利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102443598 A (43)申请公布日 2012.05.09 CN 102443598 A *CN102443598A* (21)申请号 201010507742.5 (22)申请日 2010.10.15 C12N 15/70(2006.01) C12P 19/24(2006.01) C12P 19/00(2006.01) (71)申请人 天津赛科瑞德生物科技有限公司 地址 300457 天津市经济技术开发区洞庭路 220 号 N1801 (72)发明人 王鹏 李磊 原静 (54) 发明名称 利用糖基转移酶大量制备 Globo 系列抗原的 方法 (57) 摘要 本

2、发明涉及一种利用糖基转移酶大量制备 Globo-H 六糖的方法， 即利用分子生物学技术构 建糖基转移酶和糖核苷酸差向异构酶表达载体， 转化入大肠杆菌进行过量表达， 目的蛋白进行粗 略纯化后在体外催化寡糖的合成。Globo-H 是目 前广泛应用于乳腺癌、 前列腺癌疫苗的试剂， 使用 本发明的方法合成 Globo-H 可以大大降低其生产 成本。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 3 页 CN 102443615 A1/2 页 2 1. 一种利用糖基转移酶大量制备 Globo 系列抗原的方法， 由下述步骤组成

3、 ： (1). 酶表达载体的构建 ： 克隆出 1， 3 半乳糖基转移酶 (LgtC)、 1， 3 氮乙酰半乳糖胺转移酶 (LgtD)、 1， 2 岩 藻糖基转移酶 (WbsJ)、 UDP-GlcNAc/Glc 4 位差向异构酶 (Gne2)， 经酶切后插入大肠杆菌载 体， 分别命名为 v-LgtC、 v-LgtD、 v-WbsJ、 v-Gne2 ； (2). 酶的过量表达与纯化 ； 上述表达载体分别转化入大肠杆菌形成表达特异酶的工程菌株。 阳性克隆工程 菌株接种于 LB 培养基中， 37培养 10-12 小时后转接入新的 LB 培养基中， 37继续培养 2-4 小时， 摇床转速为 200-25

4、0 转 / 分钟 ； 当方发酵液浓度达到 OD600 0.6-0.8 时， 加入 IPTG 诱导蛋白表达 20 小时， 温度为 25， 摇床转速为 200-250 转 / 分钟 ； 菌体通过离心收 集， 经过细胞破碎后使用亲和层析纯化目的蛋白 ； (3).Globo 系列抗原的大量合成 以乳糖为底物， 以等物质的量的糖核苷酸 UDP-Glc 为糖基供体， 反应液中加入终浓度 为5mM的MnCl2， 在差向异构酶Gne2和糖基转移酶LgtC的作用下合成Gb3三糖， 使用薄板层 析检测反应的进度 ； 待反应完成后， 反应液通过阴离子交换树脂去除反应生成的 UDP ； 在反应液中加入等物质的量 的

5、UDP-GlcNAc 作为下一步反应的糖基供体， 同时加入终浓度 为 5mM 的 MnCl2， 在差向异构酶 Gne2 和糖基转移酶 LgtD 的作用下合成 Gb4 四糖， 反应使用 与第一步反应相同的方法检测并处理 ； 在反应液中加入等物质的量的糖核苷酸 UDP-Glc 为 糖基供体， 并加入终浓度为 5mM 的 MnCl2， 在差向异构酶 Gne2 和糖基转移酶 LgtD 的作用下 合成 Gb5 五糖， 反应使用与第一步反应相同的方法检测并处理 ； 在反应液中加入等物质的 量的糖核苷酸 GDP-Fuc 为糖基供体， 并加入终浓度为 5mM 的 MnCl2， 在糖基转移酶 WbsJ 的作 用

