包括结核分枝杆菌复合群分枝杆菌的分枝杆菌培养基和培养方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102449137 A (43)申请公布日 2012.05.09 CN 102449137 A *CN102449137A* (21)申请号 200980153939.9 (22)申请日 2009.10.20 0858311 2008.12.05 FR C12N 1/20(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (71)申请人 地中海 ( 埃克斯 - 马赛第二 ) 大学 地址 法国马赛 申请人 马赛公立医院 (72)发明人 M德朗古 D拉乌尔 (74)专利代理机构 永新专利商标代理有限公司 72002 代理人 左路 林晓红 (54) 发明名称 包括结核

2、分枝杆菌复合群分枝杆菌的分枝杆 菌培养基和培养方法 (57) 摘要 本发明涉及新的分枝杆菌培养基， 特别是结 核分枝杆菌复合群的培养基， 所述培养基明显减 少培养分离时间， 并因此减少诊断分枝杆菌特别 是结核病分枝杆菌的时间。本发明的培养基含有 去纤维蛋白血液、 卵磷脂和去补体的胎牛血清。 本 发明还涉及培养和鉴定分枝杆菌、 特别是结核分 枝杆菌复合群的细菌的方法。 更具体而言， 本发明 涉及新的净化方法， 其中用氯己定处理所谓的新 的分离和分枝杆菌培养基中的生物学样品。本方 面还涉及通过本发明的固体培养基， 通过表型确 定分枝杆菌对抗生素敏感性的方法。 最后， 本发明 还涉及通过质谱分析法在

3、液相中进行鉴定的新方 法， 因此有助于明显缩短诊断分枝杆菌病特别是 结核的时间。为了进行质谱分析， 根据本发明， 分 析通过双离心直接由培养液所获得的细菌。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.07.05 (86)PCT申请的申请数据 PCT/FR2009/051997 2009.10.20 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/063911 FR 2010.06.10 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 21 页 附图 8 页 CN 102449160 A1/3 页 2 1. 分枝杆

4、菌培养基， 包含分枝杆菌生长因子并优选地包含无抗分枝杆菌活性的抗生 素， 其特征在于其包含下列附加成分 ： - 卵磷脂， 和 - 去纤维蛋白血液， 和 - 去补体胎牛血清。 2. 权利要求 1 所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于所含的所述卵磷脂的重量比为 0.1-5， 优选 0.5-1。 3. 权利要求 2 所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于所述卵磷脂是蛋黄卵磷脂。 4. 权利要求 1-3 中任一项所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于所含的所述血液的体积 比为 2.5-15， 优选 5-10。 5. 权利要求 4 所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于所述血液是去纤维蛋白兔血液或优 选地去纤维蛋白绵

5、羊血液。 6. 权利要求 1-5 中任一项所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于所含的所述去补体胎牛 血清的体积比为 2.5-25， 优选 10-20。 7. 权利要求 1-6 中任一项所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于其包含分枝杆菌的基础 培养基， 所述基础培养基除了蒸馏水外还包含下列成分 ： 硫酸铵、 硫酸镁、 硫酸铜、 硫酸锌、 枸橼酸钠、 枸橼酸铁铵、 氯化钠、 氯化钙、 磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠、 L- 谷氨酸、 生物素和吡哆 醇。 8. 权利要求 1-7 中任一项所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于所述无抗分枝杆菌活性 的抗生素是多粘菌素、 两性霉素 B、 萘啶酮酸、 甲氧苄啶、 阿洛西

6、林和万古霉素， 且所述培养 基还包含抗真菌剂， 优选两性霉素 B。 9. 权利要求 1-8 中任一项所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于所述培养基是液体培养 基。 10. 权利要求 9 所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于其包含基础培养基， 所述基础培养 基是参照号为 7H9 的 Middlebrook 液体培养基 ； 并包含分枝杆菌的下列附加生长因子 ： 酪 蛋白水解产物、 甘油、 聚山梨醇酯、 氯高铁血红素、 乳酸、 生物素、 聚氧乙烯硬脂酸酯、 牛血清 白蛋白、 葡萄糖和补充物 H。 11. 权利要求 1-8 中任一项所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于所述培养基是含有胶 凝剂的固体培养基，

