一株产甘露醇布氏乳杆菌及发酵产甘露醇的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 103184180 A (43)申请公布日 2013.07.03 CN 103184180 A *CN103184180A* (21)申请号 201310111633.5 (22)申请日 2013.04.01 CGMCC NO. 7300 2013.03.13 C12N 1/20(2006.01) C12P 7/18(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发 区第 13 大街 29 号 (72)发明人 路福平 李玉 陈艳 王洪彬 王正祥 (74)专利代理机构 天津盛理知识产权

2、代理有限 公司 12209 代理人 赵瑶瑶 (54) 发明名称 一株产甘露醇布氏乳杆菌及发酵产甘露醇的 方法 (57) 摘要 本发明涉及一株产甘露醇布氏乳杆菌， 名 称为布氏乳杆菌 Y-4， 其分类命名为布氏乳杆菌 （Lactobacillus buchneri） ， 保藏编号为 CGMCC NO.7300， 保藏日期 ： 2013 年 3 月 13 日， 其特点是 以东北酸菜为原料， 采取富集培养、 初筛、 复筛等 方法进行筛选和纯化获得， 根据生理生化特征及 16SrDNA 序列分析， 确定该菌株为新种， 本发明得 到的菌株生长性能稳定， 温度 30和 pH 值为 5.0 时甘露醇产量最高

3、， 具有良好的研究和应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103184180 A CN 103184180 A *CN103184180A* 1/1 页 2 1. 一株产甘露醇布氏乳杆菌， 其特征在于 ： 名称为布氏乳杆菌 Y-4， 其分类命名为布氏 乳杆菌 （Lactobacillus buchneri） ， 保藏编号为 CGMCC NO. 7300， 保藏日期 ： 201

4、3 年 3 月 13 日， 保藏地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心。 2. 根据权利要求 1 所述的产甘露醇布氏乳杆菌， 其特征在于 ： 所述菌株的生理生化特 征如下 ： + 代表阳性 ： 3. 一种如权利要求 1 所述的产甘露醇布氏乳杆菌发酵产甘露醇的方法， 其特征在于 ： 步骤如下 ： 布氏乳杆菌 Y-4 经活化后在发酵培养基中培养， 条件为 ： 温度为 25-35、 pH 5.0、 接种量为 8-15wt%、 静置条件下发酵 40-50h。 4. 根据权利要求 3 所述的产甘露醇布氏乳杆菌发酵产甘露醇的方法，

5、其特征在于 ： 所 述发酵培养基为 ： 将果糖按 2-5% 的比例添加到 MRS 液体培养基。 权 利 要 求 书 CN 103184180 A 2 1/5 页 3 一株产甘露醇布氏乳杆菌及发酵产甘露醇的方法 技术领域 0001 本发明属于微生物领域， 涉及菌种的筛选， 尤其是一株产甘露醇布氏乳杆菌及发 酵产甘露醇的方法。 背景技术 0002 甘露醇 （Mannitol） 又名甘露糖醇、 木蜜醇， 是一种六元醇， 为山梨醇的同分异构 体。纯净的甘露醇为无色至白色针状或为斜方柱状晶体或晶体性粉末， 无臭， 具有清凉甜 味， 是多元糖醇中唯一的一种不具吸湿性的晶体， 广泛应用于食品、 医药、 轻工

6、和化工领域。 0003 目前， 应用较为广泛的制备甘露醇方法为化学合成法， 是以蔗糖、 淀粉或葡萄糖为 原料通过催化加氢制备得到。甘露醇的氢化作用一般需要在高压高温、 金属催化和通氢气 的条件下进行， 具有原料来源稳定， 生产期限不受限制， 成本低， 适合于大规模生产等特点， 但是其产率较低， 且有山梨醇伴生， 造成后面的分离纯化成本较高的问题。另一种方法是 天然物提取， 目前主要采用重结晶或者电渗析脱盐法从海藻、 海带中提取甘露醇， 该方法可 得到单一的甘露醇， 精制纯度高， 但收率低、 精制工序繁琐、 生产成本高、 原料来源受地区限 制。 0004 自然界中能合成甘露醇的微生物种类较多，

