用于表观遗传分析的设备和方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102725419 A (43)申请公布日 2012.10.10 CN 102725419 A *CN102725419A* (21)申请号 201080039585.8 (22)申请日 2010.08.06 61/231,963 2009.08.06 US 61/231,979 2009.08.06 US 61/307,827 2010.02.24 US 61/359,266 2010.06.28 US C12Q 1/68(2006.01) G01N 33/52(2006.01) (71)申请人 康奈尔大学 地址 美国纽约州 (72)发明人 HG克雷格黑德 BR西普

2、里亚尼 S利维 P索洛韦 (74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256 代理人 陈文平 (54) 发明名称 用于表观遗传分析的设备和方法 (57) 摘要 本文提供了用于单一物体探测的方法和设 备。所述方法和设备可以用于确定遗传物质上的 多种表观遗传标记物， 或包含其片段的染色质。 基 于对遗传物质的一种或多种特性的探测， 本发明 提供了以流体的连续主体形式流过通道的遗传物 质的表征。本文提供的方法和系统允许宽基因组 的、 高处理量的表观遗传分析并克服了全分析技 术所共有的各种限制。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.03.20 (86)PCT申请的申请数

3、据 PCT/US2010/044806 2010.08.06 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/017677 EN 2011.02.10 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 34 页 附图 22 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 34 页 附图 22 页 1/2 页 2 1. 一种用于进行通道中的遗传物质的表观遗传分析的方法， 包括 ： (a) 使所述遗传物质流过所述通道， 其中所述遗传物质被标记有多个标记， 所述多个标 记中的至少一个与所述遗传物质上的表观遗传标记物特异性络合， 且至少一个其他标记与 所述遗传

4、物质的蛋白质和 / 或核苷络合 ； (b) 照亮所述通道以产生多个探询容积， 每一个探询容积由所述通道的壁和光束限制 ； 和 (c) 探测来自所述多个的相同或不同探询容积的所述至少一个标记和所述一个其他标 记， 以产生所述至少一个标记和所述至少一个其他标记的时间相关的分辨率， 由此进行所 述表观遗传分析。 2. 一种用于进行通道中的遗传物质的表观遗传分析的方法， 包括 ： (a) 使所述遗传物质流过被照亮的探询容积， 所述探询容积由所述通道的壁和光束限 制， 其中所述遗传物质被标记有多个标记， 所述多个标记中的至少一个与所述遗传物质上 的表观遗传标记物特异性络合， 且至少一个其他标记与所述遗传

5、物质的蛋白质和 / 或核苷 络合 ； 和 (b) 同时探测在所述探询容积内的所述至少一个标记和所述至少一个其他标记， 由此 进行所述表观遗传分析。 3. 一种用于获得关于通道内的物质的实时分析数据的方法， 包括 ： (a) 使所述物质流过被照亮的探询容积， 所述探询容积由所述通道的壁和光束限制， 其 中所述物质被标记有多个标记， 所述多个标记中的至少一个与所述材料上的标记特异性络 合， 且至少一个其他标记与所述物质络合 ； (b) 实时探测在所述探询容积内的所述至少一个标记和所述至少一个其他标记， 由此 产生所述实时分析数据 ； 和 (c) 在显示设备上显示所述实时分析数据， 其中所述实时分析

6、数据反映在所述至少一 个标记和所述至少一个其他标记上的信息。 4. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的方法， 包括探测至少三种或四种标记。 5. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的方法， 其中所述至少一个其他标记与组蛋白络合或是 选自由以下组成的组的核酸结合剂 ： 序列特异性探针、 嵌入染料、 小沟粘合剂和 DNA 结合蛋 白。 6.根据权利要求1、 2或3所述的方法， 其中所述至少一个其他标记与结合剂络合， 所述 结合剂与选自由以下组成的组的靶络合 ： 非组蛋白、 转录因子、 MBD1、 RNA Pol II 和 RNA。 7.根据权利要求1、 2或3所述的方法， 其中所述探测步骤提

7、供超过约10微秒的时间依 赖性分辨率。 8.根据权利要求1或2所述的方法， 其中所述遗传物质是染色质、 核酸分子或单一核酸 分子。 9. 根据权利要求 3 所述的方法， 其中所述物质是染色质、 核酸分子或单一核酸分子。 10. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的方法， 其中所述被照亮的探询容积包含单一染色质。 11. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的方法， 其中所述探询容积小于约 10、 1、 0.5、 0.2、 0.1 或 0.05 飞升。 12. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的方法， 其中所述遗传物质在小于约 1、 0.5、 0.1、 0.01、 权 利 要 求 书 CN