7、所述胶凝剂优选地选自琼脂， 所述胶凝剂的重量比优选地为 0.5-5， 更优选地为 1-2。 12. 权利要求 11 所述的分枝杆菌培养基， 其特征在于其是参照号为 7H10 的 Middlebrook 类型的固体培养基， 添加有所述胶凝剂和分枝杆菌的下列附加生长因子 ： 油 酸 ； 牛白蛋白、 优选牛白蛋白的级份 V ； 葡萄糖 ； 过氧化氢酶和甘油。 13. 通过权利要求 1-12 中任一项所述的分枝杆菌培养基培养分枝杆菌的方法， 其特征 在于在 30-37的温度下， 在所述分枝杆菌培养基中， 加热含有所述分枝杆菌的样品， 所述 30-37的温度适合培养包含于所述样品中的分枝杆菌。 14.

8、权利要求 13 所述的培养分枝杆菌的方法， 其特征在于将含有结核分枝杆菌复合群 的细菌的样品于 37培养于所述分枝杆菌培养基中。 15. 权利要求 13 或 14 所述的培养分枝杆菌的方法， 其特征在于进行下列阶段 ： 权 利 要 求 书 CN 102449137 A CN 102449160 A2/3 页 3 - 培养可能含有分枝杆菌的生物学样品， 直到细菌的生长是可检测的， 和 - 通过染色试验鉴定所检测到的细菌是分枝杆菌属的细菌， 和 - 如果需要， 通过分子分析， 优选通过质谱分析法， 鉴定所述分枝杆菌的种类。 16.权利要求13-15中任一项所述的培养分枝杆菌的方法， 其特征在于在不

9、到15天、 优 选不多于 10 天内， 检测到所述结核分枝杆菌复合群的细菌的生长， 从而允许在不到 1 周内 检测 50的所述分枝杆菌。 17. 权利要求 13-16 中任一项所述的培养分枝杆菌的方法， 其中培养可能含有分枝杆 菌和污染性细菌的生物学样品， 所述污染性细菌的生长可抑制所述分枝杆菌生长， 所述方 法的特征在于 ： 1/ 用氯己定对所述培养基中的所述样品进行有限时期的初步阶段的初始净化， 以便将 氯己定的作用限制在针对除了分枝杆菌以外的其他细菌的活性， 优选在 1氯己定溶液中 处理约 15 分钟， 同时搅拌， 和 2/ 通过以下方式除去氯己定 ： 用中性缓冲液洗涤来自阶段 1/ 的

10、如此处理的样品， 随后 离心并回收含有如此灭活的污染性细菌和没有被灭活的分枝杆菌的细菌团， 将所述细菌团 接种于所述分枝杆菌培养基中。 18. 权利要求 17 所述的培养分枝杆菌的方法， 其特征在于所述分枝杆菌培养基是分枝 杆菌的液体培养基。 19. 权利要求 13-18 中任一项所述的培养分枝杆菌的方法， 其特征在于进行生物学样 品的培养， 所述生物学样品是从大便样品获得的。 20. 权利要求 13-19 中任一项所述的培养分枝杆菌的方法， 其特征在于所述培养基是 所述的分枝杆菌的液体培养基， 且通过定期分析培养容器中的氧浓度来检测所述分枝杆菌 的生长。 21. 权利要求 13-17 中任一

11、项所述的培养分枝杆菌的方法， 其特征在于所述培养基是 固体培养基， 且当在所述固体培养基中可观察到细菌菌落的形成时， 用肉眼检测所述分枝 杆菌的生长。 22. 权利要求 21 所述的培养分枝杆菌的方法， 其中使用固体培养基， 其特征在于进行 下述阶段， 其中 ： i/- 在存在不同的已知浓度的至少一种给定的抗生素的情况下， 将所述分枝杆菌， 优选 结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌， 培养于所述固体培养基中， 和 ii/- 测定抑制所述细菌的所有可见生长的抗生素的最小浓度， 所述抗生素优选地选 自 ： 利福平、 异烟肼、 乙胺丁醇、 吡嗪酰胺和链霉素。 23.权利要求22所述的培养分枝杆菌的方法，

