多发性骨髓瘤生物标志物的诊治产品.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610601438.4 (22)申请日 2016.07.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106191283 A (43)申请公布日 2016.12.07 (73)专利权人 固安博健生物技术有限公司 地址 065500 河北省固安县肽谷生物医药 基地 (72)发明人 杨承刚宋宏涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) A61K 45/00(200

2、6.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 Sara Olson et al.Graveley Lab shRNA knockdown followed by RNA-seq Biosample Preparation and Characterization Document. and_Hiv/71892361-Graveley-lab-shrna- knockdown-followed-by-rna-seq-biosample- preparation-and-characterization- document.html .2016,第1、 7-8、 10页.

3、N. Konstantakopoulos et al.Changes in Gene Expressions Elicited by Physiological Concentrations of Genistein on Human Endometrial Cancer Cells. MOLECULAR CARCINOGENESIS .2006,752763 页. Mary C.Wallingford et al.Identification of a novel isoform of the leukemia-associated MLLT1 (ENL/LTG19) protein. Ge

4、ne Expression Patterns .2014, 第13-14页. Eva Bandres et al.Gene expression profile induced by BCNU in human glioma cell lines with differential MGMT expression. Journal of Neuro-Oncology .2005,第191页. 审查员 苏保卫 (54)发明名称 多发性骨髓瘤生物标志物的诊治产品 (57)摘要 本发明公开了GTF2F1基因及其表达产物可 以作为多发性骨髓瘤诊治的分子标志物。 通过检 测受试者骨髓组织中GTF2F1基

5、因及其表达产物 的含量可以判断受试者是否患有多发性骨髓瘤 或者诊断受试者是否存在患有多发性骨髓瘤的 风险。 本发明通过研究体外培养的多发性骨髓瘤 细胞的增殖、 凋亡、 迁移、 侵袭情况发现抑制 GTF2F1基因表达可以抑制细胞增殖、 促进细胞凋 亡、 抑制细胞迁移， 上述研究结果表明GTF2F1基 因及其表达产物是治疗多发性骨髓瘤的一个潜 在的药物靶点。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图2页 CN 106191283 B 2018.09.25 CN 106191283 B 1.特异性检测GTF2F1基因或GTF2F1蛋白的产品在制备诊断多发性骨髓瘤或预测多发 性骨髓瘤预后的工具中

6、的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述特异性检测GTF2F1基因或GTF2F1蛋白 的产品包括特异性检测GTF2F1基因或GTF2F1蛋白的表达水平的产品。 3.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征在于， 所述产品包括能够特异性结合GTF2F1 基因的核酸或者能够特异性结合GTF2F1蛋白的物质； 所述核酸能够特异性检测GTF2F1基因 的表达水平； 所述物质能够特异性检测GTF2F1蛋白的表达水平。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增GTF2F1基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。 5.

7、根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述工具包括能够特异性检测GTF2F1基因 或GTF2F1蛋白的表达水平的工具。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述工具包括能够特异性结合GTF2F1基因 的核酸或者能够特异性结合GTF2F1蛋白的物质； 所述核酸能够特异性检测GTF2F1基因的表 达水平； 所述物质能够特异性检测GTF2F1蛋白的表达水平。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增GTF2F1基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。 8.GTF2F1基因或GTF2F1蛋白的抑制剂在制备治疗多发性骨

8、髓瘤的药物中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述抑制剂能够抑制GTF2F1的表达或活 性。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106191283 B 2 多发性骨髓瘤生物标志物的诊治产品 技术领域 0001 本发明涉及肿瘤诊断、 治疗、 预测预后领域， 更具体地， 本发明涉及以检测GTF2F1 异常为手段的肿瘤诊断、 预测预后方法； 及抑制GTF2F1基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。 背景技术 0002 多发性骨髓瘤(multiple myeloma， MM)是以骨髓中单克隆性浆细胞增生异常和聚 集为特征的恶性肿瘤， 多见于60岁以上的老年人。 目前， 多发性骨髓瘤在我国的发

