检测PAX2用于诊断乳腺癌.pdf

1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 200980161426.2 (22)申请日 2009.08.25 12/546,292 2009.08.24 US C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 菲吉尼克斯公司 地址 美国乔治尼亚州 (72)发明人 卡尔顿D唐纳德 (74)专利代理机构 北京英赛嘉华知识产权代理 有限责任公司 11204 代理人 王达佐 洪欣 WO 2008/089236 A2,2008.07.24, 权利要求 1-2， 说明书第 67 页末段至第 68 页首段 , 实施例 6-7， 表 10, 说明书第 3 页第 3 段， 图 6， 表 2-

2、4， 实 施例 9, 说明书第 40 页末段 . Khoubehi et al.Expression of the developmental and oncogenic PAX2 gene in human prostate cancer.Journal of urology .2001, 第 165 卷 ( 第 6 期 ),2115-2120. Sudeep K Bose et al.PAX2 oncogene negatively regulates the expression of the host defense peptide human beta defensin-1 in p

3、rostate cancer. Molecular Immunology .2008, 第 46 卷 ( 第 6 期 ),1140-1148. (54) 发明名称 检测 PAX2 用于诊断乳腺癌 (57) 摘要 公开了用于监测个体中乳腺疾病的方法。所 述方法包括测定获自个体乳腺的细胞中配对盒 2 基因 - 比 - 防御素 -1 基因 (PAX2- 比 -DEFB1) 的表达率 (“Donald 预测因子” 或 “DPF” )， 其中 所述PAX2-比 -DEFB1 表达率与乳腺疾病相关。 还 公开了用于监测乳腺疾病和测定药物抗性的试剂 盒。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶

4、段日 2012.03.13 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2009/054913 2009.08.25 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2011/025475 EN 2011.03.03 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孙永福 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书58页 序列表1页 附图31页 (10)授权公告号 CN 102648287 B (45)授权公告日 2015.03.04 CN 102648287 B 1/2 页 2 1.用于检测配对盒2(PAX2)表达的寡核苷酸引物和用于检测-防御素-1(DEFB1

5、)表 达的寡核苷酸引物在制备用于监测个体乳腺疾病的试剂盒中的用途， 所述试剂盒包含 ： 用于检测组织样品中 PAX2 表达的一对或多对寡核苷酸引物 ； 用于检测组织样品中 DEFB1 表达的一对或多对寡核苷酸引物 ； 以及 如何利用所述引物测定组织样品中 PAX2- 比 -DEFB1 表达率的说明书， 其中所述寡核苷酸引物用于测定获自所述个体乳腺的细胞中 PAX2- 比 -DEFB1 的表达 率， 其中所述 PAX2- 比 -DEFB1 表达率与乳腺疾病相关。 2.如权利要求1所述的用途， 其中所述PAX2-比-DEFB1表达率为100:1或更高是个体 中存在乳腺癌的指征， 而 PAX2- 比

6、 -DEFB1 表达率小于 100:1 是个体中存在非癌或癌前乳腺 疾病的指征。 3. 如权利要求 2 所述的用途， 其中所述癌前乳腺疾病是乳腺上皮内瘤变。 4. 如权利要求 1 所述的用途， 其中所述测定包括 ： 测定相对于对照基因表达水平的 PAX2 基因表达水平 ； 测定相对于同一对照基因表达水平的 DEFB1 基因表达水平 ； 以及 基于 PAX2 和 DEFB1 的表达水平确定 PAX2- 比 -DEFB1 表达率。 5. 如权利要求 4 所述的用途， 其中所述 PAX2、 DEFB1 和对照基因的表达水平通过定量 实时 RT-PCR 测定。 6. 如权利要求 4 所述的用途， 其中

7、所述 PAX2、 DEFB1 和对照基因的表达水平通过表达 微阵列测定。 7. 如权利要求 4 所述的用途， 其中所述对照基因是 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 基 因。 8. 如权利要求 1 所述的用途， 所述试剂盒还包含测定获自乳腺组织的细胞中雌激素受 体 / 孕激素受体 / 人表皮生长因子受体 2(ER/PR/HER2) 的状态的试剂。 9.如权利要求1所述的用途， 其中所述用于检测PAX2表达的寡核苷酸引物包括选自以 下的寡核苷酸引物对 ： SEQ ID NOS:43 和 47， SEQ ID NOS:44 和 48， 以及 SEQ ID NOS:45 和 49。 10. 如权

