体外连接和组合装配核酸分子的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102016070 A (43)申请公布日 2011.04.13 CN 102016070 A *CN102016070A* (21)申请号 200980113021.1 (22)申请日 2009.02.13 61/064,107 2008.02.15 US 61/029,312 2008.02.15 US 61/052,614 2008.05.12 US 61/098,202 2008.09.18 US 61/142,101 2008.12.31 US C12Q 1/68(2006.01) C12P 19/34(2006.01) (71)申请人 合成基因组公司 地址

2、 美国加利福尼亚州 (72)发明人 JC文特尔 DG吉布森 HO史密斯 CA哈奇森三世 L扬 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 赵蓉民 陆惠中 (54) 发明名称 体外连接和组合装配核酸分子的方法 (57) 摘要 本发明涉及体外连接两个或更多个感兴趣的 双链 (ds) 或单链 (ss)DNA 分子的方法， 其中每对 的第一 DNA 分子的远端区域和第二 DNA 分子的近 端区域共享序列同一性区域。所述方法允许以预 先确定的顺序和方向连接大量 DNA 片段， 而不使 用限制酶。其可以用来例如连接感兴趣的基因或 基因组合成产生的亚片段。还公开了用于进行所 述

3、方法的试剂盒。连接 DNA 分子的方法可以用来 产生组合文库， 所述组合文库用于通过密码子优 化、 基因优化和途径优化产生例如最佳蛋白表达。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2010.10.13 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2009/034153 2009.02.13 (87)PCT申请的公布数据 WO2009/103027 EN 2009.08.20 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 4 页 说明书 37 页 附图 10 页 CN 102016080 A1/4 页 2 1. 连接一组两个或更多个

4、双链 (ds) 或单链 (ss)DNA 分子的体外方法，其中待连接的 邻近 DNA 分子在其末端处含有重叠序列，所述方法包括将所述两个或更多个 DNA 分子 在有效连接所述两个或更多个DNA分子以在一步反应中形成第一装配dsDNA分子的条件 下在单个容器中在体外与下列接触 (a) 缺少 3核酸外切酶活性的分离的非热稳定 5至 3核酸外切酶， (b) 群集剂， (c) 具有 3核酸外切酶活性的分离的热稳定非链置换 DNA 聚合酶，或者所述 DNA 聚合酶与缺少 3核酸外切酶活性的第二 DNA 聚合酶的混合物， (d) 分离的热稳定连接酶， (e)dNTP 的混合物，以及 (f) 适合的缓冲液。

5、2. 权利要求 1 所述的方法，其中 (a) 的所述核酸外切酶是 T5 核酸外切酶并且所述接 触是在等温条件下。 3. 权利要求 1 的所述方法，其中 (b) 的所述群集剂是 PEG，和 / 或 (c) 的所述非链置换 DNA 聚合酶是 PhusionTM DNA 聚合酶或 VENTDNA 聚合酶， 和 / 或 (d) 的所述连接酶是 Taq 连接酶。 4.权利要求1所述的方法，其中所述条件还适于在所述连接反应后消化任何不成对的 非同源的单链 DNA。 5. 权利要求 4 所述的方法，其中所述待连接 DNA 分子中至少一些在一个末端包含与 任意感兴趣的所述 DNA 分子不同源的序列。 6. 权

6、利要求 5 所述的方法，其中所述非同源序列包含一个或更多个 PCR 引物的结合 区域，和 / 或 与载体序列同源的区域，和 / 或 一个或更多个限制酶的识别位点。 7.权利要求1-6中任一项所述的方法，进一步包括重复所述方法来彼此连接第二组两 个或更多个 DNA 分子，以获得第二装配 DNA 分子，然后连接所述第一和所述第二装配 DNA 分子，以获得第三装配 ds DNA 分子。 8. 用于连接一组两个或更多个双链 (ds) 或单链 (ss)DNA 分子的一步体外反应试剂 盒，其中待连接的邻近 DNA 分子在其末端含有重叠序列，所述试剂盒在单个容器中包含 (a) 缺少 3核酸外切酶活性的分离的

7、非热稳定 5至 3核酸外切酶， (b) 群集剂， (c) 具有 3核酸外切酶活性的分离的热稳定非链置换 DNA 聚合酶，或者所述 DNA 聚合酶与缺少 3核酸外切酶活性的第二 DNA 聚合酶的混合物， (d) 分离的热稳定连接酶， 其量使得当在适合的缓冲溶液和 dNTP 存在的情况下将所述两个或更多个 DNA 分子 添加到所述试剂盒并且在等温条件下温育时，所述两个或更多个 DNA 分子在协同反应中 被装配。 权 利 要 求 书 CN 102016070 A CN 102016080 A2/4 页 3 9. 权利要求 8 所述的试剂盒，其包含 (a)T5 核酸外切酶， (b)PEG， (c)Ph