9、病率约为 十万分之一到十万分之二， 位居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位。 随着人口老龄化的加 速， 我国多发性骨髓瘤的发病率将呈上升趋势。 目前人们对多发性骨髓瘤的发病机制还不 清楚， 已有的研究结果显示主要与遗传学改变和细胞因子的作用两方面有关， 但至今没有 明确的答案。 高通量测序技术的快速发展和应用， 为多发性骨髓瘤发病机理的研究提供了 更加全面和快速的分析手段， 也为多发性骨髓瘤的进一步治疗方案提供崭新思路。 发明内容 0003 本发明的目的之一在于提供一种通过检测GTF2F1基因或蛋白表达差异来诊断多 发性骨髓瘤的方法。 0004 本发明的目的之二在于提供一种通过检测GTF2F1基因

10、或蛋白表达差异来预测多 发性骨髓瘤预后的方法。 0005 本发明的目的之三在于提供一种通过抑制GTF2F1基因或GTF2F1蛋白来治疗多发 性骨髓瘤的方法。 0006 本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗多发性骨髓瘤的药物的方法。 0007 本发明的目的之五在于提供一种用于治疗多发性骨髓瘤的药物。 0008 为了实现上述目的， 本发明采用了如下技术方案： 0009 本发明提供了检测GTF2F1基因或GTF2F1蛋白的产品在制备多发性骨髓瘤诊断工 具中的用途。 0010 本发明还提供了检测GTF2F1基因或GTF2F1蛋白的产品在制备预测多发性骨髓瘤 预后工具中的用途。 0011 进一步，

11、所述检测GTF2F1基因或GTF2F1蛋白的产品包括检测GTF2F1基因或GTF2F1 蛋白的表达水平的产品。 所述产品包括能够结合GTF2F1基因的核酸或者能够结合GTF2F1蛋 白的物质(例如抗体)。 所述核酸能够检测GTF2F1基因的表达水平； 所述物质能够检测 GTF2F1蛋白的表达水平。 0012 本发明的检测GTF2F1基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能： 如PCR、 如Southern杂交、 Northern杂交、 点杂交、 荧光原位杂交(FISH)、 DNA微阵列、 ASO法、 高通量测序平台等。 使用该产品可以定性地、 定量地、 或半定量地实施分析。 0013

12、 包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得， 或通过从生物材料制备含有 期望核酸的基因， 然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。 说明书 1/11 页 3 CN 106191283 B 3 0014 进一步， 所述PCR方法为已知方法， 例如， ARMS(Amplification Refractory Mutation System， 扩增不应突变系统)法、 RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、 嵌套PCR法等等。 扩增 的核酸可以通过使用点印迹杂交法、 表面等离子共振法(SPR法)、 PCR-RFLP法、 原位RT-PCR 法、 PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、 PC

13、R-SSP法、 AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、 MVR-PCR法、 和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。 0015 上面所述的核酸包括扩增GTF2F1基因的引物， 产品中包括的引物可以通过通过化 学合成来制备， 通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计， 并通过 化学合成来制备。 0016 在本发明的具体实施方案中， 所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物， 所述引物 的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。 0017 上面所述的核酸还可包括探针， 所述探针可以通过化学合成来制备， 通过使用本 领域技术人员知道的方

14、法参考已知信息来恰当设计， 并通过化学合成来制备， 或者可以通 过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因， 并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩 增它来制备。 0018 本发明的检测GTF2F1蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能： 例 如， 可以包括ELISA、 放射免疫测定法、 免疫组织化学法、 Western印迹等。 0019 本发明的检测GTF2F1蛋白的产品包括特异性结合GTF2F1蛋白的抗体或其片段。 可 以使用任何结构、 尺寸、 免疫球蛋白类别、 起源等的抗体或其片段， 只要它结合靶蛋白质即 可。 本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。 抗体片段