8、利要求 1 所述的用途， 其中所述用于检测 DEFB1 表达的寡核苷酸引物包括 SEQ ID NOS:35 和 37。 11. 如权利要求 1 所述的用途， 所述试剂盒还包含一对或多对对照寡核苷酸引物。 12. 如权利要求 11 所述的用途， 其中所述一对或多对对照寡核苷酸引物包括用于检测 - 肌动蛋白表达的寡核苷酸引物。 13. 如权利要求 12 所述的用途， 其中所述用于检测 - 肌动蛋白表达的寡核苷酸引物 包括 SEQ ID NOS:34 和 36。 14. 如权利要求 11 所述的用途， 其中所述一对或多对对照寡核苷酸引物包括用于检测 GAPDH 表达的寡核苷酸引物。 15.如权利要求

9、14所述的用途， 其中所述用于检测GAPDH表达的寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS:42 和 46。 16. 如权利要求 1 所述的用途， 所述试剂盒还包含用于 PCR 反应的一种或多种试剂。 权 利 要 求 书 CN 102648287 B 2 2/2 页 3 17. 如权利要求 1 所述的用途， 所述试剂盒还包含用于 RNA 提取的一种或多种试剂。 18. 一种寡核苷酸微阵列在制备用于监测个体乳腺疾病的试剂盒中的用途， 其中所述寡核苷酸微阵列具有用于检测 PAX2 和 DEFB1 表达的寡核苷酸探针 ； 以及 其 中 所 述 试 剂 盒 还 包 含 如 何 利 用 所 述 寡 核 苷

10、酸 微 阵 列 测 定 组 织 样 品 中 PAX2- 比 -DEFB1 表达率的说明书。 19.如权利要求18所述的用途， 所述试剂盒还包含用于从组织样品中提取RNA的试剂。 20.用于检测PAX2表达的寡核苷酸引物和用于检测DEFB1表达的寡核苷酸引物在制备 用于确定患有乳腺疾病的个体的治疗方案的试剂盒中的用途， 其中所述试剂盒包含 ： 用于检测组织样品中 PAX2 表达的一对或多对寡核苷酸引物 ； 用于检测组织样品中 DEFB1 表达的一对或多对寡核苷酸引物 ； 以及 如何利用所述引物测定组织样品中 PAX2- 比 -DEFB1 表达率的说明书， 其中所述寡核苷酸引物用于测定获自所述患有

11、乳腺疾病的个体的乳腺组织的细胞中 相对于对照基因表达水平的 PAX2 基因表达水平， 以及 基于 PAX2 基因的相对表达水平确定用于所述个体的治疗方案。 21. 如权利要求 20 所述的用途， 其中所述对照基因是肌动蛋白基因或 GAPDH 基因。 22.如权利要求20所述的用途， 其中所述乳腺疾病是雌激素受体阴性乳腺癌， 和/或孕 激素受体阴性乳腺癌， 和 / 或人表皮生长因子受体 2 阴性乳腺癌。 23.如权利要求20所述的用途， 其中所述乳腺疾病是雌激素受体阳性乳腺癌， 和/或孕 激素受体阳性乳腺癌， 和 / 或人表皮生长因子受体 2 阳性乳腺癌。 权 利 要 求 书 CN 102648

12、287 B 3 1/58 页 4 检测 PAX2 用于诊断乳腺癌 0001 本申请要求于 2009 年 8 月 24 日提交的美国申请号 12/546,292 的优先权。前述 申请整体通过引用并入本文。 0002 领域 0003 本申请通常涉及医疗诊断， 具体涉及用于诊断各种组织中癌症状态的方法。 0004 背景 0005 乳腺癌是女性最常见的癌症原因， 并且在美国是女性第二大常见的癌症死亡原 因。虽然多数初期乳腺癌是基于发现乳腺影像异常来诊断的， 但是肿块或乳腺组织坚实度 的变化也可以是疾病的警报信号。 过去几十年内提高乳腺癌风险意识已致使增加进行乳腺 摄影筛查的女性数量， 导致更早期检测癌

13、症并且由此提高存活率。尽管如此， 乳腺癌是 45 至 55 岁女性最常见的死亡原因。 0006 乳腺癌可以分成几期。0 期是原位癌 ( 包括小叶癌和乳腺导管癌 )。I 期是浸润性 乳腺癌的早期阶段。肿瘤直径不超过 2 厘米。癌细胞尚未超出乳腺扩散。II 期肿瘤包括 直径不超过 2 厘米但已扩散到腋下淋巴结的肿瘤、 2 至 5 厘米且可能已扩散到腋下淋巴结 的肿瘤， 以及大于 5 厘米 (2 英寸 ) 但尚未扩散到腋下淋巴结的肿瘤。III 期是局部发展的 癌。III 期进一步被分成 IIIA 期、 IIIB 期和 IIIC 期。IV 期是向远处转移的癌。肿瘤已扩 散到身体的其他部位。早期阶段的治