8、usionTM DNA 聚合酶，以及 (d)Taq 连接酶。 10. 修饰全核酸分子性质的方法，所述方法包括 ： (a) 将所述全核酸分子的核酸序列沿其长度代表性地分成多个部分，从而鉴定部分核 酸分子的所述序列 ； (b) 对于至少 3 个所述部分核酸分子，提供每个部分核酸分子的多个变体 ； (c) 将所述变体与没有被改变的任意部分核酸分子在体外组合装配在一起，其中所述 部分核酸分子或其变体在其末端处含有重叠序列，由此所述部分核酸分子和其变体在所 述混合物中的装配将导致所述全核酸分子的多个变体的装配 ；以及 (d) 表达所述全核酸分子的所述变体，以确定所述全核酸分子的所述变体的任何被修 饰性质

9、。 其中步骤 (c) 的所述装配通过权利要求 1 所述的方法进行。 11. 连接一组两个或更多个双链 (ds) 或单链 (ss)DNA 分子的体外方法，其中待被连 接的邻近 DNA 分子在其末端处含有重叠序列，所述方法包括将两个或更多个 DNA 分子 在有效连接所述两个或更多个DNA分子以在一步循环变温反应中形成第一装配dsDNA分 子的条件下在单个容器中在体外与下列接触 (a) 分离的非热稳定 3至 5核酸外切酶，其在 dNTP 存在的情况下有活性， (b) 群集剂， (c) 分离的热激活 DNA 聚合酶， (d) 分离的热稳定连接酶， (e)dNTP 的混合物，以及 (f) 适合的缓冲液。

10、 12. 权利要求 11 所述的方法，其中 (a) 的所述核酸外切酶是核酸外切酶 III。 13. 权利要求 11 所述的方法，其中 (c) 的聚合酶通过去除以热敏方式与所述聚合酶结 合的失活部分而被热激活。 14. 权利要求 11 所述的方法，其中 (b) 的所述群集剂是 PEG，和 / 或 (c) 的所述 DNA 聚合酶是 AMPLITAQ GOLD ，和 / 或 (d) 的所述连接酶是 Taq 连接酶。 15. 权利要求 11-14 中任一项所述的方法，进一步包括重复所述方法来将第二组两个 或更多个 DNA 分子彼此连接，以获得第二装配 DNA 分子，然后连接所述第一和所述第 二装配 D

11、NA 分子，以获得第三装配 ds DNA 分子。 16. 用于连接一组两个或更多个双链 (ds) 或单链 (ss)DNA 分子的一步体外反应的试 剂盒，其中待被连接的邻近 DNA 分子在其末端含有重叠序列，所述试剂盒在单个容器中 包含 (a) 分离的非热稳定 3至 5核酸外切酶，其在 dNTP 存在的情况下有活性， 权 利 要 求 书 CN 102016070 A CN 102016080 A3/4 页 4 (b) 群集剂， (c) 分离的热激活 DNA 聚合酶， (d) 分离的热稳定连接酶， (e)dNTP 的混合物，以及 (f) 适合的缓冲液， 其量使得当所述两个或更多个 DNA 分子在适

12、合的缓冲溶液和 dNTP 存在的情况下被 添加到所述试剂盒和在循环变温条件下温育时，所述两个或更多个 DNA 分子在协同反应 中被装配。 17. 权利要求 16 所述的试剂盒，其包含 (a) 核酸外切酶 III， (b)PEG， (c)AMPLITAQ GOLDDNA 聚合酶，以及 (d)Taq 连接酶。 18. 修饰全核酸分子的性质的方法，所述方法包括 ： (a) 将所述全核酸分子的核酸序列沿其长度代表性地分成多个部分，从而鉴定部分核 酸分子的所述序列 ； (b) 对于至少 3 个所述部分核酸分子，提供每个部分核酸分子的多个变体 ； (c) 将所述变体与没有被改变的任意部分核酸分子在体外组合

13、装配在一起，其中所述 部分核酸分子或其变体在其末端处含有重叠序列，由此所述部分核酸分子和其变体在所 述混合物中的装配将导致所述全核酸分子的多个变体的装配 ；以及 (d) 表达所述全核酸分子的所述变体，以确定所述全核酸分子的所述变体的任何被修 饰性质。 其中步骤 (c) 的所述装配通过权利要求 11 所述的方法进行。 19. 修饰全核酸分子的性质的方法，所述方法包括 ： (a) 将所述全核酸分子的核酸序列沿其长度代表性地分成至少 5 个部分，从而鉴定部 分核酸分子的所述序列 ； (b) 对于至少 3 个所述部分核酸分子，提供所述部分核酸分子的多个变体 ； (c) 将所述变体与没有被改变的任意部分