12、其特征在于在阶段i/-， 将至少一试纸条 放置在所述固体培养基上， 其中沿着所述试纸条按浓度梯度浸有不同浓度的所述抗生素。 24. 权利要求 15-23 中任一项所述的培养和鉴定分枝杆菌的方法， 其特征在于通过分 子分析鉴定分枝杆菌属细菌的种类， 所述分子分析包括分析通过质谱分析法所获得的蛋白 特征谱， 并将其与用培养于相同培养条件下的不同种类的分枝杆菌的参照菌株的样品所获 得的一系列蛋白特征谱进行比较。 25.权利要求24和权利要求15-19中任一项所述的培养和鉴定生物学样品中的分枝杆 菌的方法， 其特征在于， 在所述分枝杆菌的液体培养基中培养所述生物学样品， 并且通过分 权 利 要 求 书

13、 CN 102449137 A CN 102449160 A3/3 页 4 子分析鉴定分枝杆菌属细菌的种类， 所述分子分析包括分析通过质谱分析法所获得的蛋白 特征谱， 并将其与用培养于相同培养条件下的多种分枝杆菌的参照菌株的样品所获得的一 系列蛋白特征谱进行比较， 并且为了进行质谱分析法， 根据下述阶段， 对直接从培养液通过 双离心所获得的细菌团进行分析 ： a- 通过在 90以上， 优选在 95， 加热 1 小时， 优选同时搅拌， 灭活培养的生物学样品 的细菌， 其中已经检测了所述样品中的细菌的生长， b- 以低速、 优选 500rev/min， 对所述的培养的生物学样品的上清液进行第一次离

14、心， 其中已经检测了所述样品中的细菌的生长， 进行所述第一次离心， 直到所述样品中所含的 血液中的红细胞发生沉淀， 和 c- 从阶段 b- 的第一次离心回收上清液， 并以高速、 优选至少 10,000rev/min、 优选约 14,000rev/min， 进行第二次离心， 进行所述第二次离心， 以便获得细菌团的沉淀， 和 d-优选地， 用中性缓冲液， 如PBS， 洗涤来自阶段c-的所述细菌团， 并进行化学处理， 优 选地用乙腈和三氟乙酸的混合物， 以便从所述细菌中分离蛋白， 从而使得它们可以通过质 谱分析法进行分析， 以及 e- 回收来自阶段 d- 的细菌蛋白团， 并将其放置在质谱分析板上。

15、权 利 要 求 书 CN 102449137 A CN 102449160 A1/21 页 5 包括结核分枝杆菌复合群分枝杆菌的分枝杆菌培养基和培 养方法 0001 本发明涉及分枝杆菌特别是结核分枝杆菌复合群 (Mycobacterium tuberculosis complex) 的分枝杆菌的新培养基， 其可显著减少通过培养进行分离的时间以及因此减少诊 断分枝杆菌病、 特别是结核的时间。 0002 本发明还涉及培养和鉴定分枝杆菌和特别是结核分枝杆菌复合群的细菌的方法。 0003 具体而言， 本发明涉及在所述用于分离和培养分枝杆菌的新培养基中净化生物学 样品的新方法。 0004 本发明还涉及，

16、 使用本发明的固体培养基中的培养物， 快速确定分枝杆菌特别是 结核分枝杆菌复合群对抗生素敏感性的表型的方法。 0005 最后， 本发明涉及通过质谱分析法进行液相鉴定的新方法， 从而有助于显著减少 诊断分枝杆菌病特别是结核的时间。 0006 分枝杆菌是通过 16S rRNA 基因测序和通过所谓的 “多基因座系统发育 (multilocus phylogeny)”分 析 被 归 类 于 放 线 菌 门 (Actinobacteria phylum) 的 细 菌 Mignard S， Flandrois JP.A seven-gene， multilocus， genus-wide approach