14、疗选择不同于晚期选择。 0007 已知许多类型的癌症是由遗传畸变即突变引起。突变的积聚和细胞控制功能的 损失致使从正常组织学到早期癌前的进行性表型变化， 如上皮内瘤变 (IEN) 到日益严重的 IEN到浅表癌以及最终到浸润性疾病。 该过程通常在几年甚至几十年内相对缓慢地发生， 虽 然在一些情况下可能相对迅速。 癌基因依赖是癌细胞对维持恶性表型的单一癌基因的连续 活化或过表达的生理依赖。这种依赖发生于标志肿瘤进程的其它变化的环境中。 0008 长时期发展成浸润性癌症提供了临床干预的时机。因此， 重要的是鉴定指征癌前 疾病的生物标志物， 以便可以采取治疗措施预防或延缓浸润性癌症发展。 0009 简

15、述 0010 本发明一方面涉及监测个体中乳腺疾病的方法。 所述方法包括测定获自个体乳腺 的细胞中配对盒 2 基因 (Paired Box 2 gene)- 比 - 防御素 -1 基因 (PAX2- 比 -DEFB1) 表达率， 其中所述PAX2-比-DEFB1表达率与乳腺疾病相关并且能用作确定治疗进程的预示 物。 0011 在一实施方案中， PAX2- 比 -DEFB1 表达率为 100 1 或更高是个体存在乳腺癌的 指征， 而 PAX2- 比 -DEFB1 表达率小于 100 1 是个体存在非癌或癌前乳腺疾病的指征。 0012 在另一实施方案中， 所述测定步骤包括测定相对于对照基因表达水平的

16、 PAX2 基 因表达水平 ； 测定相对于同一对照基因表达水平的 DEFB1 基因表达水平 ； 以及基于 PAX2 和 DEFB1 的表达水平确定 PAX2- 比 -DEFB1 表达率。 0013 在一实施方案中， 所述方法还包括测定获自患有乳腺疾病的乳腺组织的细胞中雌 激素受体 / 孕激素受体 / 人表皮生长因子受体 2(ER/PR/HER2) 的状态。 0014 本发明另一方面涉及用于监测乳腺疾病的试剂盒。在一实施方案中， 用于监测乳 说 明 书 CN 102648287 B 4 2/58 页 5 腺疾病的试剂盒包含 ： 用于检测组织样品中 PAX2 表达的一对或多对寡核苷酸引物， 用于检

17、 测组织样品中 DEFB1 表达的一对或多对寡核苷酸引物， 以及如何利用所述引物测定组织样 品中 PAX2- 比 -DEFB1 表达率的说明书。在另一实施方案中， 用于检测 PAX2 表达的一对或 多对寡核苷酸引物包括选自以下的寡核苷酸引物对 ： SEQ ID NOS ： 43和47， SEQ ID NOS ： 44 和 48 和 SEQ ID NOS ： 45 和 49。在另一实施方案中， 用于检测 DEFB1 表达的一对或多对寡 核苷酸引物包括 SEQ ID NOS ： 35 和 37。 0015 在另一实施方案中， 所述试剂盒还包含一对或多对对照寡核苷酸引物。在一实施 方案中， 所述一对

18、或多对对照寡核苷酸引物包括用于检测 - 肌动蛋白表达的寡核苷酸引 物。 在优选实施方案中， 所述用于检测-肌动蛋白表达的寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS ： 34 和 36。 0016 在另一实施方案中， 所述一对或多对对照寡核苷酸引物包括用于检测 GAPDH 表达 的寡核苷酸引物。在优选实施方案中， 所述用于检测 GAPDH 表达的寡核苷酸引物包括 SEQ ID NOS ： 42 和 46。 0017 在另一相关实施方案中， 所述试剂盒还包含用于 PCR 反应的一种或多种试剂。 0018 在又一相关实施方案中， 所述试剂盒还包含用于 RNA 提取的一种或多种试剂。 0019 在另一实施方

19、案中， 用于监测乳腺疾病的试剂盒包含具有用于检测 PAX2 和 DEFB1 表达的寡核苷酸探针的寡核苷酸微阵列， 以及如何利用所述寡核苷酸微阵列测定 PAX2- 比 -DEFB1 表达率的说明书。 0020 在相关实施方案中， 所述试剂盒还包含用于从组织样品中提取 RNA 的试剂。 0021 本发明另一方面涉及确定用于患有乳腺疾病的个体的治疗方案的方法。 所述方法 包括以下步骤 ： 测定获自所述患有乳腺疾病个体的乳腺组织的细胞中相对于对照基因表达 水平的 PAX2 基因表达水平， 以及基于 PAX2 基因的相对表达水平确定用于所述个体的治疗 方案。 0022 附图简要说明 0023 并入和组成