14、核酸分子在体外组合装配在一起，其中所述 部分核酸分子或其变体在其末端处含有重叠序列，由此所述部分核酸分子和其变体在所 述混合物中的装配将导致所述全核酸分子的多个变体的装配 ；以及 (d) 表达所述全核酸分子的所述变体，以确定所述全核酸分子的所述变体的任何被修 饰性质。 20.权利要求19所述的方法，其中所述部分核酸分子的所述变体提供由所述部分核酸 分子编码的一个或更多个氨基酸的密码子的简并形式 ；或 其中所述部分核酸分子的所述变体提供影响所述全核酸分子转录或翻译的多个核酸 控制序列 ；或 其中所述部分核酸分子的所述变体提供编码肽或蛋白的结构域或基序的多个区域， 所述肽或蛋白由所述全核酸分子编码

15、 ；或 其中由所述部分核酸分子编码的所述肽或蛋白在代谢途径中一起起作用。 权 利 要 求 书 CN 102016070 A CN 102016080 A4/4 页 5 21. 修饰全核酸分子的性质的方法，所述方法包括 ： (a) 将所述全核酸分子的核酸序列沿其长度代表性地分成多个部分，从而鉴定部分核 酸分子的所述序列 ； (b) 对于至少 3 个所述部分核酸分子，提供所述部分核酸分子的多个变体 ； (c) 将所述变体与没有被改变的任意部分核酸分子在体外组合装配在一起，其中所述 部分核酸分子或其变体在其末端处含有重叠序列，由此所述部分核酸分子和其变体在所 述混合物中的装配将导致所述全核酸分子的多

16、个变体的装配 ；以及 (d) 表达所述全核酸分子的所述变体，以确定所述全核酸分子的所述变体的任何被修 饰性质 ； 其中所述部分核酸分子的所述变体提供由所述部分核酸分子编码的一个或更多个氨 基酸的密码子的简并形式 ；或 其中所述部分核酸分子的所述变体提供影响所述全核酸分子转录或翻译的多个核酸 控制序列 ；或 其中所述部分核酸分子的所述变体提供编码肽或蛋白的结构域或基序的多个区域， 所述肽或蛋白由所述全核酸分子编码 ；或 其中由所述部分核酸分子编码的所述肽或蛋白在代谢途径中一起起作用。 22. 权利要求 19、20 或 21 所述的方法，其中在步骤 (c) 中的所述装配如下进行 (1) 通过这样的

17、方法，所述方法包括 ： (a) 将所述变体以及没有被改变的任意部分核酸分子与非加工 5核酸外切酶 ；以及 与 (b) 单链 DNA 结合蛋白 (SSB)，其促进核酸退火 ；以及与 (c) 非链置换 DNA 聚合酶 ；以及与 (d) 连接酶 接触，其在有效连接所述变体和没有被改变的部分核酸分子以导致所述全核酸分子 的多个变体装配的条件下进行 ；或 (2) 通过体内装配。 23. 权利要求 19-21 中任一项所述的方法，进一步包括装配根据所述体外或体内方法 制备的两个或更多个全核酸分子。 24. 变体 DNA 分子的文库，其由权利要求 10 或 18-21 中任一项所述方法制备。 25. 被修饰

18、 DNA 分子，其由权利要求 10 或 18-21 中任一项所述方法制备。 26. 权利要求 25 所述的被修饰 DNA，其包含至少一个优化的密码子 ；和 / 或 至少一个优化的控制序列 ；和 / 或 至少一个编码优化的蛋白的核苷酸序列 ；和 / 或 至少一个编码优化的途径的序列。 权 利 要 求 书 CN 102016070 A CN 102016080 A1/37 页 6 体外连接和组合装配核酸分子的方法 0001 相关申请的交叉参考 0002 本申请要求 2008 年 2 月 15 日提交的美国申请序列号 61/029,312 ；2008 年 2 月 15 日提交的 U.S.61/064

19、,107 ；2008 年 5 月 12 日提交的 U.S.61/052,614 ；2008 年 9 月 18 日提交的 U.S.61/098,202 ；和 2008 年 12 月 31 日提交的 U.S.61/142,101 的权益。 这些申 请的内容通过引用全部并入本文。 技术领域 0003 本发明涉及体外连接单链和 / 或双链核酸分子的方法，其允许有效地一步装配 多个具有重叠末端序列的核酸分子。 本发明方法在实施系统组合装配核酸序列变体片段 以修饰被连接核酸序列的性质中是特别有用的，核酸序列例如提供密码子使用、控制序 列、基因、途径、染色体、染色体外核酸和基因组的变体的核酸序列。 背景技术