7、细菌、 酵母和霉菌中都有一些菌株具 有产甘露醇的能力。 微生物发酵生产甘露醇， 具有反应选择性高、 温和、 能耗低、 设备投资小 的优点， 但高产甘露醇菌株尚未得到， 近年来， 国内外都在对微生物发酵制备甘露醇的技术 进行研究。2002 年 Niklas von Weymarn 等人利用异型乳酸菌 Lactobacillus fermentum 发酵生产甘露醇， 袁其朋等人用发酵乳杆菌转化甘露醇。 目前， 对布氏乳杆菌产甘露醇的相 关报道较少。 0005 甘露醇在国内外已成功应用于食品工业、 医药工业、 化工行业， 并取得了很好的经 济效益， 在我国， 对于微生物法生产甘露醇的研究刚刚起步，

8、并没有取得很大的成就， 造成 这种情况的主要原因是培养条件并非最优和菌株的种类， 其主要的原因是原始菌株种类和 数量的限制。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一株产甘露醇布氏乳杆菌， 该菌株在中国普通微生物菌种保 藏管理中心保藏， 保藏编号为 CGMCC NO. 7300， 本菌株的甘露醇的产率为 64.82%。 0007 本发明的另一目的是提供产甘露醇布氏乳杆菌发酵产甘露醇的方法。 0008 本发明实现目的的技术方案如下 ： 0009 一株产甘露醇布氏乳杆菌， 名称为布氏乳杆菌 Y-4， 其分类命名为布氏乳杆菌 （Lactobacillus buchneri） ， 保藏编号为CGMCC

9、 NO. 7300， 保藏日期 ： 2013年3月13日， 保 藏地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心。 0010 而且， 所述菌株的生理生化特征如下 ： + 代表阳性 ： 说 明 书 CN 103184180 A 3 2/5 页 4 0011 0012 。 0013 一种产甘露醇布氏乳杆菌发酵产甘露醇的方法， 步骤如下 ： 布氏乳杆菌 Y-4 经活 化后在发酵培养基中培养， 条件为 ： 温度为 25-35、 pH 5.0、 接种量为 8-15wt%、 静置条件 下发酵 40-50h。 0014 而且， 所述发酵培养基

10、为 ： 将果糖按 2-5% 的比例添加到 MRS 液体培养基。 0015 本发明的优点和积极效果是 ： 0016 1、 本发明获得的菌株根据 伯杰氏细菌鉴定手册 第 9 版描述， 并做 16S rDNA 序 列对比分析， 确定该菌株属于布氏乳杆菌， 目前我国关于布氏乳杆菌的研究较少， 因此本申 请筛选的菌种在一定程度上为我国的细菌菌种资源做出贡献， 本发明筛选得到的布氏乳杆 菌菌株在理论研究中具有极其重要的价值， 对推动甘露醇工业生产有很好的实施前景。 0017 2、 本发明筛选的微生物转化制备甘露醇 ： 在温度为 30、 pH 5.0、 装液量为 50mL、 接种量为 10%、 静置条件下发

11、酵 48h， 按 HPLC 法测定发酵液中甘露醇的含量， 并计算其转化 率， 分析测定转化率， 转化率为 64.82%。 附图说明 ： 0018 图 1 为菌株 CGMCC NO. 7300 的菌落图 ； 0019 图 2 为菌株 CGMCC NO. 7300 的菌体图 ； 0020 图 3 为本发明甘露醇标品的高效液相色谱图 ； 0021 图 4 为本发明利用布氏乳杆菌转化发酵得到产物甘露醇的高效液相色谱图。 具体实施方式 0022 下面结合实施例， 对本发明进一步说明， 下述实施例是说明性的， 不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 0023 一、 原料的确定 说 明 书