20、本说明书一部分的附图阐述了所公开方法和组合物的几种实施方案， 并与本部分说明一起用于说明所公开方法和组合物的原理。 0024 图 1 给出 - 防御素 -1(DEFB1) 表达的定量 RT-PCR(QRT-PCR) 分析。为验证诱导 DEFB1表达， 进行QRT-PCR。 图1A给出比较来自经过根治性前列腺切除术的6名患者的临床 样品中的 DEFB1 相对表达水平。图 1B 给出在 DEFB1 诱导之前和之后比较良性和恶性前列 腺临床样品、 hPrEC 细胞和前列腺癌细胞系中的 DEFB1 相对表达水平。图 1C 给出分析单个 组织切片中良性组织、 恶性组织和前列腺上皮内瘤变 (PIN) 中的

21、 DEFB1 相对表达水平。图 1D 给出比较一名患者中良性组织、 恶性组织和 PIN 中的 DEFB1 表达与良性组织中存在的平 均 DEFB1 表达水平。 0025 图 2 给出 DEFB1 诱导膜完整性和细胞形态变化的显微镜分析。通过相差显微镜分 析 DEFB1 诱导 48 小时之后的 DU145、 PC3 和 LNCaP 的细胞形态。黑色箭头指示膜波动， 白色 箭头指示凋亡小体。 0026 图 3 给出前列腺癌细胞中 DEFB1 的细胞毒性分析。用 PonA 处理前列腺细胞系 DU 145、 PC3 和 LNCaP 来诱导 DEFB1 表达 1-3 天， 之后进行 MTT 检测以确定细

22、胞活力。结果表 示为平均值 标准偏差， n 9。 说 明 书 CN 102648287 B 5 3/58 页 6 0027 图 4 给出由 DEFB1 诱导 DU145 和 PC3 细胞的细胞死亡。诱导前列腺癌细胞系 DU145(A) 和 PC3(B) 中的 DEFB1 表达， 然后经过膜联蛋白 V/FITC/ 碘化丙啶染色和流式细 胞仪分析。碘化丙啶和膜联蛋白 V 阳性细胞被认为是凋亡的。各图下方给出诱导时间。对 于每个时间点， 框旁边的数字表示碘化丙啶 (PI)- 膜联蛋白 V+ 细胞 ( 右下象限 )， 以及 PI+ 膜联蛋白 V+ 细胞 ( 右上象限 ) 的百分比。数据来自代表三个独立

23、试验的单次试验。 0028 图 5 给出 DEFB1 诱导之后的泛 - 半胱天冬酶 (pan-caspase) 分析。DU145 和 PC3 细胞用FAM-VAD-FMK-标记的氟甲基酮染色来检测半胱天冬酶活性。 DIC下可见每种条件下 的细胞。共聚焦显微镜分析显示对照 DU145(B)、 PC3 细胞 (F) 和 LNCaP 细胞 (J) 中没有半 胱天冬酶染色。用 PonA 处理细胞 24 小时诱导 DEFB1 显示 DU145(D) 和 PC3(H) 中的半胱天 冬酶活性。LNCaP(L) 中未检测到半胱天冬酶活性。 0029 图 6 给出 PAX2 siRNA 处理之后配对盒同源基因

24、2(PAX2) 蛋白表达的沉默。图 6A 给出用 PAX2 siRNA 双螺旋转染的 PC3 和 DU145 细胞在第 0 日 ( 泳道 1)、 第 2 日 ( 泳道 2) 和第 4 日 ( 泳道 3) 的 Western 印迹分析。图 6B 给出用 PAX2 siRNA 双螺旋转染的 PC3 和 DU145 细胞在第 0 日 ( 泳道 1)、 第 2 日 ( 泳道 2)、 第 4 日 ( 泳道 3) 和第 6 日 ( 泳道 4) 的 Western 印迹分析。早在处理 4 日 ( 泳道 3) 之后 DU145 细胞中不能检测到 PAX2 蛋白， 处 理 6 日之后 PC3 细胞中不能检测到

25、PAX2 蛋白。将印迹清除并重新探测作为内参的 - 肌 动蛋白。 0030 图 7 给出对用 PAX2 siRNA 处理之后的前列腺癌细胞生长的分析。于第 6 日通过 相差显微镜分析存在于正常生长培养基中的 DU145、 PC3 和 LNCaP。用阴性对照 siRNA 处理 对细胞没有影响。然而， 用 PAX2 siRNA 处理之后显著减少全部三种细胞系的细胞数量。 0031 图8给出对siRNA沉默PAX2之后的细胞死亡的分析。 用0.5g的四种PAX2 siRNA 或四种非特异的对照 siRNA 池处理前列腺癌细胞系 PC3、 DU145 和 LNCaP 2、 4 或 6 天之后， 进行