15、指保 留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。 抗体片段可以 包括F(ab )2、 Fab 、 Fab、 单链Fv(scFv)、 二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、 二聚化V区 (双抗体)、 或含有CDR的肽。 本发明的检测GTF2F1蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体 片段的氨基酸序列的分离的核酸， 包含该核酸的载体， 和携带该载体的细胞。 0020 抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。 例如， 制备保留整个或部分靶 蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。 使用抗原免 疫动物后， 从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨

16、髓瘤细胞以获得杂交瘤。 然后从杂交 瘤培养物收集抗体。 最后可以通过使用被用作抗原的GTF2F1蛋白或其部分对获得的抗体实 施抗原特异性纯化来获得针对GTF2F1蛋白的单克隆抗体。 可以如下制备多克隆抗体： 用与 上文相同的抗原免疫动物， 从经过免疫的动物收集血液样品， 从血液中分离出血清， 然后使 用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。 可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的 抗体的序列信息来获得抗体片段。 0021 标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。 例如， 可 以如下荧光标记蛋白质或肽： 用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽， 添加用DMSO、 缓冲剂、 等准 备的

17、染料， 然后混合溶液， 再于室温放置10分钟。 另外， 标记可使用商品化的标记试剂盒， 诸 如 生 物 素 标 记 试 剂 盒 ， 如 生 物 素 标 记 试 剂 盒 - N H 2 、 生 物 素 标 记 试 剂 盒 - S H (DojindoLaboratories)； 碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、 碱性磷 酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)； 过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标 记试剂盒-NH2、 过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)； 藻胆蛋白标记试剂 盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、 藻

18、胆蛋白标记试剂盒-SH、 B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2， 说明书 2/11 页 4 CN 106191283 B 4 B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、 R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、 R-藻红蛋白标记试剂盒SH (DojindoLaboratories)； 荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、 HiLyte Fluor(TM) 555标记试剂盒-NH2、 HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)； 及 DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、 Zenon(TM)、 Alex

19、a Fluor(TM)抗体 标记试剂盒、 Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标 记试剂盒(Funakoshi Corporation)。 为了正确标记， 可以使用适宜的仪器来检测经过标记 的抗体或其片段。 0022 作为依照本发明的检测产品的样品， 可以使用例如自活检受试者获得的组织样品 或流体。 样品不受特别限制， 只要它适于本发明的测定； 例如， 它可以包括组织、 血液、 血浆、 血清、 淋巴液、 尿液、 浆膜腔液、 脊髓液、 滑液、 房水、 泪液、 唾液、 或其级分或经过处理的材 料。 0023 在本发明的具体实施方案中，

20、所述样品来自受试者的组织。 0024 在本发明中，“预后” 是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过 程或结果。 在本说明书中， 预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20年或更久时的生机状态。 预后可以通过检查生物标志物即GTF2F1蛋白或编 码GTF2F1蛋白的基因来预测。 预后预测可以这样进行： 根据生物标志物的有或无， 或者升高 或降低， 确定患者的预后是良好还是不良， 或者确定良好预后或不良预后的概率。 0025 在本发明中，“预后良好” 是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之 后， 患者长

21、时期(例如3、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20年或更长)没有危急状况。 或者， 预后好可以意 指在这样长时间内存活、 无转移、 无复发、 或无再发。 例如， 预后良好可以意指至少3年或尤 其是至少5年存活， 优选没有转移或复发。 预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。 如 本文中所使用的，“预后良好” 还可以包括任何这样的状态， 其中可以发现疾病如转移， 但是 恶性低且不严重地影响生存能力。 0026 在本发明中，“预后不良” 是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短 时期(例如1、 2、 3、 4、 5年或更短)内发生致命状况。 或者， 预后差是指在这样的短时期