12、 CN 103184180 A 4 3/5 页 5 0024 原料取自东北家庭自制酸菜， 以溴甲酚绿为显色剂， 配以 MRS 培养基配方形成初 筛培养基， 利用乳酸菌发酵葡萄糖产酸， 溴甲酚绿遇酸显示黄色， 筛选出乳酸菌， 再以果糖 为底物， 进行发酵生成产物， 通过高效液相色谱法判断是否存在产甘露醇乳酸菌菌株， 工艺 为 ： 0025 （1） 菌种初筛 ： 酸菜汁经预处理后取 1mL 至盛有 （25mL/250mL） 富集培养基中培养， 30， 静置培养 48h ； 0026 富集培养基 （g/100mL） ： 蛋白胨 1.0， 牛肉膏 1.0， 酵母提取物 0.5， K2HPO4 0.2，

13、 柠 檬酸二铵 0.2， 乙酸钠 0.5， 葡萄糖 2.0， MgSO47H2O 0.058， MnSO44H2O 0.019， 抗败血 酸 0.05 ； 115灭菌 20min ； 0027 保藏培养基 ： MRS 琼脂斜面固体培养基 ； 0028 初筛培养基 （g/100mL） ： MRS 中加入溴甲酚绿显示剂， 30， 静置培养 48h ； 0029 经过初筛 （含有溴甲酚绿的MRS平板） ， 有八株菌株在初筛平板中有黄色显色圈， 说 明这八株菌能够产生乳酸， 将这 8 株菌命名为 Y-1， Y-2， Y-3， Y-4， Y-5， Y-6， Y-7， Y-8 ； 0030 （2） 菌种复

14、筛 ： 初筛获得的菌种以果糖作为底物发酵， 利用高效液相色谱法测定是 否产甘露醇。 0031 种子培养基 （g/100mL） ： MRS 液体培养基 ； 0032 液体发酵培养基 （g/100mL） ： 蛋白胨 1.0， 牛肉膏 1.0， 酵母提取物 0.5， K2HPO4 0.2， 柠檬酸二铵 0.2， 乙酸钠 0.5， 葡萄糖 2.0， MgSO47H2O 0.058， MnSO44H2O 0.019， 抗 败血酸 0.05， 果糖 2 ； 115灭菌 20min ； 0033 测得只有 Y-4 产甘露醇， 其含量为 26.34g/L。 0034 二、 菌种的筛选和鉴定 0035 1. 产

15、甘露醇乳酸菌的筛选 0036 （1） 取酸菜加适量灭菌水混匀后， 取 1mL 悬浮液放入盛有 9mL 无菌水的试管中， 吹 吸三次， 并振摇使之充分混匀， 取 1mL 至盛有 （25mL/250mL） 富集培养基中培养， 30， 静置 培养 48h。 0037 （2） 将富集培养液经梯度稀释后， 选择合适的稀释度稀释液涂布于初筛平板上， 30静置培养48h， 取出。 挑选出有黄色显色圈的菌落转接MRS平板纯化， 将单菌落接至MRS 斜面培养基。 0038 （3） 选用生长正常的斜面， 接入液态发酵培养基， 30， 静置培养 48h。 0039 （4） 用移液枪吸取 1mL 样品 （枪头剪口）

16、于 EP 管中， 12000 转 / 分离心 1min， 去上 清液， 利用高效液相色谱法法检测是否产甘露醇。 0040 2. 菌种的鉴定 0041 菌落形态观察 ： 将斜面菌点接至有 MRS 培养基的平皿中， 于 30静置培养 48h， 观察菌落形态。 0042 菌体形态观察 ： 利用细菌革兰氏染色方法进行染色， 油镜下观察菌株的个体形 态。 0043 形态特征 ： 菌落形态呈圆形， 乳白色， 较光滑， 凸起， 边缘整齐， 不透明 ； 菌体为 短杆状， 长度 0.20.8m， 革兰氏染色阳性， 无鞭毛， 不运动， 不形成芽孢。 0044 生理生化特征 说 明 书 CN 103184180 A

17、 5 4/5 页 6 0045 0046 注 ：（+） 代表阳性 0047 菌株的 16S rDNA 鉴定 ： 0048 a. 基因组 DNA 的提取， 本实验的引物采用 16S rDNA 通用引物。 0049 上游引物 ： AGAGTTTGATCCTGGCTCA 0050 下游引物 ： GGTTACCTTGTTACGACTT 0051 b. 采用 50L 的 PCR 扩增体系 ： 0052 0053 c. 用于扩增目的基因的 PCR 条件 ： 0054 0055 通过将16S rDNA序列的扩增后进行琼脂糖凝胶电泳， 得到其大小为1500bp左右， 说 明 书 CN 103184180 A