6、下合成 Gb5 五糖， 反应以薄板层析监测 至反应完全 ； (4).Globo 系列抗原的纯化 上述反应液通过阴离子交换树脂， 去除带有电荷的化合物， 然后以活性炭纯化得到 最终产品。 2.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法， 其特征是， 步 骤(1)中所述的1， 3半乳糖基转移酶是来源于革兰氏阴性细菌Neisseria meningitidis 的 LgtC。 3. 如权利要求 1 中所述利用糖基转移酶大量制备 Globo 系列抗原的方法， 其特征是， 步骤 (1) 中所述的 1， 3 氮乙酰半乳糖胺转移酶是来源于 Haemophilusinfluenza Rd

7、 的 LgtD。 4. 如权利要求 1 中所述利用糖基转移酶大量制备 Globo 系列抗原的方法， 其特征是， 步骤 (1) 中所述的 1， 2 岩藻糖基转移酶是来源于大肠杆菌 O128 的 WbsJ。 5.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法， 其特征是， 步 骤 (1) 中所述的 UDP-GlcNAc/Glc 4 位差向异构酶 (Gne2) 是来源于大肠杆菌 O86 的 Gne2。 6.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法， 其特征是， 步 骤(1)中所述的载体为pET15b、 pMCSG7、 pGEX-4T-1等大肠杆菌表达载体及在

8、此基础上改造 的载体。 权 利 要 求 书 CN 102443598 A CN 102443615 A2/2 页 3 7.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法， 其特征是， 步 骤 (1) 中所述的 1， 3 氮乙酰半乳糖胺转移酶 (LgtD) 为双功能酶。 8.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法， 其特征是， 步 骤 (2) 中所述的大肠杆菌表达菌株为 BL21(DE3) 或其他含有 DE3 特性的大肠杆菌菌株。 9.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法， 其特征是， 步 骤(2)中所述的IPTG浓度 ：

9、对载体pET15b或者pMCSG7及在其基础上改造的载体为0.4mM ； 对载体 pGEX-4T-1 及在其基础上改造的载体为 1mM。 10.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法， 其特征是， 步骤 (3) 中所述的反应 pH 值均为 7.5， 使用 Tris-HCl 缓冲液调节。 权 利 要 求 书 CN 102443598 A CN 102443615 A1/6 页 4 利用糖基转移酶大量制备 Globo 系列抗原的方法 技术领域 0001 本发明属于生物药物技术领域， 具体地说， 涉及一种生物酶法大量制备寡糖 Globo 系列抗原的方法。 背景技术 0002

10、 糖结构的表达异常是肿瘤表型的标志之一， 这些异常包括自然糖链的上调和下调 表达， 胚胎组织专属糖结构的异常表达。这些肿瘤相关糖链结构可以作为细胞癌变的诊断 标记。由于肿瘤细胞携带的糖链与正常细胞相异， 基于肿瘤异常糖链结构的靶向免疫激活 具有理论可行性。这一理论已经付诸抗肿瘤糖疫苗的开发实践， 并且在早期临床实验中 得到了令人可喜的成果。人们在肿瘤细胞上发现了几种常见的糖链结构， 包括 Tn 抗原、 T 抗原、 唾液酸化 Lex 抗原、 Ley 抗原、 神经节苷脂 (gangliosides)、 Globo-H 和聚唾液酸 (polysialic acid， PSA)， 其中 Globo-H

11、 通常与晚期乳癌、 前列腺癌、 肺癌和卵巢癌相关。 0003 这些异常糖链结构已经作为用于癌症免疫治疗的抗肿瘤糖疫苗的开发目标， 其中 几种疫苗目前正进行临床评估并表现出一定的作用。 例如sTn-KLH缀合物(KLH是一种常用 的疫苗缀合蛋白 ) 和激素联合给药比激素单独给药有效延长了癌症病人的生存时间 ； 对前 列腺癌症病人进行的 Globo-H 缀合物与免疫补体 QS-21 联合给药治疗已经进入 I 期临床， 研究证明是安全的， 并可以有效诱导高滴度的抗Globo-H特异IgM型抗体。 由Danishefsky 及合作者开发的包含 Globo-H， Ley 和 Tn 的三抗原疫苗在临床前试