22、里死 亡、 转移、 复发、 或再发。 例如， 预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、 转移、 或死 亡。 0027 预测预后是指预测患者状况的过程或结果， 并不意味着能以100的准确度预测 患者状况的过程或结果。 预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加， 而并不意 味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。 如本 发明而言， 本发明中GTF2F1基因或GTF2F1蛋白的水平升高的患者中， 与不显示该特征的患 者相比， 更有可能观察到特定过程或结果。 0028 进一步， 所述检测GTF2F1基因或GTF2F1蛋白的产品可以是检测GTF2F1基因或 G

23、TF2F1蛋白的试剂、 也可以是包含所述试剂的试剂盒、 芯片、 试纸等， 也可以是使用所述试 剂的高通量测序平台。 0029 本发明还提供了一种诊断多发性骨髓瘤的工具， 所述工具能够检测GTF2F1基因或 GTF2F1蛋白的表达水平。 所述工具包括能够结合GTF2F1基因的核酸或者能够结合GTF2F1蛋 白的物质(例如抗体)。 所述核酸能够检测GTF2F1基因的表达水平； 所述物质能够检测 GTF2F1蛋白的表达水平。 说明书 3/11 页 5 CN 106191283 B 5 0030 进一步， 所述核酸和所述物质的性质同前面所述。 0031 进一步， 所述诊断多发性骨髓瘤的工具包括但不限于

24、芯片、 试剂盒、 试纸、 或高通 量测序平台； 高通量测序平台是一种特殊的诊断多发性骨髓瘤的工具， 随着高通量测序技 术的发展， 对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。 通过对比疾病患者和正 常人群的基因表达谱， 容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。 因此， 在高通量测序中获知 GTF2F1基因的异常与多发性骨髓瘤相关也属于GTF2F1基因的用途， 同样在本发明的保护范 围之内。 0032 本发明还提供了一种预测多发性骨髓瘤预后的工具， 所述预测多发性骨髓瘤预后 工具包括能够结合GTF2F1基因的核酸或者能够结合GTF2F1蛋白的物质(例如抗体)。 所述核 酸能够检测GTF2F1基因

25、的mRNA水平； 所述物质能够检测GTF2F1蛋白的表达水平。 0033 进一步， 所述核酸和所述物质的性质同前面所述。 0034 进一步， 所述预测多发性骨髓瘤预后的工具包括但不限于芯片、 试剂盒、 试纸、 或 高通量测序平台； 高通量测序平台是一种特殊的诊断多发性骨髓瘤的工具， 随着高通量测 序技术的发展， 对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。 通过对比疾病患者 和正常人群的基因表达谱， 容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。 因此， 在高通量测序中 获知GTF2F1基因的异常与多发性骨髓瘤相关也属于GTF2F1基因的用途， 同样在本发明的保 护范围之内。 0035 本发明的检测

26、产品、 诊断工具中使用的抗GTF2F1抗体或其片段所识别的氨基酸的 数目没有特别限制， 只要抗体能够结合GTF2F1即可。 当抗体作为治疗药物时， 优选的是它能 够识别尽可能多的氨基酸， 只要它能抑制GTF2F1功能。 抗体或其片段识别的氨基酸的数目 是至少一个， 更优选至少三个。 抗体的免疫球蛋白类别不受限制， 可以是IgG、 IgM、 IgA、 IgE、 IgD或IgY。 0036 本发明还提供了一种诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓瘤预后的方法， 所述方 法包括如下步骤： 0037 (1)获取受试者的样品； 0038 (2)检测受试者样品中GTF2F1基因或蛋白的表达水平； 0039 (3

27、)将测得的GTF2F1基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。 0040 (4)与对照相比， GTF2F1基因或蛋白的表达水平升高， 则该受试者被诊断为多发性 骨髓瘤， 或该受试者被确定为预后不良。 0041 本发明还提供了一种多发性骨髓瘤的治疗方法， 所述方法包括抑制GTF2F1基因或 GTF2F1蛋白。 0042 进一步， 所述方法包括抑制GTF2F1基因的表达， 或抑制GTF2F1蛋白的表达或抑制 GTF2F1蛋白的活性。 0043 本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法， 可以通过在对肿瘤细胞添加测试药物 后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量GTF2F1基因或者GTF