8、 102725419 A 2 2/2 页 3 0.001 或 0.0001 秒被表征。 13. 一种用于表征单一核酸分子的系统， 包括 ： (a) 通道， 其配置成保持所述分子 ； (b) 一个或多个光源， 其配置成照亮所述通道以产生一个或多个探询容积 ； (c) 探测系统， 其配置成探测表示来自所述一个或多个探询容积的所述核酸分子的两 种不同的特性的至少两种类型的信号 ； 和 (d) 处理器， 其被编程成提供来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信 号的实时的时间相关的分辨率， 由此表征所述单一核酸分子。 14. 根据权利要求 13 所述的系统， 其中所述两种类型的信号被同时地探测或

9、所述探测 系统探测四种类型的信号。 15. 根据权利要求 13-14 中任一项所述的系统， 其中所述处理器的特征在于 ： (i) 所述 处理器被编程为提供来自多于一个探询容积的所述至少两种类型的信号的时间相关的分 辨率 ； 或 (ii) 包括现场可编程门阵列， 所述现场可编程门阵列被编程为提供所述至少两种 类型的信号的实时的时间相关的分辨率。 16. 根据权利要求 13-15 中任一项所述的系统， 其中所述一个或多个探询容积是 (a) 小于约 10、 1、 0.5、 0.2、 0.1 或 0.05 飞升， (b) 不大于所述物体的尺寸的约 10,000 倍， 提供单分子分辨率， (c) 形成所

10、需的尺寸以保持单一核酸分子， 或 (d) 由所述通道的所述壁和来自所述光源的光束限制， 所述光束具有不大于 X 微米的 直径。 17.根据权利要求13-16中任一项所述的系统， 其中所述探测系统测量大于约2的信噪 比。 18. 根据权利要求 13-17 中任一项所述的系统， 其中所述通道包括光学透明的壁。 19. 根据权利要求 13-18 中任一项所述的系统， 其中所述光源提供不同波长的多个光 束。 20. 一种用于表征物体的系统， 包括 ： (a) 通道， 其配置成保持所述物体 ； (b) 一个或多个光源， 其配置成照亮所述通道以产生一个或多个探询容积 ； (c) 探测系统， 其配置成探测表

11、示来自所述一个或多个探询容积的所述物体的两种不 同的特性的至少两种类型的信号 ； (d) 处理器， 其被编程为提供来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信 号的实时的时间相关的分辨率， 由此表征所述物体 ； 和 (e) 用户界面， 其配置成接收来自所述处理器的数据和显示所述数据， 其中所述数据包 括关于来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的信息。 权 利 要 求 书 CN 102725419 A 3 1/34 页 4 用于表观遗传分析的设备和方法 0001 交叉引用 0002 本申请要求 2009 年 8 月 6 日提交的第 61/231,979 号美国临时申请、 201

12、0 年 2 月 24 日提交的第 61/307,827 号美国临时申请、 2009 年 8 月 6 日提交的第 61/231,963 号美国 临时申请和 2010 年 6 月 28 日提交的第 61/359,266 号美国临时申请以及同此一起提交的 在律师客户档案号 32497-715.601 之下的共同未决的案例的优先权利益， 其中每个申请为 了所有目的通过引用以其整体并入本文。 0003 关于联邦资助的研究的声明 0004 在国家健康研究所的合同号 R01 DA025722 和国家科学基金会 (NBTC) 的合同号 ECS-9876771 下以美国政府的支持来进行本发明。 0005 发明背

13、景 0006 位于真核细胞的核中的染色质是 DNA 与组蛋白的络合物， 组蛋白包括 H1、 H2A、 H2B、 H3 和 H4。组蛋白以核小体的形式被组装到 DNA 上 (Luger 等人 (1997)Nature， 389， 251-260)。DNA 序列携带遗传密码并控制特性的遗传。然而， 对特异性 DNA 序列和它们 的相关的组蛋白的可逆共价修饰可以影响相关的 DNA 如何被利用且因此还可以控制特 性 (Jenuwein 和 Allis(2001)Science， 293， 1074-1080 ； Klose 和 Bird(2006)Trends In Biochemical Scien

14、ces， 31， 89-97)。这些已经被称为表观遗传修饰。对哺乳动物中的 DNA 的最普通的表观遗传修饰是 DNA 的甲基化和羟甲基化， 它们中每一个可以被放在胞嘧啶嘧 啶环的第五个碳上。 包括甲基化、 乙酰化、 核糖基化、 磷酸化、 Sumo化(涉及小的泛素样改性 剂 )、 泛素化和瓜氨酸化的许多修饰可以在核小体内的四种芯组蛋白的多于 30 个氨基酸残 基处发生。对哺乳动物基因组的表观遗传修饰包括 DNA 中的胞嘧啶的甲基化 ； 结合至 DNA 的组蛋白的甲基化、 乙酰化、 核糖基化、 磷酸化、 Sumo 化和泛素化 ； 和包含核小体的组蛋白 在 DNA 上方的精确定位。 0007 对基因

