本发明的一个实施方案中， 引物以及模板序列都采用与固相载体表 面直接配对连接的方式。 进一步的， 在采用相同结合方式时， 模板序列与引物还可以采用相 同或者是不同的基团配对实现与固相载体的直接或间接配对连接。在本实施方案的一个 具体实施例中， 固相载体表面带有链霉亲和素修饰， 而模板序列和引物都带有生物素修饰， 模板序列和引物都通过链霉亲和生物素的作用固定于固相载体表面 ； 在本实施方案的另一 个具体实施例中， 固相载体

30、表面带有氨基修饰， 而模板序列带有羧基修饰， 引物带有醛基修 饰， 模板序列与引物通过不同的基团配对实现与固相载体的直接配对连接 ； 在本实施方案 的另一个具体实施例中， 固相载体表面带有氨基修饰， 而模板序列带有羧基修饰， 引物带有 异硫氰基修饰， 模板序列与引物通过不同的基团配对实现与固相载体的直接配对连接 ； 在 本实施方案的另一个具体实施例中， 固相载体经过不同的修饰处理后带有氨基以及链霉亲 和素， 而模板序列带有羧基修饰， 引物带有生物素修饰， 模板序列与引物通过不同的基团配 对实现与固相载体的直接配对连接 ； 在本实施方案的另一个具体实施例中， 固相载体表面 带有树脂包埋， 而模板

31、序列与引物分别于树脂上所携带的相同或不同基团进行配对， 从而 都采用间接连接的方式实现与固相载体的连接。 0067 在本发明的另一个实施方案中， 模板序列与引物采用不同的固定方式与固相载体 说 明 书 CN 102604934 A 8 6/20 页 9 表面结合。 在本实施方案的一个具体实施例中， 固相载体表面带有链霉亲和素修饰， 模板序 列通过捕获探针实现与固相载体的间接配对连接， 而引物通过链霉亲和生物素的作用实现 与固相载体的直接配对连接， 两者通过不同的结合方式与固相载体连接 ； 在本实施方案的 另一个具体实施例中， 固相载体表面带有氨基修饰， 模板序列利用羧基修饰实现与固相载 体的直

32、接配对连接， 引物通过氨基与连接子上所带的醛基配对连接， 然后再通过连接子上 的醛基实现与固相载体的间接连接， 从而实现模板序列与引物通过不同的结合方式与固相 载体连接。 0068 上述实施方案以及具体实施例只是本发明中模板序列与引物两者与固相载体表 面结合方式的一些具体实施方式， 并不用以限制本发明的保护范围。 0069 步骤S102中， 利用扩增载体对模板序列进行扩增， 是指利用一定的方法(如化学、 酶促或其他类型的方法 ) 使得模板序列的拷贝数增加或导致模板序列存在的信号增加。本 发明利用扩增载体进行扩增时， 除加入必须的扩增试剂外， 还加入少量游离态的引物用以 加速扩增的启动以及扩增的

33、速度。 加入的游离态引物量可根据固相载体上固定的引物种类 和量的不同而进行相应的调整。 0070 在本发明的一个实施方案中， 固相载体表面固定的是上游引物， 在一个具体实施 例中， 加入的游离态引物是下游引物 ； 在另一个具体实施例中， 为使扩增速度能够加快， 加 入大量游离态下游引物的同时， 也加入了少量上游引物。 0071 在本发明的另一个实施方案中， 固相载体表面固定的是下游引物， 在一个具体实 施例中， 加入的游离态引物是上游引物 ； 在另一个具体实施例中， 为使扩增速度能够加快， 加入大量游离态上游引物的同时， 也加入了少量下游引物。 0072 在本发明的另一个具体实施方案中， 上游

34、引物与下游引物同时结合于固相载体表 面， 在一个具体实施例中， 加入的游离态引物是上游引物或者是下游引物中的其中一种 ； 在 另一个具体实施例中， 扩增时同时加入游离态的上游引物和下游引物， 以便加快扩增的速 度， 且上游引物与下游引物的量以 1 1 为佳， 以其他比例亦可。 0073 本发明可以采用多种扩增方式， 包括但不限于常见的聚合酶链反应 (PCR) 和连 接酶链反应 (LCR)、 链置换扩增 (SDA)、 转录介导的扩增、 基于核酸序列的扩增 (NASBA)、 Q-Beta复制和滚环扩增(RCA)， 优选可以实现单分子扩增的乳液PCR(EPCR)、 桥式PCR， 其中 桥式 PCR