26、MTT 检测以测定细胞活力。结果表示为平均值 标准偏差， n 9。 0032 图 9 给出对半胱天冬酶活性的分析。用 PAX2 siRNA 处理之后， 用羧基荧光素标记 的氟甲基酮染色 DU145、 PC3 和 LNCaP 细胞来检测半胱天冬酶活性。未处理和处理的细胞的 共聚焦显微镜分析显示， 细胞用DIC可见。 荧光下分析显示， 对照DU145(B)、 PC3细胞(F)和 LNCaP细胞(J)无半胱天冬酶染色。 然而， 用PAX2 siRNA处理的细胞诱导DU145(D)、 PC3(H) 和 LNCaP(L) 中的半胱天冬酶活性。 0033 图 10 给出对 PAX2 siRNA 处理之后的

27、凋亡因子的分析。比较未处理对照细胞和 用 PAX2 siRNA 处理 6 日的细胞中促凋亡因子表达的变化。图 10A 显示 Bcl-2- 相关 X 蛋 白 (BAX) 表达水平在 DU145、 PC3 和 LNCaP 中增加。图 10B 显示 BH3 结构域凋亡诱导蛋白 (BID) 表达在 DU145 和 LNCaP 中增加， 但在 PC3 中改变。图 10C 显示 Bcl-2- 相关死亡促进 因子 (BAD) 表达水平在全部三种细胞系中均增加。 0034 图 11 给出 PAX2 与 DNA 识别序列结合的模型。PAX2 转录阻遏物结合到直接邻近 DEFB1 TATA 盒的 CCTTG(SE

28、Q ID NO ： 1) 识别位点， 从而阻止转录和 DEFB1 蛋白表达。PAX2 蛋白表达的抑制允许正常 DEFB1 表达。 0035 图 12 显示 DEFB1 报告构建体。将来自 DU145 细胞的由 mRNA 起始位点上游前 160 个碱基组成的 DEFB1 启动子进行 PCR 扩增， 并连接到 pGL3 荧光素酶报告质粒。 0036 图 13 给出抑制 PAX2 导致 DEFB1 表达。用 PAX2 siRNA 处理 DU145、 PC3、 LNCaP 和 说 明 书 CN 102648287 B 6 4/58 页 7 HPrEC 48 小时。处理之前的 QRT-PCR 分析显示

29、DU145、 PC3 和 LNCaP 中没有 DEFB1 表达。然 而， 处理之后全部细胞系中的 DEFB1 表达恢复。siRNA 处理之后 PAX2- 缺失的 HprEC 中的 DEFB1 表达没有变化。 0037 图14给出抑制PAX2导致DEFB1启动子活性增强。 产生PC3启动子/pGL3和DU145 启动子 /pGL3 构建体， 并分别转染至 PC3 和 DU145 细胞。比较由 siRNA 处理抑制 PAX2 之前 和之后的启动子活性。处理之后， DU145 中的 DEFB1 启动子活性增强 2.65 倍， PC3 中增强 3.78 倍。 0038 图15给出PAX2与DEFB1启

30、动子结合的ChIP分析。 对DUI45和PC3细胞进行ChIP 分析。用抗 -PAX2 抗体免疫沉淀之后， 进行 PCR 以检测含有 GTTCC(SEQ ID NO ： 2)PAX2 识别 位点的 DEFB1 启动子区。这证实前列腺癌细胞系中的 PAX2 转录阻遏物与 DEFB1 启动子结 合。 0039 图 16 给出 PrdPD 和 PrdHD 与 DNA 的预测结构。将 PrdPD 结合至 DNA(Xu et al.， 1995) 和 PrdHD 结合至 DNA(Wilson et al.， 1995) 的结构的协同用于构建两个结构域结合 至 PH0 位点的模型。各结合位点以所示的特定的

31、方向彼此邻接。RED 结构域基于 PrdPD 晶 体结构定向。 0040 图 17 给出不同配对结构域共有序列的比较。在图顶部示出 Prd- 配对 - 结构域 DNA复合物晶体学分析中所描述的蛋白DNA接触的示意图。 空框指示-螺旋， 阴影框 指示 - 折叠， 以及粗线指示 - 转角。接触的氨基酸由单字母代码给出。仅给出直接接 触的氨基酸 碱基。空圈指示大沟接触， 而红箭头指示小沟接触。该示意图是配对结构域 蛋白所有已知共有序列的比对 ( 仅给出正义链 )。共有序列之间的垂直线指示保守的碱基 对。位置编号在图底部给出。 0041 图 18 给出靶向 PAX2 作为化学预防性策略。异常的 PAX