15、组的表观遗传改变可以如基因组的诱变一样深深地影响发展和健康。 最生 动的实例之一是 p16 肿瘤抑制剂的启动子中的 DNA 的甲基化。这样的甲基化使基因沉默， 并同样使基因序列本身的突变沉默， 且两个事件促进了结直肠癌的发展和进展。 然而， 与突 变不同， p16 的表观遗传沉默在药理学上可以逆转， 并因此提供了医疗介入的可能性。 0008 全基因组中发生的表观遗传状态的特异性变化似乎在发展期间调节细胞分化 (Mikkelsen 等人 (2007)Nature， 448， 553-U552)。成熟组织中的正常表观遗传状态的混 乱促进癌症和其他疾病的引发和进展 (Feinberg， A.P.(2

16、007)Nature， 447， 433-440)。另 外， 研究已经表明， 表观遗传状态受环境变量影响， 环境变量包括饮食 (Waterland 和 Jirtle(2003)Molecular And Cellular Biology， 23， 5293-5300)、 环境毒素 (Anway 等人 (2005)Science， 308， 1466-1469) 和母性行为 (Weaver 等人 (2004)Nature Neuroscience， 7， 847-854)。 已知表观遗传机理在正常发展的环境响应中起到的基本作用和它们的混乱如 何影响疾病状态， 越来越多努力致力于表征人类基因组 (

17、Bernstein 等人 (2007)Cell， 128， 669-681)。 0009 这些表观遗传修饰并不改变主要的 DNA 序列， 但它们对在 DNA 序列下面的那些如 说 明 书 CN 102725419 A 4 2/34 页 5 何被表达具有强大影响。因此， 表观遗传状态的变化可以如 DNA 序列的改变一样强烈地改 变表型。还如 DNA 序列状态一样， 表观遗传状态可以在有丝分裂期间从母细胞传到子细胞， 且可以甚至通过减数分裂持续被从一代传到下一代。虽然表观遗传标记可以变化和比 DNA 序列的变化更容易地回复至它们的初始状态， 但它们如它们所位于的 DNA 序列的性质一样 对发展和疾

18、病很重要。 0010 大量证据已经证明表观遗传调节对于人类疾病尤其是癌症的重要性。将 DNA 甲基化的混乱与人类结直肠癌的发展联系起来的早期观察以及随后的研究表明， DNA 甲基 化状态的实验操纵， 药理学上或遗传性上改变肿瘤发展。这些已经推动了使肿瘤样本的表 观遗传特征与提供样本的个体的疾病状态和临床结果相关联的研究。重要的是， 使用修改 表观遗传状态的药物的正在进行的临床试验已经表明治疗希望和减少表示差的预后的表 观遗传生物标记物的能力。虽然 DNA 甲基化的变化在癌症发展和进展期间已经引起相当多 的注意， 但 DNA 甲基化状态还受组蛋白修饰状态和核小体定位的改变影响。在所有这些表 观遗

19、传标记中， 可逆的相互作用全部可能对癌症发展和进展具有重要性。 0011 除了控制对癌症很重要的过程之外， 表观遗传状态影响哺乳动物对它们的环境变 化的响应。已经表明母性行为在哺育、 暴露于内分泌干扰物和饮食营养组合物期间各自引 出与表观遗传状态的特异性变化有关的特异性表型。最重要地， 这些表型和伴随的表观遗 传改变， 可以从父代传到后代， 即使仅父代经历环境危害而后代没有经历环境危害。 这提高 了在家族中获得的一些复杂特性比如肥胖症、 癌症或行为模式通过表观遗传方式遗传和由 在前一代期间经历的环境暴露导致的可能性。 0012 生物学中的一个普通主题是影响疾病状态比如癌症的机理， 或对环境的内

20、环境稳 定性响应也对发展很重要。已经表明表观遗传机理对果蝇属 (Drosophila) 发展和哺乳动 物发展是关键性的。 0013 用于分析染色质的表观遗传修饰的现有方法例如染色质免疫沉淀反应 (ChIP)， 可 以一次仅评估一个表观遗传标记且是劳动密集的、 连续的过程， 其对分析处理量和样品量 施加显著的限制。ChIP 技术涉及使用对感兴趣的一个表观遗传修饰特异性的抗体来分离 改性染色质的免疫沉淀反应， 改性染色质随后使用整体平行的 DNA 测序、 微阵列杂交或基 因特异性 PCR 来分析。该方法可以用于表征染色质相关的蛋白质的基因组布置且是目前在 表观遗传和染色质研究中实践的占优势的分析工