12、验中可以激发抗此三种 抗原的 IgG 合物 (KLH 是一种常用的疫苗缀合蛋白 ) 和激素联合给药比激素单独给药有效 延长了癌症病人的生存时间 ； 对前列腺癌症病人进行的 Globo-H 缀合物与免疫补体 QS-21 联合给药治疗已经进入 I 期临床， 研究证明是安全的， 并可以有效诱导高滴度的抗 Globo-H 特异 IgM 型抗体。由 Danishefsky 及合作者开发的包含 Globo-H， Ley 和 Tn 的三抗原疫苗 在临床前试验中可以激发抗此三种抗原的 IgG 型抗体。 0004 Globo 系列抗原结构如下， 由于该糖很难在自然界中提取， 只能通过合成手段获 得。Danish

13、efsky 等最先报道了化学方法合成 Globo-H， 随后也出现了不同的化学合成方 法， 然而都无法避免化学合成固有的繁琐、 总效率低的缺陷。 0005 说 明 书 CN 102443598 A CN 102443615 A2/6 页 5 0006 实践检验， 酶法合成被证明是化学合成的有效替代途 。与化学方法相此， 酶法 合成在更为有效进行高度空间和立体化学特异性的糖基化反应方面具有明显的优势。 用于 糖合成的酶主要是糖基转移酶。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一个可以用于大量制备包括Globo-H在内的Globo系列抗 原的方法， 该方法利用特定的糖基转移酶进行。使用本发明的方

14、法， 能够大量制备 Globo 系 列抗原及其衍生物。 0008 本发明所涉及的利用糖基转移酶大量制备 Globo 系列抗原的方法， 由下述步骤组 成 ： 0009 (1). 克隆表达载体的构建 ： 0010 克隆出 1， 3 半乳糖基转移酶 (LgtC) 使用酶切位点 NdeI 和 BamHI 构建入载体 pET15b， 命名为 v-LgtC ； 克隆出 1， 3 氮乙酰半乳糖胺转移酶 (LgtD) 使用 LIC 的方法构建 入载体 pMCSG7， 命名为 v-LgtD ； 克隆 1， 2 岩藻糖基转移酶 (WbsJ) 使用酶切位点 BamHI 和 XhoI 构建入载体 pGEX-4T-1，

15、 命名为 v-WbsJ、 克隆 UDP-GlcNAc/Glc 4 位差向异构酶 (Gne2) 使用酶切位点 NdeI 和 BamHI 构建入载体 pET15b， 命名为 v-Gen2 ； 0011 (2). 酶的过量表达与纯化 ： 0012 上述表达载体分别转化入大肠杆菌形成表达特异酶的工程菌株。 阳性克隆 工程菌株接种于 LB 培养基中， 37培养 10-12 小时后转接入新的 LB 培养基中， 37继续培 养 2-4 小时， 摇床转速为 200-250 转 / 分钟 ； 当方发酵液浓度达到 OD600 0.6-0.8 时， 加入 IPTG 诱导蛋白表达 20 小时， 温度 为 25， 摇床

16、转速为 200-250 转 / 分钟 ； 菌体通过离心收 集， 经过细胞破碎后使用亲和层析纯化目的蛋白 ； 0013 其中 LB 培养基的配方为 ： 10g/L 蛋白胨 ； 5g/L 酵母粉 ； 10g/L 氯化钠 ； 0014 其中 LgtC， LgtD， Gne2 使用镍离子亲和树脂纯化 ； 纯化使用平衡缓冲液为 20mM Tris-HCl， pH7.5， 500mM 氯化钠， 5mM 咪唑 ； 清洗缓冲液为 20mM Tris-HCl， pH7.5， 500mM 氯 化钠， 25mM 咪唑 ； 洗脱缓冲液为 20mMTris-HCl， pH7.5， 500mM 氯化钠， 250mM 咪唑