28、2F1蛋白的表 达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。 更具体地说， 当GTF2F1基因或者GTF2F1蛋白 的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时， 可选择该药物作为改善 肿瘤预后的治疗药物。 0044 本发明还提供了一种含有GTF2F1基因或GTF2F1蛋白的抑制剂的药物。 说明书 4/11 页 6 CN 106191283 B 6 0045 本发明还提供了上述抑制剂在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。 0046 本发明的GTF2F1基因或GTF2F1蛋白的抑制剂不受限制， 只要是可以抑制GTF2F1或 涉及GTF2F1上游或下游途径的物质的表达或活性， 且对于治疗肿

29、瘤有效的药物即可。 0047 进一步， 所述抑制剂包括反义核酸、 dsRNA、 核酶、 适体、 GTF2F1结合蛋白片段、 或抗 体或其片段。 0048 “反义核酸” 指含有与编码GTF2F1的mRNA互补的序列的核酸。 反义核酸可以由DNA、 RNA或二者组成。 反义核酸不需要与靶GTF2F1的mRNA100互补。 反义核酸可含有非互补碱 基， 只要它能够在严格条件下特异性杂交即可。 当将反义核酸引入细胞时， 它结合靶多核苷 酸并抑制转录、 RNA加工、 翻译或稳定性。 除反义多核苷酸之外， 反义核酸还包括多核苷酸模 拟物， 它含有经过修饰的主链、 和3 和5 端部分。 这样的反义核酸可以根

30、据GTF2F1序列信息 来恰当设计并使用本领域技术人员公知的方法来生成。 0049 “dsRNA” 指含有双链RNA结构， 通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达的RNA， 包括 siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)。 dsRNA不需要与靶基因序列具有100的同源性， 只要它可抑制靶基因表达即可。 为了稳定化或其它目的， 可以将dsRNA的一部分用DNA替代。 优选的是， siRNA是21-23个碱基的双链RNA。 siRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来 制备 ， 例如通过化学合成或作为天然存在RNA的类似物。 shRNA是具有发夹转角 (hairpinturn)结构

31、的短链RNA。 shRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备， 例如通 过化学合成或通过将编码shRNA的DNA引入细胞并表达DNA。 0050 “核酶” 指具有催化活性的RNA， 它能够切割、 粘贴、 插入、 和转移RNA。 核酶的结构可 以包括锤头、 发夹等。 0051 “适体” 指结合某物质诸如蛋白质的核酸。 适体可以是RNA或DNA。 核酸的形式可以 是双链或单链。 适体的长度无限制， 只要它能够特异性结合靶分子即可， 可以由例如10至 200个核苷酸、 优选10至100个核苷酸、 更优选15至80个核苷酸、 进一步更优选15至50个核苷 酸组成。 适体可以使用本领域技术人员公知的

32、方法来选择。 例如， 可以采用SELEX(通过指数 式富集进行的配体的系统进化)。 0052 “GTF2F1结合蛋白的片段” 指结合GTF2F1且抑制GTF2F1实施原始功能的蛋白质的 片段。 0053 本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。 可以与本发明的药 物一起施用的其它药物不受限制， 只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即 可， 优选的是， 用于治疗或预防肿瘤的药物可以包括例如烷化剂， 诸如异环磷酰胺、 环磷酰 胺、 达卡巴嗪、 替莫唑胺、 尼莫司汀、 白消安、 丙卡巴肼、 美法仑、 和雷莫司汀； 抗代谢物， 诸如 依诺他滨、 卡培他滨、 卡莫氟、 克拉屈滨、