32、2 表达是癌症开始和发展 的早期事件。发育异常过程中或其它癌前阶段抑制 PAX2 可以用于癌症预防。 0042 图19给出血管紧张素II(Ang II)对DU145细胞中PAX2表达的影响。 为测定AngII 对 PAX2 表达的影响， 处理之后监测 DEFB1 蛋白水平。此时 PAX2 表达水平早在 4 小时就增 加并且持续到 48 小时。 0043 图 20A 给出洛沙坦 (Los) 对 DU145 细胞中 PAX2 表达的影响。用血管紧张素 II-1 型受体 (ATR1) 阻断剂洛沙坦处理 DU145 细胞。QRT-PCR 显示处理之后 PAX2 信息水平降低 至少一半。图 20B 给出

33、血管紧张素 II-2 型受体 (ATR2) 阻断剂对 DU145 细胞中 PAX2 表达 的影响。为测定 ATR2 受体对 PAX2 表达的影响， 用 ATR2 受体阻断剂 PD123319 处理 DU145 细胞。此时， PAX2 表达增加 7 至 8 倍。 0044 图 21 给出 Los 阻断 AngII 对 DU145 细胞中 PAX2 表达的影响。用 5M AngII 处 理 DU145 细胞 72 小时导致 PAX2 表达增加 2 倍。此外， 用 10M 处理 72 小时导致表达增加 超过 3 倍。用 5M 洛沙坦处理细胞阻抑增殖 50。此外， 在用 AngII 处理之前用洛沙坦处

34、 理 30 分钟阻断 AngII 对增殖的影响。 0045 图 22 给出 AngII 增加 DU145 细胞增殖。用 5M AngII 处理 DU145 细胞 72 小时 导致增殖增加 2 倍。此外， 用 10M 处理 72 小时导致增殖增加超过 3 倍。 0046 图 23 给出 Los 和 MAP 激酶抑制剂对 DU145 细胞中 PAX2 表达的影响。图 23A 显示 用洛沙坦处理 DU145 细胞阻抑磷酸化 -ERK1/2 和 PAX2 表达 ； 图 23B 显示 MEK 激酶抑制剂和 说 明 书 CN 102648287 B 7 5/58 页 8 AICAR 阻抑 PAX2 蛋白表

35、达 ； 图 23C 给出 MEK 激酶抑制剂和洛沙坦阻抑磷酸化 -STAT3 蛋白 表达。 0047 图 24 给出 Los 和 MEK 激酶抑制剂对 DU145 细胞中 PAX2 活化的影响。图 24A 显示 用 AT1R 信号转导抑制剂处理 DU145 细胞导致磷酸化 -PAX2 蛋白 ( 其为 PAX2 的活化形式 ) 水平降低。此外， 用 AMP 激酶诱导剂 AICAR 处理导致阻抑 PAX2 表达。图 24B 显示用 Los 抑 制 AT1R 信号转导降低磷酸化 -JNK 水平。然而， AngII 增加磷酸化 -JNK 蛋白水平。 0048 图25给出AngII在hPrEC细胞中增加

36、PAX2表达而降低DEFB1表达。 为测定AngII 对 hPrEC 中 PAX2 水平的影响， 处理细胞 72 和 96 小时， 并通过 QRT-PCR 检测 PAX2 和 DEFB1 表达。此时， AngII 处理导致 PAX2 显著增加至与 PC3 前列腺癌细胞相似的水平。相反地， AngII 处理之后显著降低 DEFB1 表达。 0049 图 26 给出 AngII 信号转导和 PAX2 前列腺癌的示意图。前列腺癌细胞中的 PAX2 表达由 AT1R 信号转导通路调控。具体地， MEK 激酶信号转导级联致使 PAX2 表达增加。此 外， AT1R 和 AngII 通过 JNK 上调 P

37、AX2 活化作用。 0050 图 27 给出阻断 PAX2 表达作为前列腺癌疗法的示意图。图 27A 给出 PAX2 表达由 AT1R 信号转导通路调控。抑制 PAX2 表达导致 DEFB1 重新表达和癌细胞死亡。图 27B 给出 阻断 AT1R， 下游激酶或直接抑制 PAX2 的化合物提供治疗前列腺癌的新方法。 0051 图 28 给出用 Gleason 评分对 DEFB1 和 PAX2 表达的比较。比较来自经过根治性前 列腺切除术的 6 名患者的良性临床样品中 DEFB1 相对表达水平。此时 Gleason 评分与邻 近良性前列腺组织中 DEFB1 表达水平负相关。相对 DEFB1 表达水