17、 ； 说 明 书 CN 102443598 A CN 102443615 A3/6 页 6 0015 其中 WbsJ 使用 GST 树脂纯化 ； 纯化使用平衡缓冲液为 20mM 磷酸缓冲液， pH7.4 ； 洗脱缓冲液为 50mM Tris-HCl， pH8， 15mM 的还原型谷胱甘肽 ； 0016 (3).Globo 系列抗原的大量合成与纯化 0017 以乳糖为底物， 以等物质的量的糖核苷酸 UDP-Glc 为糖基供体， 反应液中加入终 浓度为 5mM 的 MnCl2， 在差向异构酶 Gne2 和糖基转移酶 LgtC 的作用下合成 Gb3 三糖， 使用 薄板层析检测反应的进度 ； 待反应完

18、成后， 反应液通过阴离子交换树脂去除反应生成的 UDP， 与活性炭混合 ； 混合后用 10 体积的水洗去无机盐等分子， 然后用 20 体积 3的乙醇洗 去没有反应的乳糖， 最后用 20的乙醇洗脱 Gb3 即可得到纯度 98的 Gb3 三糖 ； 0018 Gb4、 Gb5 和 Globo-H 的制备同上， 每个糖的制备均以前一个糖为底物， 纯化同样使 用活性炭， 但洗脱寡糖所使用的乙醇浓度不同 ； 0019 优选的， 步骤 (3) 中所述的反应 pH 值是 7.5 ； 0020 优选的， 步骤 (3) 中所述的反应温度是 37 ； 0021 优选的， 步骤 (3) 中所述的反应时间是是 10-1

19、5 小时 ； 0022 使用步骤 (3) 中所述的反应合成 Globo-H 可达到 65以上的产率 ； 0023 本发明所涉及的利用糖基转移酶大量制备包括Globo-H在内的Globo系列抗原的 方法， 充分利用酶催化反应的的高度化学结构和立体结构选择性， 避开了化学方法繁琐的 合成过程， 大大降低了Globo系列抗原大量合成的成本。 使用该方法可大量制备Globo系列 抗原及衍生物， 这些衍生物能够 接连接到特定蛋白上作为乳腺癌、 前列腺癌等的疫苗。 附图说明 0024 图 1 是构建载体图谱 0025 图 2 是 Globo 系列抗原体外合成方法 具体实施方式 0026 为了理解本发明，

20、下面以实施例进一步说明本发明， 但不意于限制本发明的保护 范围。 0027 实施例 1 ： Gb3-OBn 的制备 0028 0029 Lac-OBn(432mg， 1mmole)， UDP-Glc(565mg， 1mmole) 加入到 250mL 三角瓶中， 加入 20mM Tris-HCl 缓冲液 150mL， 加入终浓度为 10mM 氯化锰， 最后加入 20 单位的 Gne2 和 50 单位的LgtC， 37反应10小时后过离子交换除去UDP等， 最后使用活性炭纯化， 得白色固体 554mg， 收率 ： 93制备得到 Gb3-OBn 的数据 ： 说 明 书 CN 102443598 A

21、CN 102443615 A4/6 页 7 0030 分子式 ： C25H28O16 0031 分子量 ： 594 0032 形状 ： 白色粉末 0033 图谱数据 ： 1H NMR(400MHz， D 2O) ： 7.43-7.36(m， 5H)， 4.89(d， J 4.1Hz， 1H ； d， J 11.4Hz， 1H)， 4.71(d， J 11.4Hz， 1H)， 4.51(d， J 8.1Hz， 1H)， 4.46(d， J 8.1Hz， 1H)， 4.31(t， J6.5Hz， 1H)， 3.98-3.48(m， 16H)， 3.29(t， J8.9Hz， 1H) ； 13C N