18、6 5/5 页 7 符合使用细菌 16S rDNA 引物的预期扩增结果。最终选取最好的条带进行回收， 将回收的 DNA 送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。通过 Nucleotide BLAST 分析， 与布氏 乳杆菌菌株的 16S rDNA 序列同源性为 99% 以上， 可初步确定 Y-4 菌株为布氏乳杆菌。 0056 筛选出的布氏乳杆菌菌种的保藏信息如下 ： 名称为布氏乳杆菌 Y-4， 其分类命名 为布氏乳杆菌 Lactobacillus buchneri， 保藏编号为 CGMCC NO. 7300， 保藏日期 ： 2013 年 3 月 13 日， 保藏地址为 ： 北京市朝阳区北辰西

19、路 1 号院 3 号， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心。 0057 3. 产物鉴定及转化率的测定分析 0058 取发酵液样品 1mL 于 EP 管中， 12000r/min 离心 1min， HPLC 法检测发酵液中甘露 醇含量， 根据果糖消耗量， 计算出甘露醇相对果糖的转化率。 0059 色谱条件 ： TSK-GEL Amide-80 Series 色谱柱 (4.6mm100mm， 5.0m)， 乙腈、 去 离子水超声15min脱气， 流动相乙腈 ： 水=90 ： 10 ； 检测器为视差检测器 ； 流速1mL/min ； 柱温 为 80 ； 进样量 20L。 00

20、60 精密称取甘露醇 1.00mg 置于 1.5mL 的 EP 管中， 加去离子水 1mL 溶解， 精确吸取 20、 40、 60、 80、 100L 的对照品溶液到 1.5mL 的 EP 管中， 并用去离子水稀释至 100L， 然后 吸取 20L 进行测定。以峰面积 （Y） 对含量 （X） 做回归计算。结果表明， 在 0.21mg/mL 范 围内， 甘露醇有良好的线性关系， 回归方程为 ： Y=328211X+14051， R2=0.9966。 0061 精密称取果糖 1.00mg 置于 1.5mL 的 EP 管中， 加去离子水 1mL 溶解， 精确吸取 20、 40、 60、 80、 10

21、0L 的对照品溶液到 1.5mL 的 EP 管中， 并用去离子水稀释至 100L， 然后吸 取 20L 进行测定。以峰面积 （Y） 对含量 （X） 做回归计算。结果表明， 在 0.21mg/mL 范围 内， 果糖有良好的线性关系， 回归方程为 ： Y=252110X-11170， R2=0.9992。 0062 三、 利用布氏乳杆菌 Y-4 转化发酵制备甘露醇的方法， 步骤如下 ： 0063 培养基的配置 ： 斜面培养基 （MRS)（1000mL） ： 蛋白胨 10.0g， 牛肉膏 10.0g， 酵 母提取物 5.0g， K2HPO4 2.0g， 柠檬酸二铵 2.0g， 乙酸钠 5.0g， 葡

22、萄糖 20.0g， MgSO47H2O 0.58g， MnSO44H2O 0.19g， 吐温 -80.0 mL， 琼脂 20g， 溶化后分装， 115灭菌， 15 min ； 摇瓶 发酵培养基 ： 将果糖铵 2% 的比例添加到 MRS 液体培养基， 115灭菌， 15min ； 0064 种子制备 ： 将保存的布氏乳杆菌 Y-4 接种于斜面培养基上， 置 30恒温箱培养 48h， 获得母斜面， 选用生长正常斜面， 接入摇瓶发酵培养基 ； 0065 微生物转化制备甘露醇 ： 在温度为 30、 pH 5.0、 装液量为 50mL、 接种量为 10%、 静置条件下发酵48h， 按HPLC法测定发酵液中甘露醇的含量， 并计算其转化率。 分析测定转 化率， 转化率为 64.82%。 说 明 书 CN 103184180 A 7 1/1 页 8 0001 序 列 表 CN 103184180 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103184180 A 9 2/2 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103184180 A 10