20、 0004 基于循环变温仪的两步法被用来装配部分生殖道枝原体 (M.genitalium) 基因 组，如 Gibson， D.G. 等，“Complete chemical synthesis， assembly， and cloning of a Mycoplasma genitalium genome.”Science(2008)319 ：1215-1220 中所述。 Li，M.Z. 等 .， Nature Meth.(2007)4 ：251-256 描述了另一种方法。 采用 T7 5核酸外切酶和单链 DNA 结合蛋白的单步装配方法公开在PCT公开WO2006/021944中。本发明公开了

21、一步方法， 其促进 DNA 分子在体外的装配。 这些方法采用缺少 3核酸外切酶活性的非热稳定 5 核酸外切酶或在 dNTP 存在的情况下起作用的 3核酸外切酶。 0005 这些新方法在本发明的另外的方面中是特别有用的，其提供系统组合装配以 修饰核酸分子。 用于高通量筛选中的化学化合物装配的组合技术这时已经被充分建 立。 另外，基因改组技术其中编码序列被随机片段化和再退火已经实践了许多 年。 例如，用以创建嵌合基因片段文库的方案描述在 Meyer， M. 等，“Combinatorial Recombination of Gene Fragments to Construct a Library

22、 of Chimeras” Current Protocols in Protein Science(2006)26.2.1-26.2.17 ；McKee， A.E. 等， JBEI 摘要中。 然而，对于组合 方法的系统方法存在需求，其不依赖随机重排或改组以提供优化的核酸序列，例如，具 有优化的编码序列或代谢途径的优化的核酸序列，所述优化的核酸序列可以根据期望的 性质进行选择。 本发明通过提供用以装配多种感兴趣核酸的系统组合方法而满足了该需 求。 0006 用于将各种组分装配到全基因组或最小基因组中的技术已经被创立。 例如， 2007 年 11 月 15 日公布的美国专利公开 2000/026

23、4688 描述了构建合成基因组的方法，其 通过产生和装配包含部分基因组的序列盒进行。 装配核酸的逐步分级方法描述在 2007 年 1月4日公布的美国专利公开2007/004041中。 然而，没有表明系统地使用这些技术来装 配期望的核酸分子。 0007 可以理解的是，基因组的构建不需要包括所有天然存在的组分。 PCT 公开 说 明 书 CN 102016070 A CN 102016080 A2/37 页 7 WO2007/047148 描述了基于生殖道枝原体的最小基因组，其中多达 101 个编码蛋白的基 因可以被省略并且仍保持生存力。 没有表明最小基因组的组分被系统装配为允许形成多 种可选最小

24、基因组的组合文库。 0008 因此，本发明涉及系统方法和其产物，其允许核酸分子的有效和广泛修饰以便 以高通量的方式提供和筛选感兴趣的核酸装配物，并且容易适应机器执行。 在可选的实 施方式中，与在反应管中相对，装配反应可以在固体表面上进行，例如，在使用微观流 体的芯片上 ( 如 Huang，Y. 等，Lab Chip(2007)7 ：24-26 中所显示 )。 0009 用于系统组合装配核酸其代表(表现)变体编码序列、表达系统、途径合成 和最小或较大基因组的技术至少部分采用体外装配技术。 可以采用任何适合的体外 装配技术 ；然而，本发明的方法包括对本领域中已经描述的那些方法的改进。 发明内容 0

25、010 在第一方面，本发明提供连接一组两个或更多个双链 (ds) 或单链 (ss)DNA 分子 的体外方法。 待被连接的邻近 DNA 分子在其末端处含有重叠序列。 两个或更多个 DNA 分子在有效连接所述两个或更多个DNA分子以在一步反应(one-step reaction)中形成第一 装配 dsDNA 分子的条件下在单个容器中在体外与 (a) 分离的非热稳定 5至 3核酸外切 酶其缺少 3核酸外切酶活性，(b) 群集剂，(c) 分离的热稳定非链置换 DNA 聚合酶 (non-strand-displacing DNA polymerase)其具有 3核酸外切酶活性，或所述 DNA 聚 合酶与