21、具。然而， 其遭受两个主要局限性。第一， 该分析需要 104至 107个细胞且不能够评估消失量的表观遗传变化， 使得开发胚胎、 被分选 的细胞或被微切割的细胞的研究不可能。 第二， 一次仅一个表观遗传标记可以被分离， 使得 非常难以探测共存标记。测量结果仅提供关于细胞种群中的 平均 染色质状态的信息且 没有关于单个 DNA 链的任何信息。在涉及 ES 细胞中的二价体状态的表征的一个公布的实 例中， 关于如果三甲基化的组蛋白 H3 赖氨酸 27(H3K27me3) 和三甲基化的组蛋白 H3 赖氨酸 4(H3K4me3) 标记同时存在于给定的基因上或如果两个种群与 ES 培养物一起存在 ( 每一个

22、 具有相互排斥的标记 )， 这些局限性引入了模糊性。针对两个不同抗体的序列 ChIP 可以避 开该局限性， 然而该解决方案对全基因组分析是不切实际的。 0014 因而， 用于表观遗传测试的当前方法涉及全分子分析。结果代表来自遗传物质的 多个拷贝的复合信号， 这不同于单分子分析。组蛋白修饰最通常使用染色质免疫沉淀反应 (ChIP) 来探测， 在 ChIP 中， 修饰特异性抗体用于免疫沉淀相关的 DNA， 该 DNA 然后通过杂交 说 明 书 CN 102725419 A 5 3/34 页 6 至微阵列 (Ren 等人 (2000)Scienc， 290， 2306-2309)(ChIP-ChIP

23、) 或深度测序 (Barski 等人 (2007)Cell， 129， 823-837)(ChIP-seq) 来探测。DNA 甲基化还可以通过使用甲基胞嘧啶抗 体的免疫沉淀反应 (Weber 等人 (2005)Nature Genetics， 37， 853-862) 或采用提供 DNA 甲 基化状态的更全面分析的亚硫酸氢盐测序 (Zhang 等人 (2006)Cell， 126， 1189-1201) 来探 测。使用抗体的全基因组表观遗传分析常常使用大约 106 至 107 个细胞。ChIP 使用少至 100 个细胞， 然而， 使用该少的细胞， 分析是基因座特异性的而不是全基因组的 (O N

24、eill 等人 (2006)Nature Genetics， 38， 835-841)。当研究设法确定两个或更多个表观遗传标记 是否在基因组内重合或是否存在于单件遗传物质例如单一染色质上时， 遭遇更多显著局限 性。每一个表观遗传标记的分析需要独立的免疫沉淀反应。当用不同的抗体使染色质从细 胞总体沉淀时， 难以从总体内的多个种群的存在区分被探测的标记的真正重合， 每一个具 有不同的表观遗传特征。这可以用序列 ChIP 来稍微克服， 序列 ChIP 中通过一种抗体沉淀 的材料用第二抗体再 ChIP(Bernstein 等人 (2006)Cell， 125， 315-326)。然而， 这些技术经 不

25、起全基因组分析或调查多于两种表观遗传标记的研究。此外， 全分析技术报告种群的平 均值且并不考虑单分子水平的变化形式。因此， 对提供更可靠的全基因组表观遗传分析的 可选择的方法和组合物仍存在相当大的需求。本发明满足该需求并提供相关的优点。 0015 发明概述 0016 在一些实施方案中， 本发明提供用于以单一染色质水平评估表观遗传变化形式。 单一分子分析提供了超过常规方法的若干优点。 首先， 分析提供了单个分子上的信息， 单个 分子的特性在由普通的整体测量技术记录的统计学平均信息中被隐藏。此外， 因为分析可 以是多路的， 所以其有助于高处理量实现， 需要更少量的试剂并利用了探测系统的高带宽， 探

26、测系统例如用于极迅速的数据收集的现代雪崩光电二极管。此外， 因为单分子计数自动 地产生对照亮和光收集起伏现象的抗干扰度， 所以单分子分析在测量材料的量方面可以提 供比全技术更大的准确度。因此， 单分子分析大大地改进了表观遗传分析、 基因分型、 基因 表达谱分析、 DNA 测序、 核苷酸多态性探测、 病原体探测、 蛋白质表达谱分析和药物筛选的效 率和准确度。因此， 相当需要克服全分析技术的这些缺点。因此， 本发明提供应克服先前技 术的局限性的设备和方法和如何进行表观遗传和染色质研究的变换 (transform)。 0017 本发明提供了用于进行通道中的遗传物质的表观遗传分析的方法， 该方法包括