38、平大于 0.005 的患者的 Gleason 评分为 6。然而， 表达水平小于 0.005 的患者的 Gleason 评分为 7。 0052 图 29 给出 PAX2-DEFB1 比值作为前列腺癌发展的预测因子。对激光捕获显微切割 (LCM) 的前列腺组织切片进行 QRT-PCR 以测定相对 DEFB1 和 PAX2 表达水平。从正常到 PIN 到癌症， DEFB1 表达水平降低。然而， 从正常到 PIN 到癌症， PAX2 表达增加。此外， Gleason 评分为 6 的癌症患者 #1457 的正常组织和 PIN 中相对 Gleason 评分为 7 的癌症患者 #1569 具有更多的 DEF

39、B1。相反地， 患者 #1569 的癌区域与患者 #1457 相比具有更高的 PAX2 水平。 0053 图 30 给出 Donald 预测因子 (DPF) 是基于相对 PAX2-DEFB1 表达比值。提高前列 腺组织的 DPF 增加了发展前列腺癌的机会。基于 DPF， PAX2-DEFB1 比值为 0 至 39 的组织是 正常的 ( 良性 )。基于 DPF 量表， PAX2-DEFB1 比值为 40 至 99 的组织代表 PIN( 癌前 )。最 后， PAX2-DEFB1 比值为 100 至 500 的组织是恶性的 ( 低于高级别癌症 )。 0054 图 31 给出对人前列腺组织中 hBD-

40、1 表达的分析。将来自经过根治性前列腺切除 术的患者的正常临床样品中的 hBD-1 相对表达水平进行比较。虚线用作比较从粗略切割和 LCM的样本获得的值的参考点， 并且相应的Gleason评分在各误差棒上方示出。 图31A给出 比较由粗略切割获得的组织中的 hBD-1 表达水平。图 31B 给出比较由激光捕获显微切割获 得的组织中的 hBD-1 表达水平。 0055 图 32 给出对前列腺细胞系中 hBD-1 表达的分析。图 32A 给出与 hPrEC 细胞相比， 在 hBD-1 诱导之前和之后前列腺癌细胞系中的 hBD-1 表达水平。一个星号代表相比 hPrEC 统计学更高的表达水平。两个星

41、号代表相比 hBD-1 诱导之前的细胞系统计学显著的表达水 平 ( 学生 t- 检验， p 0.05)。图 32B 给出通过免疫细胞化学证实前列腺癌细胞系 DU145 中的异常 hBD-1 表达。将 hPrEC 细胞对 hBD-1 进行染色作为阳性对照 (a ： DIC 和 b ： 荧光 )。 说 明 书 CN 102648287 B 8 6/58 页 9 用 hBD-1 转染 DU145 细胞并诱导 18 小时 (c ： DIC 和 d ： 荧光 )。比例尺 20M。 0056 图 33 给出前列腺癌细胞中 hBD-1 的细胞毒性分析。用 Pon A 处理前列腺细胞系 DU145、 PC3、

42、 PC3/AR+ 和 LNCaP 来诱导 hBD-1 表达 1-3 天， 之后进行 MTT 测定以确定细胞活 力。每个误差棒代表一式三份进行三个独立试验的平均值 标准误。 0057 图 34 给出正常、 PIN 和肿瘤的 LCM 人前列腺组织切片中 hBD-1 和 cMYC 表达的 QRT-PCR 分析。每种基因的表达表示为与 - 肌动蛋白相比的表达率。图 34A 给出正常、 PIN 和肿瘤切片中 hBD-1 表达水平的比较。图 34B 给出正常、 PIN 和肿瘤切片中 cMYC 表达 水平的比较。 0058 图 35 给出用 siRNA 敲低 PAX2 之后的 hBD1 表达的 QRT-PC

43、R 分析。hBD-1 表达水平 表示为与 - 肌动蛋白相比的表达率。星号代表与 PAX2siRNA 处理之前的细胞系相比统计 学更高的表达水平 ( 学生 t- 检验， p 0.05)。 0059 图 36 给出 PAX2 siRNA 处理之后的 PAX2 蛋白表达的沉默。图 36A 给出通过 Western 印迹分析检测 HPrEC 前列腺原代细胞 ( 泳道 1) 以及 DU145( 泳道 2)、 PC3( 泳道 3) 和LNCaP(泳道4)前列腺癌细胞中的PAX2表达。 将印迹清除并重新探测作为内参的-肌 动蛋白， 以确保等量上样。图 36B 给出用 PAX2 siRNA 双螺旋感染之后 D

44、U145、 PC3 和 LNCaP 的 Western 印迹分析， 全部证实 PAX2 表达敲低。同样地， 将印迹清除并重新探测作为内参 的 - 肌动蛋白。 0060 图 37 给出对用 PAX2 siRNA 处理之后的前列腺癌细胞生长的分析。在阴性对照 非特异 siRNA 存在下， 于第 6 日通过相差显微镜分析 HprEC(A)、 LNCaP(C)、 DU145(E) 和 PC3(G)。用 PAX2 siRNA 处理之后， DU145(D)、 PC3(F) 和 LNCaP(H) 的细胞数量显著减少。然 而， 似乎对 HprEC(B) 没有影响。比例尺 20m。 0061 图 38 给出对