26、缺少3核酸外切酶活性的第二DNA聚合酶的混合物，(d)分离的热稳定连接酶， (e)dNTP 的混合物，以及 (f) 适合的缓冲液接触。 0011 在一些实施方式中， (a) 的核酸外切酶是 T5 核酸外切酶并且接触是在等温条件 下进行，和/或(b)的群集剂是PEG，和/或(c)的非链置换DNA聚合酶是PhusionTMDNA 聚合酶或 VENTDNA 聚合酶，和 / 或 (d) 的连接酶是 Taq 连接酶。 0012 在一些实施方式中，所述条件也适于在连接反应后消化任意不成对的、非同源 的、单链 DNA。 待被连接 DNA 分子中至少一些在一个末端包含与任意感兴趣的 DNA 分 子不同源的序列

27、。 任选地，非同源序列包含一个或更多个 PCR 引物的结合区域，和 / 或 与载体序列具有同源性的区域，和 / 或一种或更多种在感兴趣的 DNA 分子中不存在的限 制酶例如罕见切割限制酶的识别位点。 0013 所述方法可以用来将第二组两个或更多个 DNA 分子彼此连接以获得除第一装配 分子之外的第二装配 DNA 分子，并且连接第一和第二装配 DNA 分子以获得第三装配 ds DNA 分子。 该过程可以按需要不断被重复，以获得感兴趣的全核酸序列。 0014 本发明还提供用于进行上述方法的试剂盒，其包含适当量的 ：(a)分离的非热稳 定 5至 3核酸外切酶其缺少 3核酸外切酶活性，(b) 群集剂，

28、(c) 分离的热稳定 非链置换 DNA 聚合酶其具有 3核酸外切酶活性，或所述 DNA 聚合酶与缺少 3核 酸外切酶活性的第二 DNA 聚合酶的混合物，以及 (d) 分离的热稳定连接酶。 例如，所述 试剂盒可以含有 T5 核酸外切酶、PEG、PhusionTM DNA 聚合酶和 Taq 连接酶。 0015 在第二方面，本发明涉及连接一组两个或更多个双链 (ds) 或单链 (ss)DNA 分子 的可选的体外方法，其中待被连接的邻近DNA分子在其末端处含有重叠序列。 所述方法 包括将两个或更多个 DNA 分子在有效连接所述两个或更多个 DNA 分子以在一步循环变 说 明 书 CN 10201607

29、0 A CN 102016080 A3/37 页 8 温反应 (one-step thermocycled reaction) 中形成第一装配 dsDNA 分子的条件下在单个容器 中在体外与 (a) 分离的非热稳定 3至 5核酸外切酶其在 dNTPs 存在的情况下有活 性，(b) 群集剂，(c) 分离的热激活 (heat-activated)DNA 聚合酶，(d) 分离的热稳定连接 酶，(e)dNTPs 的混合物，以及 (f) 适合的缓冲液接触。 0016 在该方面的一个实施方式中， (a) 核酸外切酶是核酸外切酶 III，和 / 或 (c) 的 聚合酶通过去除以热敏方式与所述聚合酶结合的失活

30、部分而被热激活，和/或(b)的群集 剂是 PEG，和 / 或 (d) 的连接酶是 Taq 连接酶。 (c) 的 DNA 聚合酶可以是 AMPLITAQ GOLD 。 0017 该方法也可以用来获得能与第一装配组结合的第二装配组的DNA分子。 循环变 温一步方法和上述等温方法的任意组合可以用于多个组的 DNA 分子的装配并且两者中任 意一种均可以用于装配组中较大 DNA 分子的后续装配。 0018 上述方法的组分可以作为试剂盒被提供，所述试剂盒在单个容器中包含一定量 的 ：(a)分离的非热稳定3至5核酸外切酶，其在dNTPs存在的情况下有活性，(b)群 集剂，(c) 分离的热激活 DNA 聚合酶

31、，(d) 分离的热稳定连接酶，(e)dNTPs 的混合物， 以及 (f) 适合的缓冲液，所述的量使得当所述两个或更多个 DNA 分子在适合的缓冲溶液 和 dNTPs 存在的情况下被添加到试剂盒和在循环变温条件下温育时，所述两个或更多个 DNA 分子在协同反应 (concerted reaction) 中被装配。 在该方面的一个实施方式中，所述 试剂盒包含 (a) 核酸外切酶 III、(b)PEG、(c)AMPLITAQ GOLDDNA 聚合酶和 (d)Taq 连接酶。 0019 用于第一和第二方面的公开方法中的物质的任意组合可以一起被包装成用于进 行任意一种公开方法的试剂盒。 例如，试剂盒可以

32、包含含有装配 ssDNA 分子 ( 例如，寡 核苷酸 ) 或 dsDNA 分子所需的所有试剂的混合物。 0020 在第三方面，本发明提供修饰全核酸分子的性质的方法。 该方法包括 ：(a) 将 所述全核酸分子的核酸序列沿其长度代表性地分成多个部分，从而鉴定部分核酸分子的 序列 ；(b) 对于至少 3 个所述部分核酸分子提供每个部分核酸分子的多个变体 ；(c) 将所 述变体与没有被改变的任意部分核酸分子在体外组合装配在一起，其中所述部分核酸分 子或其变体在其末端处含有重叠序列，由此所述部分核酸分子和其变体在混合物中的装 配将导致全核酸分子的多个变体的装配 ；以及 (d) 表达全核酸分子的变体，以确