27、： (a) 使所述遗传物质流过所述通道， 其中所述遗传物质被标记有多个标记， 所述多个标记中 的至少一个与所述遗传物质上的表观遗传标记物特异性络合， 且至少一个其他标记与所述 遗传物质的蛋白质和 / 或核苷络合 ； (b) 照亮所述通道以产生多个探询容积， 每一个探询容 积由所述通道的壁和光束限制 ； 和 (c) 探测来自所述多个的相同或不同探询容积的所述至 少一个标记和所述一个其他标记， 以产生所述至少一个标记和所述至少一个其他标记的时 间相关的分辨率， 由此进行所述表观遗传分析。 0018 本发明的另一个方面提供了用于进行通道中的遗传物质的表观遗传分析的方法， 该方法包括 ： (a) 使所

28、述遗传物质流过被照亮的探询容积， 所述探询容积由所述通道的壁 和光束限制， 其中所述遗传物质被标记有多个标记， 所述多个标记中的至少一个与所述遗 传物质上的表观遗传标记物特异性络合， 且至少一个其他标记与所述遗传物质的蛋白质和 / 或核苷络合 ； 和 (b) 同时地探测在所述探询容积内的所述至少一个标记和所述至少一个 其他标记， 由此进行所述表观遗传分析。 说 明 书 CN 102725419 A 6 4/34 页 7 0019 本发明的另外的方面提供了用于获得关于通道内的物质的实时分析数据的方法， 该方法包括 ： (a) 使所述物质流过被照亮的探询容积， 所述探询容积由所述通道的壁和光 束限

29、制， 其中所述物质被标记有多个标记， 所述多个标记中的至少一个与所述物质上的标 记特异性络合， 且至少一个其他标记与所述物质络合 ； (b) 实时探测在所述探询容积内的 所述至少一个标记和所述至少一个其他标记， 由此产生所述实时分析数据 ； 和 (c) 在显示 设备上显示所述实时分析数据， 其中所述实时分析数据反映在所述至少一个标记和所述至 少一个其他标记上的信息。 0020 本发明的一个方面提供了一种用于表征单一核酸分子的系统， 该系统包括 ： (a) 通道， 其配置成保持所述分子 ； (b) 一个或多个光源， 其配置成照亮所述通道以产生一个或 多个探询容积 ； (c) 探测系统， 其配置成

30、探测表示来自所述一个或多个探询容积的所述核 酸分子的两种不同的特性的至少两种类型的信号 ； 和 (d) 处理器， 其被编程成提供来自所 述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率， 由此表征 所述单一核酸分子。 0021 在前述系统和方法中的任何的另外的方面中， 两种类型的信号被同时地探测或所 述探测系统探测四种类型的信号。在前述系统和方法中的任何的另外的方面中， 所述处理 器的特征在于 ： (i) 所述处理器被编程为提供来自多于一个探询容积的所述至少两种类型 的信号的时间相关的分辨率 ； 或 (ii) 包括现场可编程门阵列， 所述现场可编程门阵列被编 程为提供所述至

31、少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率。 0022 本发明的另一个方面提供了一种用于表征物体的系统， 该系统包括 ： (a) 通道， 其 配置成保持所述物体 ； (b) 一个或多个光源， 其配置成照亮所述通道以产生一个或多个探 询容积 ； (c) 探测系统， 其配置成探测表示来自所述一个或多个探询容积的所述物体的两 种不同的特性的至少两种类型的信号 ； (d) 处理器， 其被编程为提供来自所述一个或多个 探询容积的所述至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率， 由此表征所述物体 ； 和 (e) 用户界面， 其配置成接收来自所述处理器的数据和显示所述数据， 其中所述数据包括关 于来自所述一个

32、或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的信息。 0023 本发明提供了包括以下步骤的方法 ： a) 提供包括 DNA 片段或染色质的样品， 其中 染色质包括 DNA 片段 ； b) 用对 DNA 特异性的一种或多种标记标记所述 DNA 片段或染色质 ； c) 用对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记标记所述 DNA 片段或染色质 ； d) 使经标记的样品与包括亚微米通道的微流控设备接触 ； e) 应用跨过亚微米通道的电压 电位或压差， 其中电压电位或压差足以使所述 DNA 片段或染色质流过亚微米通道 ； f) 通过 探测对 DNA 特异性的一种或多种标记来探测 DNA ； 和 g)