45、siRNA 沉默 PAX2 之后的细胞死亡的分析。用 PAX2siRNA 或非特异的 阴性对照 siRNA 处理前列腺癌细胞系 PC3、 DU145 和 LNCaP 2、 4 或 6 日之后， 进行 MTT 测定。 PAX2的敲低导致全部三种细胞系中的相对细胞活力降低。 结果表示为平均值标准偏差， n 9。 0062 图 39 给出对半胱天冬酶活性的分析。用 PAX2 siRNA 处理之后， DU145、 PC3 和 LNCaP 细胞用羧基荧光素标记的氟甲基酮染色来检测半胱天冬酶活性。荧光下分析显示对 照 DU145(A)、 PC3 细胞 (C) 和 LNCaP 细胞 (E) 中没有半胱天冬酶

46、染色。然而， 用 PAX2 siRNA 处理的细胞中， 在DU145(B)、 PC3(D)和LNCaP(F)中诱导半胱天冬酶活性。 比例尺20m。 0063 图 40 给出对 PAX2 siRNA 处理之后的凋亡因子的分析。比较未处理的对照细胞和 用 PAX2 siRNA 处理 6 天的细胞中促凋亡因子表达的变化。图 40A 显示在 PAX2 敲低之后的 DU145、 PC3 和 LNCaP 中， BAD 表达增加。图 40B 显示 BID 表达水平在 LNCaP 和 DU145 中增 加， 但在 PC3 细胞中未增加。图 40C 显示 AKT 表达在 LNCaP 和 DU145 中降低。然而

47、， PAX2 敲 低之后的 PC3 细胞中的 AKT 表达没有变化。结果表示为平均值 标准偏差， n 9。星号 代表统计学差异 (p 0.05)。 0064 详述 0065 除非另外限定， 本文所使用的全部技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物 所属领域的技术人员通常的理解相同的含义。 必须注意的是， 除非上下文清楚地另外指明， 本文和所附权利要求书所使用的 “一 (a)” 、“一 (an)” 和 “所述” 包括复数。因此， 例如对于 说 明 书 CN 102648287 B 9 7/58 页 10 “一肽 (a peptide)” 包括多种这样的肽， 对于 “所述肽” 是指一种或多种肽及本

48、领域技术人 员所了解的其等同物等。 0066 本发明一方面涉及监测癌症发展的方法。在某些实施方案中， 所述方法涉及监测 个体前列腺或乳腺的癌前状态 ( 如上皮内瘤变 ) 及癌症状态。所述方法包括测定获自个体 的前列腺或乳腺细胞中配对盒 2 基因 - 比 - 防御素 -1 基因 (PAX2- 比 -DEFB1) 表达率， 其中所述 PAX2- 比 -DEFB1 表达率与前列腺或乳腺疾病相关。基因表达率可以在 mRNA 水平 ( 例如通过 RT-PCR 或寡核苷酸阵列 ) 测定， 或在蛋白水平 ( 例如通过蛋白免疫印迹杂交或 抗体阵列 ) 测定。 0067 在某些实施方案中， PAX2- 比 -D

49、EFB1 表达率在 mRNA 水平测定， 并且在说明书中被 称为 “Donald 预测因子” 或 “DPF” 。 0068 在某些实施方案中， 将前列腺的 PAX2- 比 -DEFB1 表达率 ( 在 RNA 水平侧测定 ) 用 于区别个体中正常、 癌前和癌性的前列腺状态。 在一实施方案中， PAX2-比-DEFB1比值为小 于 40 1 是正常前列腺状态的指征， PAX2- 比 -DEFB1 比值为至少 40 1 至小于 100 1 是前列腺上皮内瘤变 (PIN) 的指征， 而 PAX2- 比 -DEFB1 比值为至少 100 1 是前列腺癌的 指征。 0069 还提供了用于诊断个体中前列腺癌的方法。 所述方法包括检测来自个体的前列腺 细胞中 PAX2 和 - 防御素 (DEFB1) 的水平， 其中所述 PAX2 比 DEFB1 比值为至少 100 1。 0070 还提供了诊断个体中前列腺上皮内瘤变 (PIN) 的方法。所述方法包括检测来自个 体的前列腺细胞中 PAX2 和 DEFB1 的水平， 其中所述 PAX2 比 DEFB1 的比值为至少 40 1 并小于 100 1。 0071 在某些另外的