33、定所述 全核酸分子的所述变体的任意被修饰性质。 0021 步骤 (c) 的装配可以通过上述方法中任一种进行尽管也可以使用可选的连 接方法。 例如，可以使用多步体外方法，或者可以使用体内方法，诸如 PCT 申请 PCT/ US2008/079109 中所描述的那些方法。 尽管体外装配方法一般对于寡核苷酸更加方便， 但是体内装配方法也可以是可使用的替代物。 0022 一种可以应用的装配方法包括如下步骤 ：(a)将所述变体以及没有被改变的任意 部分核酸分子与非加工 5核酸外切酶 ；以及与 (b) 促进核酸退火的单链 DNA 结合蛋白 (SSB) ；以及与 (c) 非链置换 DNA 聚合酶 ；以及与

34、(d) 连接酶接触，其在有效连接变体 和没有被改变的部分核酸分子以导致全核酸分子的多个变体装配的条件下进行。 0023 在一个实施方式中，该方面包括将全核酸分子的核酸序列分成至少 5 个部分， 所述至少 5 个部分可以使用本发明的体外方法被有利地装配。 在其它实施方式中，部分 说 明 书 CN 102016070 A CN 102016080 A4/37 页 9 核酸分子变体提供由部分核酸分子编码的一个或更多个氨基酸的密码子的简并形式。 可 选地，部分核酸分子的变体提供多个核酸控制序列，其影响全核酸分子的转录和翻译。 作为另一选择，部分核酸分子的变体提供编码由全核酸分子编码的肽或蛋白的结构域或

35、 基序的多个区域。 作为又一选择，由所述部分核酸分子编码的肽或蛋白在代谢途径中一 起起作用。 0024 上述各种重组方法可以用来构建任何期望的装配物，诸如质粒、载体、基因、 代谢途径、最小基因组、部分基因组、基因组、染色体、染色体外核酸，例如细胞质的 细胞器，诸如线粒体 ( 动物 )，和叶绿体和质体 ( 植物 )，等等。 对于大 DNA 分子的装 配，最终步骤可以在体内进行，其中酵母是优选的宿主。 装配步骤的体外和体内操作之 间的平衡由与被装配的 DNA 分子的性质有关的方法的实用性确定。 0025 本发明进一步包括由上述方法获得的DNA分子文库，和使用被修饰的整个DNA 分子的方法。 文库其

36、含有2个或更多个变体，但通常是多个变体，如20、100、1000 或更多个可以被筛选，以获得具有期望特征，如期望产物的高水平产生、产物的功 能提高、或功能降低 ( 如果是有利的 ) 的成员。 这类筛选可以通过高通量方法进行，其 可以是机器操作的 / 自动化的。 0026 本发明还进一步包括由本发明方法制备的产物，例如所得到的装配合成基因或 基因组和被修饰的优化基因和基因组，以及其应用和产品。 0027 本发明的重组方法具有很广泛的应用，其可以例如设计有用产物的合成途径， 所述有用产物包括药物、生物燃料、诊断剂 (diagnostics)、兽医产品、农业化学品、生长 因子等等 - 即，可以在细胞

37、培养物中或在转基因动物或植物中装配的任意分子。 作为简 单的实例，大肠杆菌 (E.coli) 的乙酸途径可以被改造成产生生物燃料，如乙醇、丁醇等 等。 有关次级代谢物如聚酮化合物的合成途径的酶也可以使用本发明的方法进行优化。 因此，由本发明的系统组合方法得到的 DNA 分子可以用于广泛的背景中，以产生有用的 产物。 附图说明 0028 图 1A 是使用 T4 聚合酶的两步循环变温 ( 热循环 ) 体外装配的示意图。 0029 图 1B 显示了使用图 1A 中所示的方法在 5 PEG-8000 存在 (+) 或不存在 (-) 的 情况下实施的8个核酸片段的装配结果，每个核酸片段均在5.3kb至6