33、通过探测对一种或多种表观遗传标 记物特异性的一种或多种标记来探测表观遗传标记物 ； 其中探测用单分子分辨率来进行。 0024 本发明提供包括使包括亚微米通道的设备与反应混合物接触的方法， 亚微米通道 包括探测容积和第一端部以及至少第二端部， 反应混合物包括 (a) 包括 DNA 和一个或多个 表观遗传修饰 (epigenetic modification) 的多个染色质片段 ； (b) 对 DNA 特异性的标记 ； 和 (c) 对一个或多个表观遗传修饰特异性的标记 ； 其中亚微米通道具有使得基本上一个染 色质片段一次地被布置在探测容积内的尺寸。 0025 在一个实施方案中， 本发明提供使被限制

34、在纳流控通道内的溶液中的 DNA 样品流 动、 用高斯形状的激光剖面照亮样品和探测表示组蛋白或 DNA 组分的荧光事件的方法。样 说 明 书 CN 102725419 A 7 5/34 页 8 品可以用两个高斯形状的激光剖面照亮。在一些实施方案中， 用于照亮样品的光源是 LED 或 VCSEL。 0026 本发明的另外的方面提供 (a) 对 DNA 特异性的一种或多种标记 ； 和 (b) 对一个或 多个表观遗传修饰特异性的一种或多种标记的时间重合探测。 0027 在前述方面和实施方案中的任何一个中， 遗传物质是染色质、 核酸分子或单一核 酸分子。待被分析和 / 或被分选的物质可以是染色质、 核

35、酸分子或单一核酸分子。 0028 在前述方面和实施方案中的任何一个中， 物质可以用单分子分辨率来分析。在一 些实施方案中， 探测步骤提供超过约 10 微秒的时间依赖性分辨率。本发明方法还可以包括 探测对 DNA 特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多 种标记的时间重合探测。一种或多种表观遗传标记物可以选自一种或多种甲基化的 DNA 核 苷酸、 一种或多种羟甲基化的 DNA 核苷酸、 一种或多种乙酰化的组蛋白、 一种或多种甲基化 的组蛋白、 一种或多种泛素化的组蛋白、 一种或多种 Sumo 化的组蛋白、 一种或多种磷酸化 的组蛋白、 甲基 DNA 结合蛋白 (MDB1

36、)、 RNA 聚合酶 II 和 SWI/SNF。 0029 在前述方面和实施方案中的任何一个中， 一种或多种甲基化的 DNA 核苷酸可以包 括5-甲基胞嘧啶。 一种或多种乙酰化的组蛋白可以包括乙酰化的组蛋白H3K4、 乙酰化的组 蛋白 H3K9、 乙酰化的组蛋白 H3K14、 乙酰化的组蛋白 H3K18 或乙酰化的组蛋白 H3K23。一种 或多种乙酰化的组蛋白可以包括乙酰化的组蛋白 H4K5、 乙酰化的组蛋白 H4K8、 乙酰化的组 蛋白H4K12或乙酰化的组蛋白H4K16。 一种或多种甲基化的组蛋白可以包括单甲基化的、 二 甲基化的或三甲基化的组蛋白 H3K4 ； 单甲基化的、 二甲基化的或

37、三甲基化的组蛋白 H3K9 ； 单甲基化的、 二甲基化的或三甲基化的组蛋白 H3K27 ； 或单甲基化的、 二甲基化的或三甲基 化的组蛋白 H3K36。一种或多种甲基化的组蛋白可以包括单甲基化的、 二甲基化的或三甲 基化的组蛋白 H4K20。一种或多种甲基化的组蛋白可以包括单甲基化的或二甲基化的组蛋 白 H3R2 ； 单甲基化的或二甲基化的组蛋白 H3R17 ； 单甲基化的或二甲基化的组蛋白 H3R26 ； 单甲基化的或二甲基化的组蛋白 H3R128 ； 单甲基化的或二甲基化的组蛋白 H3R129 ； 单甲基 化的或二甲基化的组蛋白H3R131 ； 或单甲基化的或二甲基化的组蛋白H3R134。

38、 一种或多种 甲基化的组蛋白可以包括单甲基化的或二甲基化的组蛋白 H4R3。 0030 在一些情况中， 表观遗传修饰选自由以下组成的组 ： 甲基化的 DNA 核苷酸 ( 例 如 5- 甲基胞嘧啶 )、 羟甲基化的 DNA 核苷酸、 乙酰化的组蛋白 ( 例如， H3K4、 H3K9、 H3K14、 H4K12、 H3K18、 H3K23、 H4K5、 H4K8、 H4K12、 H4K16)、 甲基化的组蛋白 ( 例如单甲基化的、 二甲 基化的或三甲基化的 H3K4、 H3K9、 H3K27、 H3K36、 H4K20、 H3R2、 H3R17、 H3R26、 H3R128、 H3R129、 H3