17、 to phylogeny of mycobacteria using supertrees.Int J Syst Evol Microbiol.2008 ； 58 ： 1432-41， 且其特征在于在它们的细胞壁中存在分枝菌酸和染色体具有 60的 高 G+C， 所述分枝酸赋予它们特别的染色亲和性 (Ziehl-Neelsen 染色 )Pfyffer GE.Mycobacterium ： general characteristics， laboratory detection， in staning procedures.In ： Murray Pr， Baron EJ， Jorgensen

18、 JH， Landry ML， Pfaller MA.Manual of Clinical Microbiology 9th Ed.Amercian Society for Microbiology， Washington DC ； 2007， pp.543-572。分枝杆菌属 (Mycobacterium) 包括 60 多个种， 包括分离自惰 性环境 ( 突然、 水 ) 的环境种类、 与动物有关的种类和严格的人类种类即麻风分枝杆菌 (Mycobacterium leprae)， 其是麻风病的病因Cole S et al.Massive gene decay in the leprosy ba

19、cillus.Nature 2001 ； 409 ： 1007-11。某些环境种类是造成人类机会性感染的 原因(例如鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium complex)的种类)， 且某些种类是造 成人畜共患病的原因， 特别是造成结核的结核分枝杆菌复合群的某些种类。 0007 分枝杆菌病的诊断基于来自人或动物临床样品的分枝杆菌属的种类之一的分离 和培养。根据这一观点， 分枝杆菌属包括不可培养的种类 ( 麻风分枝杆菌 )、 在培养不到 7 天产生可见菌落的快速生长的种类 ( 偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)、 溃疡 分枝杆菌 (Mycobact

20、erium ulcerans)、 脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus) 和缓 慢生长的种类， 所述缓慢生长的种类在培养 7 天以上， 或以常规实践， 在培养 3-8 周之间， 特别是用 Middlebrook 培养基， 产生可见菌落。在人类医学中， 鸟分枝杆菌复合群的种类 在培养 10-20 天后是可检测的， 而结核分枝杆菌复合群的种类需要 10-100 个活生物 /ml 样品和培养 6-8 周， 以便获得 100阳性样品 Colebunders R， Bastian I.A review of the diagnosis and treatment of smea

21、r-negative pulmonary tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis.2000 ； 4 ： 97-107。根据人类结核病例的数字重要性和严重性， 在结核的 说 明 书 CN 102449137 A CN 102449160 A2/21 页 6 诊断中， 确实在实验室技术上已经取得特别显著单独改善。实际上， 结核是由结核分枝杆 菌复合群 7 个种之一在人类和动物中引起的感染性疾病 ： 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)、 牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)( 和由其衍生的 BCG)、 非洲分枝杆菌

22、(Mycobacterium africanum)、 Mycobacterium canettii、 山羊分枝杆菌 (Mycobacterium caprae)、 田鼠分枝杆菌 (Mycobacterium microti) 以及海豹分枝杆菌 (Mycobacterium pinnipedii)Dye C.et al.Prospects for worldwide tuberculosis control under the WHO DOTS strategy.Lancet 1998 ； 352 ： 1886-91。世界健康组织 (WHO) 估计， 在 2006 年， 结核是造成 9.2 百万

23、新病例和 1.6 百万死亡的原因 World Health Organization.2008. Global tuberculosis control ： surveillance， planning， financing.WHO report. Geneva ： World Health Organization.WHO/HTM/TB/2008.393。这些数字强调了优化结核 的微生物诊断以便改善患者和其家人朋友的医药管理的重要性。 0008 结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的分离和培养， 从表现出表示结核的病征和症状 的患者获得的临床样品开始。最常见的临床形式也是传染性的唯一临床形式， 是肺