35、又可分为水相桥式 PCR 和乳液桥式 PCR 两种。 0074 本发明所述单分子扩增， 是指对模板序列， 以极微量(甚至是单个分子)的形式在 空间上隔离 ( 但这些模板序列整体上还是属于同一个反应体系 )， 在各自的空间内实现对 模板序列的扩增， 得到扩增均一的扩增产物， 用以提升扩增后得到的扩增产物的信号。 0075 其中， 本发明中所述 EPCR 是利用乳浊液体系中各液滴形成的独立空间， 对扩增载 体上的模板序列进行独立扩增反应， 用以生成大量均一的扩增产物的单分子扩增技术， 其 大致操作步骤是 ： 将包含 PCR 所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面， 水溶 液瞬间形成无数个被

36、矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的 PCR 反应空间。理 想状态下， 每个小水滴只含一个扩增载体， 包含有足够的其它扩增试剂 ( 包括 DNA 聚合酶、 dNTP 等 )。在 EPCR 反应后， 固相载体表面就固定有拷贝数目巨大的同来源的模板序列扩 增产物。EPCR 具体步骤可参考文献 ： BEAMing ： single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions， Frank Diehl， Meng Li， Yiping He， nature methods， Vol.3， 说 明 书 CN 102604934

37、 A 9 7/20 页 10 No.7， July 2006。 0076 本发明中所述的桥式 PCR 是利用固定于固相载体上的上游引物或下游引物与模 板序列形成桥状结构进行扩增， 从而得到大量同源、 均一扩增产物的单分子扩增技术。所 述桥式 PCR 的基本原理是， 桥式 PCR 的引物被固定在固相载体上， PCR 过程中 PCR 扩增产 物会被固定在固相载体上， 且 PCR 扩增产物能够与固相载体上的引物互补配对， 成桥状， 然 后互补配对的引物以与其成桥的扩增产物为模板进行扩增。通过控制初始模板加入的量， 桥式 PCR 反应完成后， 扩增产物在固相载体上以一簇簇的形式存在， 且每一簇的扩增产

38、物 为同来源的 DNA 模板扩增产物。水相桥式 PCR 与乳液桥式 PCR 的主要区别在于， 乳液桥式 PCR 是在乳液体系中隔离的独立空间中进行桥式 PCR， 同时具有水相桥式 PCR 与 EPCR 的特 性。关于桥式 PCR 的具体原理和实施方案可参考以下文献 ： CN20061009879.X、 US6227604 和Dual primer emulsion PCR for nextgeneration DNA sequencing， Ming Yan Xu et al Benchmarks Vol.48No.5,2010。 0077 在本发明的一个具体实施方案中， 利用 PCR 方法对

39、模板序列进行扩增， 此方法操 作简单， 但缺点在于需要模板序列较多。 0078 在本发明的一个优选实施方案中， 利用 RCA 的方法对模板序列进行扩增， 此实施 方案的优势在于能够形成单分子扩增， 扩增结束后可以直接得到大量均一的扩增产物 ； 也 可以针对模板序列中存在的特异性核酸序列， 利用特异性核酸内切酶对扩增产物进行酶 切， 可以得到大量特定位置且分布均一的扩增产物。 所述特异性核酸内切酶， 是指能识别模 板序列中的特异性核酸序列， 并在特定位置进行切割的内切酶。 0079 在本发明的另一个优选实施方案中， 利用 EPCR 对扩增载体表面固定的模板序列 进行扩增， 可以实现单分子扩增，