39、R131、 H3R134、 H4R3)、 泛素化的组蛋白、 Sumo 化的组蛋白、 磷酸化的组蛋白、 甲基 DNA 结合 蛋白的存在、 SWI/SNF 的存在和 RNA 聚合酶 II 的存在。 0031 在前述实施方案中的任何一个的另外的方面中， 本发明提供了将 (a) 对 DNA 特异 性的一种或多种标记 ； 和 (b) 对一种或多种表观遗传修饰特异性的一种或多种标记的时间 重合探测鉴定为表示表观遗传修饰的 DNA 或染色质。 0032 在前述方面和实施方案中的任何一个的另外的方面中， 该方法还可以包括确定是 否已经发生对 DNA 特异性的标记和对一种或多种表观遗传修饰特异性的标记的时间重合

40、 探测或时间相关的探测。在一些实施方案中， 本文提供的方法还可以包括将对 DNA 特异性 的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记的时间重合 说 明 书 CN 102725419 A 8 6/34 页 9 探测鉴定为表示表观遗传修饰的 DNA。该方法还可以包括将对 DNA 特异性的标记和对一种 或多种表观遗传修饰特异性的标记的时间重合探测鉴定为表观遗传修饰的染色质片段的 探测。该方法还可以包括计数所探测的表观遗传修饰的染色质片段的数量。 0033 在前述方面和实施方案中的任何的另外的方面中， 该方法可以包括探测四种标记 中的至少三种。 0034 在前述方面和实施方案中

41、的任何的另外的方面中， 该方法可以包括探测与表观遗 传标记物和至少一个其他标记特异地络合的一个标记。 至少一个其他标记可以与组蛋白络 合或是选自由以下组成的组的核酸结合剂 ： 序列特异性探针、 嵌入染料、 小沟粘合剂和 DNA 结合蛋白。至少一个其他标记与结合剂络合， 结合剂与选自由非组蛋白蛋白、 转录因子、 MBD1、 RNA Pol II 和 RNA 组成的组的靶络合。 0035 在前述方面和实施方案中的任何一个中， 探询容积小于约 10、 1、 0.5、 0.2、 0.1 或 0.05飞升(femtoliter)。 遗传物质可以在小于约1、 0.5、 0.1、 0.01、 0.001或0

42、.0001秒被表 征。被照亮的探询容积可以包含单一染色质。一个或多个探询容积可以是以下中的一个或 多个 ： (a) 小于约 10、 1、 0.5、 0.2、 0.1 或 0.05 飞升、 (b) 不大于物体的尺寸的约 10,000 倍， 提供单分子分辨率、 (c) 形成所需的尺寸以保持单一核酸分子、 和 (d) 由通道的壁和来自所 述光源的光束限制， 所述光束具有不大于 X 微米的直径。 0036 在前述实施方案中的任何一个中， 探测系统可以测量大于约 2 的信噪比。通道包 括光学透明的壁。光源提供具有不同波长的多个光束。 0037 在前述实施方案中的任何一个的另外的方面中， 本发明提供了用照

43、亮源例如白炽 源、 发光二级管、 闪光灯或激光器激发对一种或多种表观遗传修饰特异性的标记和激发对 DNA 特异性的标记。照亮源可以是一种或多种激光器。在前述实施方案中的任何一个的另 外的方面中， 本发明提供用光探测器例如光电倍增管、 雪崩光电二极管、 CCD 或 CMOS 阵列探 测被发射的光子。 0038 发射可以包括用雪崩光电二极管或光电倍增管探测被发射的光子。 0039 该方法还可以包括计数表观遗传修饰的 DNA 的量。该方法还可以包括将所述计数 表观遗传修饰的 DNA 的量的结果存储在计算机可读的介质上。 0040 该方法还可以包括将所探测的表观遗传修饰的染色质片段的数量存储在计算机

44、可读的介质上。 0041 该方法还可以包括改变所应用的跨过亚微米通道的电压的量以从不提供对 DNA 特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记的时 间重合探测的 DNA 分选表观遗传修饰的 DNA。该方法还可以包括改变所应用的跨过亚微米 通道的电压的量以从不提供对 DNA 特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传标 记物特异性的一种或多种标记的时间重合探测的 DNA 分选表观遗传修饰的 DNA。该方法还 可以包括应用分选激光器以从不提供对 DNA 特异性的一种或多种标记和对一种或多种表 观遗传标记物特异性的一种或多种标记的时间重合探测的 DNA 分选表观遗传修