38、.5kb之间并具有240 至 360bp 重叠序列。 0030 图1C显示了使用图1A中所示的方法在PEG-8000存在的情况下4个核酸片段的 装配结果，每个核酸片段为 5kb 并具有 40bp 重叠序列。 0031 图 1D 显示了由 2 个四分之一基因组片段装配生殖道枝原体二分之一基因组 (310kb) 的结果，所述基因组片段为 144kb and 166kb 并具有 257bp 重叠序列。 0032 图 1E 显示了由 4 个四分之一基因组片段装配全合成生殖道枝原体基因组的结 果，所述基因组片段均为 150kb 并具有 80 至 257bp 重叠序列。 0033 图 2A 是用于分析修复

39、装配反应成功策略的示意图。 在甲酰胺 (+F) 存在的情况 下 dsDNA 被变性成 ssDNA，并且如果发生修复，ssDNA 保持较高分子量不变。 0034 图 2B 显示了用于分析使用图 1A 中所示方法装配的产物的图 2A 方法的结果。 说 明 书 CN 102016070 A CN 102016080 A5/37 页 10 0035 图3显示了连接4个DNA片段的修复装配产物滚环扩增(RCA)的结果，其显示 仅修复装配产物被扩增。 0036 图 4A 是使用核酸外切酶 III 的一步循环变温体外装配示意图。 0037 图 4B 显示了使用图 4A 中所示方法的 4 个不同核酸片段的 2

40、 个装配物的结果， 所述 4 个不同核酸片段每个均为 5kb 并具有 300bp 或 40bp 重叠序列。 0038 图 4C 显示了图 2A 中所示的那对装配产物修复的分析结果。 0039 图 5A 是使用 T5 核酸外切酶的一步等温体外装配的示意图。 0040 图 5B 显示了使用图 5A 中所示方法装配 2 个核酸片段的结果，所述 2 个核酸片 段为 4,024bp 和 2,901bp，具有 450bp 重叠序列并掺入 NotI 限制酶序列。 0041 图 5C 显示了图 5B 中所示产物的 Not I 消化结果。 0042 图 5D 显示了使用图 5A 中所示方法将 3 个每个为 5k

41、b 的核酸片段与 8kb 具 有 40bp 重叠序列的载体序列装配在一起的结果。 0043 图 5E 显示了 DNA 的代表性结果，所述 DNA 由转化有图 5D 中所示装配产物的 大肠杆菌纯化得到并且用 Not I 进行消化以从载体释放装配片段。 0044 图 6A-6D 显示了图 1A(T4 聚合酶 )、图 4A( 核酸外切酶 III) 和图 5A(T5 核酸外 切酶 ) 所示方法的直接比较结果。 0045 图 6A 显示了使用上述各种装配方法将 5.9kb 至 6.2kb 具有 80bp 重叠序列的 4 个 核酸片段与 8kb 具有 80bp 重叠序列的载体装配在一起的结果。 0046

42、图 6B 显示了 DNA 的代表性结果，所述 DNA 由转化有图 6A 中所示装配产物的 大肠杆菌纯化得到并且用 NotI 进行消化以从载体释放装配片段。 0047 图 6C 显示了使用上述各种装配方法将生殖道枝原体的 2 个四分之一基因组与 8kb 具有 80bp 重叠序列的载体装配在一起的结果。 0048 图 6D 显示了 DNA 的代表性结果，所述 DNA 由转化有图 6C 中所示装配产物的 大肠杆菌纯化得到并且用 NotI 进行消化以从载体释放装配片段。 0049 图 7A 示意性说明了密码子优化在创建装配片段组合文库中的应用。 0050 图 7B 示意性说明了多种基序和结构域变体在创

43、建基因组合文库中的应用。 0051 图 7C 示意性说明了变体基因在创建代谢途径组合文库中的应用。 0052 图 8A 是乙酸利用途径的示意图。 0053 图8B示意性说明了来自5个生物体的变体基因与4个控制序列一起在创建图8A 所示乙酸利用途径组合文库中的应用。 0054 图 8C 示意性说明了图 8B 中所示核酸片段的装配策略。 0055 图 8D 显示了图 8C 中所示的示例性乙酸利用途径的装配结果，其显示通过限制 酶消化由载体释放的装配产物。 0056 图 9A-9F 显示了使用图 5A 中所示方法 (T5 核酸外切酶 ) 连续装配全小鼠线粒体 基因组。 0057 图9A显示了在15个

44、涵盖整个小鼠线粒体基因组的反应中装配5个300bp片段的 结果。 0058 图 9B 显示了图 9A 所示反应产物的扩增结果。 0059 图 9C 显示了在 3 个涵盖整个小鼠线粒体基因组的反应中装配 5 个图 9A 中所示 说 明 书 CN 102016070 A CN 102016080 A6/37 页 11 1,180bp 反应产物的结果。 0060 图 9D 显示了图 9C 中所示反应产物的扩增结果。 0061 图 9E 显示了在载体构建物中由 3 个图 9C 中所示 5,560bp 反应产物最终装配整个 小鼠线粒体基因组的结果。 0062 图9F显示了在去除载体序列和再环化之后最终装