22、MR(100MHz， D 2O) ： 136.7， 129.02， 128.96， 128.7， 103.5， 101.2， 100.5， 78.8， 77.6， 75.7， 75.1， 74.7， 73.2， 72.4， 72.3， 71.7， 71.1， 71.0， 69.4， 69.1， 68.8， 62.7， 60.7， 60.6， 60.3. 0034 实施例 2 ： Gb4-OBn 的制备 0035 0036 Gb3-OBn(594mg， 1mmole)， UDP-GlcNAc(610mg， 1mmole) 加入到 250mL 三角瓶中， 加 入 20mM Tris-HCl 缓冲液

23、 150mL， 加入终浓度为 10mM 氯化锰， 最后加入 20 单位的 Gne2 和 50 单位的 LgtD， 37反应 10 小时后过离子交换除去 UDP 等， 最后使用活性炭纯化， 得白色 固体 729mg， 收率 ： 91制备得到 Gb4-OBn 的数据 ： 0037 分子式 ： C35H51NO21 0038 分子量 ： 797 0039 形状 ： 白色粉末 0040 图 谱 数 据 ： 1H NMR(500MHz， D 2O) ： 7.50-7.40(m， 5H)， 5.01(d， J 11.6Hz， 1H)， 4.85(d， J 4.1Hz， 1H)， 4.71(d， J 11.

24、6Hz， 1H)， 4.56(d， J 8.6Hz， 1H)， 4.49(m， 1H)， 4.35(m， 1H)， 4.10-3.64(m， 22H)， 3.29(dd， J 8.1Hz， 9.1Hz， 1H)， 2.13(s， 3H) ； 13C NMR(125MHz， D2O) ： 136.86， 128.90， 128.89， 128.63， 103.47， 103.29， 101.27， 100.63， 79.14， 78.93， 77.57， 75.58， 75.14， 75.01， 74.74， 73.14， 72.44， 71.68， 71.18， 71.08， 70.61， 6

25、9.15， 68.03， 67.82， 61.22， 60.74， 60.53， 60.42， 52.86， 22.50 ； 0041 实施例 3 ： Gb5-OBn 的制备 0042 0043 Gb4-OBn(797mg， 1mmole)， UDP-Glc(565mg， 1mmole) 加入到 250mL 三角瓶中， 加入 说 明 书 CN 102443598 A CN 102443615 A5/6 页 8 20mM Tris-HCl 缓冲液 150mL， 加入终浓度为 10mM 氯化锰， 最后加入 20 单位的 Gne2 和 50 单位的LgtD， 37反应10小时后过离子交换除去UDP等

26、， 最后使用活性炭纯化， 得白色固体 846mg， 收率 ： 88制备得到 Gb5-OBn 的数据 ： 0044 分子式 ： C39H61NO26 0045 分子量 ： 959 0046 形状 ： 白色粉末 0047 图谱数据 ： 1H NMR(500MHz， D 2O) ： 7.47-7.38(m， 5H， Ph)， 4.91(d， J 11.7Hz， 1H， PhCH2)， 4.88(d， J 3.8Hz， H-1 )， 4.74(d， J 11.8Hz， 1H， PhCH2)， 4.66(d， J 8.6Hz， 1H， H-1)， 4.52(d， J 8.1Hz， 1H， H-1)， 4

27、.48(d， J 7.8Hz， 1H， H-1)， 4.42(d， J 7.7Hz， 1H， H-1)， 4.35(t， J 6.3Hz， 1H)， 4.22(d， J 1.7Hz， 1H)， 4.15(d， J 2.7Hz， 1H)， 4.03(m， 1H)， 4.01(m， 1H)， 3.97(dd， J 12.5， 1.6Hz， 1H)， 3.94(dd， J 10.1， 2.9Hz， 1H)， 3.91-3.85(m， 4H)， 3.82(d， J 4.4Hz， 1H)， 3.79(d， J 4.4Hz， 1H)， 3.78-3.69(m， 6H)， 3.68-3.65(m， 3H)，