45、饰的 DNA。 本发明方法还可以包括改变跨过亚微米通道的磁矩以从不提供对 DNA 特异性的一种或多 种标记和对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记的时间重合探测的 DNA 分选表观遗传修饰的 DNA。 0042 在前述实施方案中的任何一个中， 被分选的表观遗传修饰的 DNA 可以通过 PCR、 核 说 明 书 CN 102725419 A 9 7/34 页 10 酸杂交分析、 微阵列分析、 ChIP 或 DNA 测序来进一步分析。在前述实施方案中的任何一个 中， 该方法还可以包括从通过探测对 DNA 特异性的一种或多种标记提供的信号幅度计算所 探测的 DNA 的尺寸。在前述实施方案中

46、的任何一个的另外的方面中， 本发明提供一种用于 通过改变电压、 使用分选激光器、 改变磁矩或改变跨过亚微米通道的压差来分选表观遗传 修饰的 DNA 或染色质的方法。在前述实施方案中的任何一个的另外的方面中， 本发明提供 了通过 PCR、 核酸杂交、 微阵列、 ChIP、 DNA 测序、 质谱法和 NMR 来进一步分析被分选的 DNA。 在前述实施方案中的任何一个的另外的方面中， 本发明提供了从通过探测对 DNA 特异性的 一种或多种标记提供的信号幅度计算 DNA 的尺寸。 0043 该方法可以包括改变所应用的跨过亚微米通道的电压或压力的量以从不提供对 DNA 特异性的一种或多种标记和对一种或多

47、种表观遗传修饰特异性的一种或多种标记的时 间重合探测的 DNA 分选表观遗传修饰的 DNA。 0044 该方法还可以包括使用分选激光器以从不提供对 DNA 特异性的一种或多种标记 和对一种或多种表观遗传修饰特异性的一种或多种标记的时间重合探测的 DNA 分选表观 遗传修饰的 DNA。在一些实施方案中， 被分选的表观遗传修饰的 DNA 可以通过 PCR、 核酸杂 交分析、 微阵列分析、 ChIP或DNA测序来进一步分析。 一种或多种表观遗传修饰可以选自一 种或多种DNA核苷酸的甲基化、 一种或多种DNA核苷酸的羟甲基化、 一种或多种组蛋白的乙 酰化、 一种或多种组蛋白的甲基化、 一种或多种组蛋白

48、的泛素化、 一种或多种组蛋白的 Sumo 化、 一种或多种组蛋白的磷酸化、 RNA 聚合酶 II 的结合和 SWI/SNF 的结合。 0045 该方法还可以包括应用跨过亚微米通道的电压电位或压差， 其中电压电位或压差 将多个染色质片段从亚微米通道的第一端部推动至亚微米通道的另一个端部。 该方法还可 以包括探测对 DNA 特异性的标记。该方法还可以包括探测对一种或多种表观遗传修饰特异 性的标记。 0046 通过引用的并入 0047 在本说明书中提到的所有出版物和专利申请通过引用并入本文， 其达到的程度如 同特别且单独地指明每个单独的出版物或专利申请通过引用并入。 0048 附图简述 0049 在

49、所附权利要求中详细地阐述了本发明的新颖特征。通过参考阐述例证性实施 方案的下面详述的描述将获得对本发明的特征和优点的更好理解， 其中本发明的原理被利 用， 且其中附图 ： 0050 图 1A、 图 1B 和图 1C 描述本发明的示例性设备。图 1A 是包含 27 个设备的 100 毫 米直径晶片的照片， 每一个设备由平行阵列的 16 个用于单分子光谱学的亚微米流控通道 组成。加入流控端口 ( 晶片的左侧 ) 以与通向通道的流体储器连接。设备可以用于收集单 分子时间重合数据， 其中电压梯度可以被设置成使染色质从底部向顶部或从顶部向底部运 动。图 1B 描绘存在于 27 个设备中的一个上的 16 个流控通道中的 15 个的光学显微照片。 图 1C 描绘流控通道中的一个的放大图。该图是用于 SCAN( 纳米级的单一染色质分析 ) 的 典型的纳流控通道的微分干涉相衬光学显微照片。在荧光探测期间使用具有 500nm 宽和 250nm 深的横截面的窄区域。这些通道中的 432 个被组装在单一 100mm 直径熔融石英晶片 上。标度线是 10m。 0051 图 2 描绘本发明的设备的一个实施方案的框图。激光器可以用于激发与染色质 说 明 书 CN 102725419 A 10 8/34 页 11 相关的荧光团， 染色质由电动流定向成通过安装在成像平台例如共焦显微镜