40、以极少量甚至是单个模板序列完成扩增， 而且得到大量均 一的扩增产物。 0080 在本发明的另一个优选实施方案中， 利用桥式 PCR 对扩增载体表面固定的模板序 列进行扩增， 同样可以实现单分子扩增， 以极少量甚至是单个模板序列完成扩增， 得到大量 均一的扩增产物。 0081 在本实施方案中的一个具体实施例中， 利用水相桥式 PCR 对固相载体表面固定的 模板序列进行扩增 ； 而在本实施方案中的另一个具体实施例中， 利用乳液桥式 PCR 实现对 固相载体表面固定的模板序列的扩增。 0082 其中， 本发明中所述的扩增产物， 指的是经过扩增反应后， 表面固定有大量扩增得 到的核酸序列的固相载体。

41、0083 上述优选实施方案中利用EPCR和桥式PCR进行单分子扩增， 与只有引物或只有模 板序列固定于固相载体的技术相比， 可以避免由于缺少其中一种而无法进行扩增， 从而可 以提高固相载体用于扩增的效率， 减少固相载体的使用量， 降低成本。而且， 与背景技术中 提到的现有技术相比， 同为固相载体上固定有模板序列的扩增技术， 本发明所述技术方案 的扩增产物全部结合于固相载体表面， 可以提高带有扩增产物的固相载体在后续应用中的 效率， 进一步降低成本。 0084 上述仅是本发明中用于扩增固相载体表面固定的模板序列的一些具体实施方式， 并不用以限制本发明的保护范围。 0085 步骤 S102 进行扩

42、增后， 得到的扩增产物里包含表面结合有扩增的模板序列的固 说 明 书 CN 102604934 A 10 8/20 页 11 相载体， 以及其他未反应完的杂质， 因此， 若需要进一步进行后续操作， 需要进行对扩增产 物的纯化回收。 纯化回收的目的在于将表面结合有扩增的模板序列的固相载体与杂质分离 提纯出来， 可以使用现有技术中的常用方法， 包括但不限于离心分离提纯、 柱分离纯化。 0086 图 2 示出了本发明的一种基于固相载体进行核酸测序的方法， 其中所述固相载体 固定有至少一个模板序列， 该方法包括以下步骤 ： 0087 S201. 将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点， 得到固定有引

43、物的扩增载 体 ； 0088 S202. 对扩增载体上的模板序列进行扩增， 得扩增产物 ； 0089 S203. 根据碱基互补原则对扩增产物进行核酸测序， 得核酸序列信息。 0090 本技术方案的优势在于， 基于表面固定至少有一个模板序列的固相载体， 在其表 面结合引物进行扩增， 可以提高固相载体表面扩增产物结合的数量， 从而可以在后续的核 酸测序过程中， 增强核酸测序的检测信号， 降低对检测仪器的要求， 在同等检测条件下可以 提高测序的准确性。 0091 针对本技术方案， 需要说明的是 ： 0092 步骤 S201 中引物、 固相载体表面固定的模板序列、 引物与固相载体结合的方式以 及相应的

44、内容， 遵循上一技术方案中步骤 S101 中所述， 在此不再过多赘述。 0093 鉴于本技术方案的优势所在， 可将本发明所记载的技术方案应用于各种临床疾病 相关基因的核酸序列检测， 用以得到相关基因的核酸序列， 在此基础上， 结合后续进一步的 分子生物学试验和临床试验、 临床观察以及综合数据的统计分析， 并建立一定的疾病模型， 进而可以实现相应疾病的早期评估。 0094 需要进一步说明的是， 本技术方案中所述的引物并无特殊要求， 包括上游引物和 / 或下游引物， 是用于扩增模板序列的核酸序列。 所述引物优选可以与临床应用结合， 能用于 扩增各种临床疾病相关基因序列的引物， 包括但不限于肿瘤类易

45、感基因引物、 心血管疾病 类易感基因引物、 营养指导基因引物和单基因疾病检测引物。 0095 其中， 所述肿瘤类易感基因引物， 是指用于扩增各种肿瘤类易感基因的引物 ； 所述 肿瘤类易感基因， 是指初步研究显示可能与某一种肿瘤有一定关联的基因， 常见的包括但 不限于肺癌易感基因、 乳腺癌易感基因、 结直肠癌易感基因、 鼻咽癌易感基因、 胰腺癌易感 基因、 肝癌易感基因和胃癌易感基因。其中， 所述肺癌易感基因包括但不限于 APE1、 CASP7、 CASP8、 CASP9、 CHEK2、 COX-2、 CYP1A1、 CYP2E1、 ERCC1、 ERCC2 和 ERCC6 ； 所述乳腺癌易感基