24、结核， 其通过从呼吸样品分离和培养结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌来诊断， 所述呼吸样品如 痰、 支气管抽吸物、 支气管镜检获得的支气管肺泡灌洗液或肺部活检。在不产生痰的患者 中， 在肺结核的情况下， 胃抽吸液可以用作分离和培养结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的 可选方案。还存在结核的其他临床形式， 特别是淋巴结核和骨结核 ( 卜德氏病 (Pott s disease) 以及消化道结核。取决于临床形式， 可将不同的临床样品送往实验室， 供分离和 培养结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌并诊断肺部外形式。 0009 固体培养基、 液体培养基以及具有固相和液相的两相培养基可用于分离和培养结 核分枝杆菌复合群的分枝

25、杆菌。固体培养基基于琼脂制造。通常使用含有全卵的培养基， 并且最常用的培养基是罗氏培养基 (Lowenstein-Jensen medium)。该培养基和其他含有 卵的培养一样， 含有有助于抑制污染性微生物生长的孔雀绿。已经提出了几种含有不同浓 度的孔雀绿的制剂， 恒定的结果是， 孔雀绿浓度的降低增加培养基污染的比例， 且孔雀绿浓 度的增加倾向于降低结核组分枝杆菌的分离和培养。另一类固体培养基包括琼脂培养基 特别是 Middlebrook 7H10 培养基和培养基 7H11( 培养基 7H10 加 0.1水解的酪蛋白 )。 Middlebrook 培养基含有促进鸟分枝杆菌复合群的分枝杆菌的培养

26、的 2甘油。液体培养 基基本上与 Middlebrook 7H9 培养基一致。 0010 然而， 结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的分离非常缓慢， 因为各种结核分枝杆菌 复合群种类的所有菌株在 6-8 周的时间内分离。因此， 该时间的任何减少都代表了结核和 其他分枝杆菌感染的实验室诊断的显著改善。 0011 在多次努力后， 本发明开发了培养基的新配方， 从而允许更快速地分离结核分枝 杆菌复合群的分枝杆菌和分枝杆菌， 特别是允许从临床样品开始， 在不到 15 天内， 甚至在 10天内检测和鉴定。 本发明的培养基配方允许在适合装置或自动检测的液体培养基中和在 手工检测的固体培养基中分离分枝杆菌， 另外

27、， 在可能包含呈现抑制分枝杆菌生长风险的 共生菌群细菌的临床样品的情况下， 其与用氯己定净化相容。 0012 更准确而言， 本发明提供了分枝杆菌培养基， 包含分枝杆菌生长因子和优选地无 抗分枝杆菌活性的抗生素， 其特征在于， 其包含下列附加成分 ： 0013 - 卵磷脂， 和 说 明 书 CN 102449137 A CN 102449160 A3/21 页 7 0014 - 去纤维蛋白血液， 和 0015 - 去补体胎牛血清。 0016 因此， 本发明发现， 组合添加去纤维蛋白血液、 卵磷脂以及去补体胎牛血清满足了 本发明的目的， 特别是在由液体培养液直接培养和鉴定的情况下。 0017 胎牛

28、血清是经常用于细胞培养和细胞内微生物分离但不是用于分离细胞外细菌 的组分的试剂。 0018 以已知的方式， 通过加热、 特别是在 56加热 1 小时， 使胎牛血清去补体， 即从胎 牛血清中去除所有称为 “血清补体” 的蛋白。已知该血清补体具有抗菌活性。 0019 应当理解， 本发明的分枝杆菌培养基由已知用于培养分枝杆菌的基础培养基构 成， 特别是， 包含矿物盐、 糖、 氨基酸、 蛋白以及维生素的基础培养基， 所述基础培养基补充 有上文提到的所述附加成分。 0020 根据实施本发明的优选特征 ： 0021 - 所含的卵磷脂的重量比为 0.1-5， 优选 0.5-1， 0022 - 卵磷脂是蛋黄卵