33、吉西他滨、 阿糖胞苷、 阿糖胞苷十八烷基磷酸盐 (cytarabine ocfosfate)、 替加氟、 替加氟-尿嘧啶、 替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、 去氧氟尿 苷、 羟基脲、 氟尿嘧啶、 氟达拉滨、 培美曲塞、 喷司他丁、 巯嘌呤、 和甲氨蝶呤； 植物生物碱， 诸 如伊立替康、 依托泊苷、 索布佐生、 多西他赛、 nogitecan、 帕利他赛、 长春瑞滨、 长春地辛、 和 长春碱； 抗癌抗生素， 诸如放线菌素D、 阿柔比星、 氨柔比星、 伊达比星、 表柔比星、 净司他丁 stimalamer、 柔红霉素、 多柔比星、 吡柔比星、 博来霉素、 培洛霉素、 丝裂霉素C、 和米托蒽醌； 基于铂的

34、药物， 诸如奥沙利铂、 卡铂、 顺铂、 和奈达铂； 激素药物， 诸如阿那曲唑、 依西美坦、 雌莫司汀、 炔雌醇、 氯地孕酮、 戈舍瑞林、 他莫昔芬、 地塞米松、 托瑞米芬、 比卡鲁胺、 氟他胺、 说明书 5/11 页 7 CN 106191283 B 7 泼尼松龙、 磷雌酚、 米托坦、 甲睾酮、 甲羟孕酮、 美雄烷、 亮丙瑞林、 和来曲唑； 生物反应修饰 剂， 诸如干扰素 、 干扰素 、 干扰素、 白介素、 乌苯美司、 干BCG、 和香菇多糖； 和分子靶向药 物， 诸如伊马替尼(imatinib)、 吉非替尼(gefitinib)、 吉姆单抗、 奥佐米星、 他米巴罗汀、 曲 妥单抗、 维A酸、

35、 硼替佐米(bortezomib)、 和利妥昔单抗等。 0054 本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。 包括但不限于， 经皮、 粘膜、 鼻、 口颊、 舌下或经口使用的片剂、 溶液剂、 颗粒剂、 贴剂、 膏剂、 胶囊剂、 气雾剂或栓剂。 0055 本发明的药物的施用途径不受限制， 只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即 可， 包括但不限于静脉内， 腹膜内， 眼内， 动脉内， 肺内， 口服， 小泡内， 肌肉内， 气管内， 皮下 的， 通过皮肤， 通过胸膜， 局部的， 吸入， 通过粘膜， 皮肤， 肠胃， 关节内， 心室内， 直肠， 阴道， 颅骨内， 尿道内， 肝内， 瘤内。 在某些情况下， 可以系

36、统地给药。 在某些情况下是局部地给药。 0056 本发明的药物的剂量不受限制， 只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可， 可 以依据症状、 性别、 年龄等来恰当的确定。 本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例 如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。 0057 在本发明的上下文中，“诊断多发性骨髓瘤” 既包括判断受试者是否已经患有多发 性骨髓瘤、 也包括判断受试者是否存在患有多发性骨髓瘤的风险。 0058 本文所用的 “治疗” 涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的 疾病或疾病状态， 并且包括： 0059 (1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生， 尤其是当该哺乳动物易

37、感于所述疾 病状态， 但尚未被诊断出患有这种疾病状态时； 0060 (2)抑制疾病或疾病状态， 即阻止其发生； 或者 0061 (3)缓解疾病或疾病状态， 即使疾病或疾病状态消退。 0062 术语 “治疗” 通常涉及治疗人类或动物(例如， 被兽医所应用)， 其中可达到某些预 期的治疗效果， 例如， 抑制病症的发展(包括降低发展速度、 使发展停止)、 改善病症和治愈 病症。 还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。 对还没有发展为病症但有发展为该病症危 险的患者的用途， 也包括在术语 “治疗” 中。 0063 本发明的优点和有益效果： 0064 本发明的发现了一种诊断多发性骨髓瘤的分子标志物， 使