46、因 包括但不限于 FGFR2、 MTHFR 和 IL-1 ； 所述结直肠癌易感基因包括但不限于 MMP2、 SMAD7、 ADH2、 ALDH2、 CYP1A2、 MMP-1、 MTHFR、 TP53、 VEGF 和 COX-2 ； 所述鼻咽癌易感基因包括但不限 于 IL-2、 MDM2、 HLA-A、 HLA-B、 MDS1-EVI1、 HCG9 和 ITGA9 ； 所述胰腺癌易感基因包括但不限 于 MTHFR、 COX-2、 FasL、 CASP8、 THSD7B、 ARL4C、 LTF、 FOXQ1 和 PARK2 ； 所述肝癌易感基因包 括但不限于 IL-1B、 TNF-、 EGF 和

47、 TGF-1 ； 所述胃癌易感基因包括但不限于 EGF、 ALDH2、 MTHFR、 P53、 IL-10、 PSCA、 TNFA、 PLCE1、 CYP1A1 和 CDH1。 0096 所述心血管疾病类易感基因引物， 是指用于扩增各种心血管类疾病易感基因的引 物 ； 所述心血管疾病类易感基因， 是指经初步研究显示与各种心血管类疾病有一定关联的 基因， 常见的包括但不限于冠状动脉性心脏病易感基因、 动脉粥样硬化易感基因、 老年性痴 呆症易感基因、 原发性高血压易感基因、 家族性高胆固醇血症易感基因、 心肌梗塞易感基因 说 明 书 CN 102604934 A 11 9/20 页 12 和帕金森

48、综合症易感基因。其中， 所述冠状动脉性心脏病易感基因包括但不限于 MEF2A、 PDGF、 FGF、 EGF、 VEGF、 COX-1 和 T-PA ； 所述动脉粥样硬化易感基因包括但不限于 ALOX5AP、 ApoE、 LDLR、 HUMARA、 DCC 和 Rb ； 所述老年性痴呆症易感基因包括但不限于 APP、 PS-1、 PS-2、 ApoE、 ACE、 CH25H、 CST3、 CHRNB2 和 SORL1 ； 所述原发性高血压易感基因包括但不限于 AGT、 ACE、 AT1R、 CYP11B2、 G-3、 eNOS、 RnBO、 LDLR 和 LL ； 所述家族性高胆固醇血症易感基

49、因包括 但不限于LDLR、 apoB 100和ApoE ； 所述心肌梗塞易感基因包括但不限于ALDH2、 LTA、 PSMA6、 TAFI、 ACE 和 MMP9 ； 所述帕金森综合症易感基因包括但不限于 SNCA、 LRRK2、 PINK1、 UCH-L 1 和 Parkin。 0097 所述营养指导基因引物， 是指用于扩增各种营养指导基因的引物。所述营养指 导基因， 是指经初步研究显示与人体营养具有一定关联， 可用于指导人体营养吸收消化能 力的基因， 常见的包括但不限于抗叶酸代谢指导基因、 黄曲霉素代谢能力指导基因、 嗜酒基 因、 吸烟损伤指导基因和乳糖代谢指导基因。所述叶酸代谢指导基因包括但不限于 MTHFR、 MTRR、 CBS 和 SHMT1 ； 所述黄曲霉素代谢能力指导基因包括但不限于 GSTM1、 GSTT1、 EPHx、 XRCC1 和 hOGG1 ； 所述嗜酒基因包括但不限于 ADH2、 ADH3、 ALDH2 和 CYP2E1 ； 所述吸烟损伤 指导基因包括但不限于 p53 和 K-ras ； 所述乳糖代谢指导基因包括但不限于 LCT、 MCM6 和 ALDH2。 0098 所述单基因疾病检测引物， 是指用于扩增各种单基因疾病基因的引物。所述单基 因疾病基因， 是指与各种单基因疾病具有一定关联的单一基因， 常见的包括但不限于苯丙 酮