45、配图9F中所示整个小鼠线粒体 基因组产物的结果。 具体实施方式 0063 定义 0064 如本文所用，单数形式 “一个 (a)”、“一个 (an)” 和 “所述 (the)” 包括复 数指示物，除非上下文另外清楚地指明。 0065 如本文所用，术语 “约” 指加或减 20。 因此，“约” 30 分钟包括 24-30 分 钟。 当指核酸的长度、温度等时，“约” 也指的是加或减 20。 如本文所用，范围的 端点包括在该范围内。 当加或减 20导致不可分割单元如核苷酸的非整数值时，技术人 员将了解，其应当将该值四舍五入成最近的整数。 例如，约 8 个核苷酸并不是 6.4 至 9.6 个核苷酸，而应当

46、被解释为 6 至 10 个核苷酸。 0066 术语“活性温度” 指的是这样的温度 ：在该温度以上，DNA 聚合酶比核酸外切 酶 ( 即，核酸外切酶 III) 明显更加有活性，以便核酸外切酶 ( 即，核酸外切酶 III) 最初产 生的单链突出端的长度净减少。 0067 在本发明的 “体外” 实施的那些方法中，所有蛋白组分均被分离和 / 或基本上 纯化。 体外装配反应无法在活细胞中或用粗细胞提取物实施 ；所述反应在无细胞的环境 中实施。 0068 通过本发明的方法进行DNA分子的“连接(joining)”在本文中有时被称为DNA 分子的 “重组” 或 “装配”。 0069 根据本发明，基因水平上的

47、优化通过不连续组分 (discrete components) 的设计以 系统化方式来实现。 在所有上述组合的水平上这是真实的。 本发明方法从而避免了现有 技术方法的随机性 (random nature)。 0070 核苷酸装配的方法 0071 简要地，当待被连接 DNA 分子为双链时，优选的方法包括将所述 DNA 分子 与如下温育 ：(a) 核酸外切酶 ( 例如，非加工核酸外切酶 )，其 “嚼回 ( 回嚼，咀嚼 chews-back)”双链 DNA 分子的末端，以暴露包含重叠区域的单链突出端 ；(b) 群集剂， 如 PEG，其促进核酸退火以及发挥其它功能，以便单链突出端被特异性地退火 ( 杂

48、交 ) ； (c)非链置换DNA聚合酶，其通过延伸被退火区域的3末端而填补被退火分子中剩余的 单链缺口 ；以及 (d) 热稳定连接酶，其封闭 ( 连接 ) 所形成的切口。 对于单链分子，(a) 的核酸外切酶可以但不必被省略。 0072 当待被连接DNA分子是单链时，单链DNA分子(例如，约40-60个碱基的寡核 苷酸，在本文中也被称为核苷酸或 nt) 经由其末端处具有同一性的序列 ( 例如，约 20 个 碱基 ) 进行退火，以形成带缺口的分子。 核酸外切酶活性可以对这些带缺口的分子起作 用，以增加缺口的大小。 带缺口的分子然后用上述聚合酶和连接酶进行修复，以形成双 说 明 书 CN 10201

49、6070 A CN 102016080 A7/37 页 12 链分子。 0073 本发明新型的一步方法可以用来同时连接大量DNA分子。 为了实现它，待被连 接DNA分子被设计以便对于每对待被连接DNA分子在其末端处含有重叠序列-即，一个 DNA分子的远端区域包含与另一DNA分子的近端区域具有独特序列同源性(例如，同一 性 ) 区域。 远端和近端是针对分子链一端处随意的参照点而言，例如，对于参照物 X， 0074 0075 A 表示近端区域以及 B 表示远端区域。 为了促进 DNA 分子以预先确定的方向 和顺序连接，每组序列同一性的远端和近端区域被选择 ( 设计 ) 成独特的 ( 以不同于另一 对 DNA 分子的序列同一性区域 )。 所述方法允许许多 DNA 分子在单个反应混合物中和 在单个容器中被连接。 明显的是，同源性区域在一些情况下是互补的。 术语“序列同一 性区域” 既包括相同的序列又包括互补的序列。 0076 在本发明的方法中，一对待被连接 ds DNA 分子其中一个的远端区域与另一 dsDNA 分子的近端区域共享序列同源性 ( 例如，序列同一性 ) 区域。 如本文所用，术语 “远端” 指待被连接的一对中第一 DNA 分子的 3端 (5 - 大部分 DNA 分子 )，以及 术语 “近端” 指这对中第二 DNA 分子的 5端。 同源性区域在