38、用该分子标志物可以在 多发性骨髓瘤发生的早期即可作为判断， 提供了患者的生存率。 0065 另外， 通过预测患者的预后， 本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方 案策略。 0066 本发明的包括GTF2F1基因或蛋白的抑制剂的治疗药物可用作新的多发性骨髓瘤 的治疗药物。 附图说明 0067 图1显示抑制GTF2F1基因表达对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响； 0068 图2显示抑制GTF2F1蛋白功能对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响； 0069 图3显示抑制GTF2F1基因表达对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响； 0070 图4显示抑制GTF2F1基因表达对多发性骨髓瘤细胞侵袭的影响； 0071 图5显

39、示抑制GTF2F1基因表达对多发性骨髓瘤细胞迁移的影响。 说明书 6/11 页 8 CN 106191283 B 8 0072 具体的实施方式 0073 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。 以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。 实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件， 例如Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0074 实施例1 基因芯片筛选差异表达基因 0075 1、 取材： 0076 多发性骨

40、髓瘤组织： 收集确诊的MM患者骨髓活检标本共10例， MM诊断标准参阅 中 国多发性骨髓瘤诊治指南2011修订版 。 患者中男5例， 女5例， 中位年龄59岁。 0077 正常骨髓组织： 收集同时期营养不良性贫血患者骨髓活检组织标本10例作为对照 组， 其中男5例， 女5例， 中位年龄53岁。 0078 2、 组织RNA的获取 0079 使用Trizol一步法提取组织总RNA。 0080 3、 RNA纯度及浓度的测定 0081 取RNA溶液1 l， 仪器测定OD260、 OD280， RNA浓度为OD260值稀释倍数40/1000， 计算OD260/OD280， 比值在1.7-2.0代表RNA

41、溶液纯度高， 含蛋白质等杂质少， -20保存。 0082 4、 RNA完整性检测 0083 (1)取2 l RNA样品行1.5琼脂糖凝胶电泳(80v， 15min)； 0084 (2)分出区带后， genefinder染色， 蓝光下观察电泳区带； 0085 (3)当28s/18s约2:1时， 说明RNA稳定无降解。 0086 5、 基因芯片杂交及扫描 0087 总RNA经线性化扩增后， cy3-UTP标记， 荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 纯化， 用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。 采用美 国Agi

42、lent公司的人全基因表达谱芯片(4x44K基因)， 在芯片杂交炉中65杂交17h， 然后洗 脱、 染色， 最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。 0088 6、 芯片数据处理与分析 0089 杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后， 将数据导入分析软件， 对于两组比值 的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。 0090 7、 统计学处理 0091 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析， 组间差异比较采用单因素方差分析法， P 0.05差异有显著性意义。 0092 8、 结果 0093 芯片结果显示， 多发性骨髓瘤组织与正常骨髓组

43、织之间共筛选出489个差异表达 基因， 其中表达水平上调的基因215个， 表达水平下调的基因274个。 0094 实施例2 大样本验证筛选出的差异表达基因 0095 考虑现有技术中还未见关于该基因与多发性骨髓瘤相关性进行研究的基因作为 候选基因， 同时考虑基因测序的结果， 选择GTF2F1基因(其表达在多发性骨髓瘤组织中上 调)进行验证。 0096 1、 样本收集 说明书 7/11 页 9 CN 106191283 B 9 0097 按照实施例1的方法收集多发性骨髓瘤组织50例， 正常骨髓组织60例。 0098 2、 在mRNA水平上进行验证 0099 2.1提取组织RNA 0100 步骤同实

44、施例1。 0101 2.2逆转录 0102 逆转录体系共20 L， 包括细胞总RNA 2 g/2 L， 50U/ L Rnasin 1 L， 5逆转录反 应缓冲液4 L， 10m M d NTP 2 l， 50 g/mL随机引物2 L(promega)， 200U/ L M-MLV逆转录酶 1 L， DEPC 8 L。 0103 37反应60分钟， 955分钟终止反应。 cDNA在-80保存或进行PCR扩增。 0104 2.3 PCR 0105 反应体系按照Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒(购自天根生化科技(北京) 有限公司)配置， SYBR反应体系共25 L， 2