28、 3.64-3.61(m， 2H)， 3.60-3.53(m， 4H)， 3.50(dd， J 9.9， 7.9Hz， 1H)， 3.32(t， J 8.6Hz， 1H)， 1.99(s， 3H， CH3CONH) ； 13C NMR(125MHz， D 2O) ： 175.2， 136.6， 128.8， 128.76， 128.5， 104.8， 103.3， 103.0， 101.0， 100.4， 79.6， 78.8， 78.7， 77.3， 75.5， 75.0， 74.9， 74.6， 73.0， 72.5， 72.2， 71.5， 70.9， 70.6， 70.3， 69.0，

29、 68.6， 68.0， 67.6， 61.4， 61.0， 60.98， 60.4， 60.3， 60.1， 59.4， 51.5， 22.3 ； 0048 实施例 4 ： Globo-H-OBn 的制备 0049 0050 Gb5-OBn(959mg， 1mmole)， UDP-Glc(587mg， 1mmole) 加入到 250mL 三角瓶中， 加入 20mM Tris-HCl缓冲液150mL， 加入终浓度为10mM氯化锰， 最后加入50单位的WbsJ， 37反 应 10 小时后过离子交换除去 GDP 等， 最后使用活性炭纯化， 得白色固体 1003mg， 收率 ： 90 0051 制备

30、得到 Globo-H-OBn 的数据 ： 0052 分子式 ： C45H71NO30 0053 分子量 ： 1106 0054 形状 ： 白色粉末 0055 图谱数据 ： 1H NMR(500MHz， D 2O) ： 7.46-7.38(m， 5H， Ph)， 5.20(d， J 4.1Hz， 1H， H-1 )， 4.91(d， J 11.7Hz， 1H， PhCH2)， 4.86(d， J 3.9Hz， 1H， H-1 )， 4.74(d， J 11.6Hz， 1H， PhCH2)， 4.59(d， J 7.7Hz， 1H， H-1)， 4.53(d， J 7.4Hz， 1H， H-1)，

31、 4.51(d， J 6.7Hz， 1H， H-1)， 4.48(d， J 7.7Hz， 1H， H-1)， 4.35(t， J 6.4Hz， 1H)， 4.22-4.18(m， 2H)， 4.07(d， J 2.1Hz， 1H)， 4.00(d， J 3.0Hz， 1H)， 3.98-3.94(m， 3H)， 3.91(dd， J 10.6， 2.8Hz， 1H)， 3.88-3.84(m， 3H)， 3.83-3.79(m， 3H)， 3.77-3.72(m， 6H)， 3.70-3.65(m， 说 明 书 CN 102443598 A CN 102443615 A6/6 页 9 4H)，

32、 3.64-3.60(m， 4H)， 3.58-3.53(m， 3H)， 3.33(t， J 8.6Hz， 1H)， 2.01(s， 3H， CH3CONH)， 1.19(d， J 6.6Hz， 3H， CH3 of fucose) ； 13CNMR-DEPT(125MHz， D 2O) ： 128.8， 128.77， 128.5， 104.0， 103.3， 102.1， 101.0， 100.5， 99.3， 78.9， 78.4， 77.2， 76.4， 76.2， 75.5， 75.1， 74.9， 74.7， 74.6， 73.6， 73.0， 72.7， 71.9， 71.5， 70.9， 70.7， 70.2， 69.6， 69.2， 69.17， 68.5， 68.1， 67.9， 66.8， 61.0， 61.00， 60.4， 60.37， 60.1， 51.7， 22.3， 15.4。 说 明 书 CN 102443598 A CN 102443615 A1/3 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102443598 A CN 102443615 A2/3 页 11 说 明 书 附 图 CN 102443598 A CN 102443615 A3/3 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102443598 A