45、.5Real Master Mix 10 L， 20SYBR solution 1.25 L， 上游引物0.5 L， 下游引物0.5 L， 去离子水10.75 L， cDNA 2 L。 反应条件为94 5min， 9445s， 601min， 30个循环， 设空白对照。 0106 PCR反应前10个循环的荧光信号作为荧光本底信号， 调节基线至适宜处， 各荧光曲 线与基线交叉点的循环数即为Ct值。 根据C(t)C(t)目的基因-C(t) -actin， C(t)2 -C(t)， 计算目的基因与 -actin相对表达量。 0107 PCR引物序列如下： 0108 GTF2F1基因引物序列如下所示：

46、 0109 上游引物： 5 -CAGAATGTCACTGAATACG-3 (SEQ ID NO.1)； 0110 下游引物： 5 -ATCTCCTCCTCTTGGTAG-3 (SEQ ID NO.2)。 0111 -actin基因引物序列如下所示： 0112 上游引物： 5 -CTGGCACCACACCTTCTACAAT-3 (SEQ ID NO.3)； 0113 下游引物： 5 -AATGTCACGCACGATTTCCCGC-3 (SEQ ID NO.4) 0114 2.4结果 0115 结果显示， 与正常骨髓组织相比， 多发性骨髓瘤组织中GTF2F1基因的mRNA水平明 显上调， 相对表达

47、量为8.541.12， 差异具有统计学意义(P0.05)。 0116 3、 在蛋白水平上进行验证 0117 3.1提取组织总蛋白 0118 按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。 0119 3.2 Western blot检测 0120 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳， 之后进行转膜、 封闭、 一抗孵育、 二抗孵育、 显色。 0121 3.3统计学处理 0122 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析， 以 -actin为内参， 将GTF2F1蛋 白条带的灰度值进行归一化处理。 结果数据都是以平均值标准差的方式来表示， 采用 SPSS13.

48、0统计软件来进行统计分析的， 两者之间的差异采用t检验， 认为当P0.05时具有统 计学意义。 0123 3.4结果 说明书 8/11 页 10 CN 106191283 B 10 0124 结果显示， 与正常骨髓组织相比， 多发性骨髓瘤组织中GTF2F1蛋白水平显著增加， 相对表达量为4.120.87， 差异具有统计学意义(P0.05)。 0125 实施例3 抑制GTF2F1基因表达 0126 1、 siRNA设计合成 0127 针对GTF2F1的siRNA序列： 0128 siRNA-GTF2F1： 0129 正义链为5 -AUGAUGUUAUAUUUUUUGGUU-3 (SEQ ID N

49、O.5) 0130 反义链为5 -CCAAAAAAUAUAACAUCAUGG-3 (SEQ ID NO.6)； 0131 以上siRNA序列与阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)均由上海吉玛制药技术有限公 司提供。 0132 2、 多发性骨髓瘤细胞的培养与转染 0133 2.1细胞培养 0134 RPMI8226细胞采用含有15胎牛血清(FBS)、 青霉素100U/ml、 链霉素100 g/ml的 RPMI 1640培养基置于37， 5CO2， 饱和湿度环境下培养。 0135 2.2细胞转染 0136 (1)转染前24小时， 在500 l无抗培养基中接种0.5-2*105个细胞， 转染时细胞融合 度为30-50。 铺板时要将细胞消化完全混匀， 避免细胞堆积生长。 0137 (2)用50 l Opti-MEM稀释siRNA(转染细胞的终浓度为33nM， 轻轻吹吸3-5次混匀。 0138 (3)轻轻颠倒混匀转染试剂， 用50 l Opti-MEM稀释1 l Lipofectamine2000轻轻 吹吸3-5次混匀， 室温下静置5