29、磷脂， 0023 - 所含的去补体胎牛血清的体积比为 2.5-25， 优选 10-20， 0024 - 所含血液的体积比为 2.5-15， 优选 5-10， 0025 - 血液是去纤维蛋白的兔血液， 或优选去纤维蛋白的绵羊血液。 0026 更具体而言， 本发明的分枝杆菌培养基包含分枝杆菌基础培养基， 除了蒸馏水以 外， 所述基础培养基还包含下列成分 ： 硫酸铵、 硫酸镁、 硫酸铜、 硫酸锌、 枸橼酸钠、 枸橼酸铁 铵、 氯化钠、 氯化钙、 磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠、 L- 谷氨酸、 生物素以及吡哆醇。特别是， 这些 成分是称为 Middlebrook 培养基的分枝杆菌培养基所含的成分。 002

30、7 在实践中， 这种培养基最初采用上文所列成分的冻干物形式， 用于在蒸馏水中稀 释， 以便形成本发明的培养基。 0028 更具体而言， 所述无抗分枝杆菌活性的抗生素是多粘菌素、 萘啶酮酸、 甲氧苄啶、 阿洛西林和万古霉素， 且培养基含包含抗真菌剂， 优选两性霉素 B。 0029 上文提到的抗生素和抗真菌剂的组合， 例外是万古霉素， 构成了本领域技术人员 已知的称为 PANTA 的组合。 0030 根据本发明的第一实施方案， 所述培养基是液体培养基。 0031 更具体而言， 本发明的分枝杆菌培养基包含 ： 基础培养基， 其是参照号为 7H9 的 Middlebrook 液体培养基 ； 和分枝杆菌

31、的下列附加生长因子 ： 酪蛋白水解产物、 甘油、 聚山 梨醇酯、 氯高铁血红素、 乳酸、 生物素、 聚氧乙烯硬脂酸酯、 牛血清白蛋白、 葡萄糖和优选补 充物 H(supplement H)。补充物 H 是高度精炼的酪蛋白消化物。 0032 根据本发明培养基的第二实施方案， 所述培养基是含有优选选自糖的胶凝剂的固 体培养基， 所述胶凝剂的重量比为 0.5-5， 更优选 1-2。 0033 更具体而言， 所述培养基是参照号为 7H10 的 Middlebrook 类型的含水固体培养 基， 添加有所述胶凝剂和分枝杆菌的下列附加生长因子 ： 油酸、 牛白蛋白优选牛白蛋白的级 份V、 葡萄糖、 过氧化氢

32、酶以及甘油。 包含于培养基7H10的孔雀绿是除了分枝杆菌以外的细 菌的生长抑制剂。上文提到的分枝杆菌的附加生长因子， 除了甘油， 由名称 OADC 因子而知 名。 说 明 书 CN 102449137 A CN 102449160 A4/21 页 8 0034 本发明还提供了通过本发明的分枝杆菌培养基培养分枝杆菌的方法， 其特征在 于， 在适于培养包含于样品中的分枝杆菌种类的 30-37温度下， 在上述分枝杆菌培养基 中， 孵育含有上述分枝杆菌的样品。 0035 大 多 数 分 枝 杆 菌 培 养 于 37 下。 然 而 某 些 分 枝 杆 菌， 如 海 分 枝 杆 菌 (Mycobacter

33、ium marinum)、 嗜血分枝杆菌 (Mycobacterium haemophilum)、 溃疡分枝杆 菌， 培养于 28 -30的温度下。楚尔盖分枝杆菌 (Mycobacterium szulgai) 可以培养 于 25 -37之间， Mycobacterium conspicuum 培养于 22 -31之间。蟾蜍分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi)和石氏分枝杆菌(Mycobacterium shimoidei)的最佳生长温度为 45。 细菌日内瓦分枝杆菌(Mycobacterium genavense)、 堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasi

34、i)、 偶发分枝杆菌， 鸟分枝杆菌复合群的细菌， 即鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)、 胞内分枝杆菌 (Mycobacterium intracellulare)、 嵌合分枝杆菌 (Mycobacterium chimaera) 以及 Mycobacterium colombiense 都培养于 37。 0036 更具体而言， 在本发明的分枝杆菌培养方法中， 将含有结核分枝杆菌复合群的细 菌的样品在 37的温度下培养于上述分枝杆菌培养基中。 0037 本发明的分枝杆菌培养方法还涉及结核分枝杆菌复合群以外的分枝杆菌， 如上文 所提到的那些分枝杆菌， 特别是海分枝杆菌、 鸟分

35、枝杆菌复合群的种类、 嗜血分枝杆菌、 蟾 蜍分枝杆菌、 脓肿分枝杆菌复合群的种类、 日内瓦分枝杆菌、 堪萨斯分枝杆菌、 溃疡分枝杆 菌以及偶发分枝杆菌。 0038 在此，“结核分枝杆菌复合群的细菌” 表示结核分枝杆菌、 牛分枝杆菌和其克隆或 BCG 亚种、 非洲分枝杆菌、 Mycobacterium canettii、 山羊分枝杆菌、 田鼠分枝杆菌以及海豹 分枝杆菌种类的细菌。 0039 有利的是， 在本发明的分枝杆菌培养方法中， 进行下列 4 个阶段 ： 0040 - 培养可能含有分枝杆菌的生物学样品， 直到细菌的生长是可检测的， 和 0041 - 通过染色试验， 优选 Ziehl-Neel

36、sen 或 Kinyoun 染色试验， 鉴定所检测的细菌是 分枝杆菌属的细菌， 和 0042 - 如有需要， 通过分子分析， 优选通过质谱分析法分析细菌蛋白的分子量， 鉴定所 述分枝杆菌属的种类。 0043 Kinyoun 染色包括双染色， 连续用碱性 sushine(basic fushine) 处理和用亚甲蓝 处理。当在蓝色细胞背景下有红色细菌染色时， 染色是阳性的。 0044 所下文所解释的， 分子分析方法是分析细菌蛋白的方法， 特别是通过利用质谱 分析法测定它们的分子量。然而， 可选地， 可能的是， 借助于用对不同分枝杆菌种类具有 特异性的探针 / 或扩增引物的基因组 (DNA 或 R

37、NA) 分子鉴定的经典方法， 特别是申请 WO 2008/050064 中所述。特别是， 为了检测结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌， 借助于称为多间 隔序列分型 (multispacer sequence typing， 在本文中缩写为 MST) 的系统是可能的， 所述 系统由一系列结核分枝杆菌复合群细菌基因组非编码基因间区 (noncoding intergenic zone) 的核酸的片段构成， 所述片段构成了这样的基因标记， 其允许通过分析称为 MST 的所 述区的片段的序列鉴定结核分枝杆菌复合群的不同种类并对结核分枝杆菌复合群的一相 同 (one and the same) 种类的分离物、

38、 特别是结核分枝杆菌的分离物进行基因分型。 0045 有利的是， 在不到 15 天内， 优选在不多于 10 天内， 检测结核分枝杆菌复合群的细 说 明 书 CN 102449137 A CN 102449160 A5/21 页 9 菌生长因子。 0046 此外， 本发明的培养基允许在不到 1 周内检测 50的所有各种主要的分枝杆菌种 类， 即海分枝杆菌、 鸟分枝杆菌、 结核分枝杆菌复合群细菌， 即细菌结核分枝杆菌、 牛分枝杆 菌、 非洲分枝杆菌、 Mycobacterium canettii、 山羊分枝杆菌、 海豹分枝杆菌以及田鼠分枝 杆菌。 0047 在包括培养可能含有分枝杆菌和污染性细菌的

39、生物学样品的优选实施方案中， 所 述污染性细菌的生长抑制分枝杆菌的生长， 所述方法的特征在于 ： 0048 1/ 用氯己定对所述培养基中的所述样品进行有限时期的初步阶段的初始净化， 以 便将氯己定的作用限制在针对除了分枝杆菌以外的其他细菌的活性， 优选在 1氯己定溶 液中处理约 15 分钟， 同时搅拌， 和 0049 2/ 通过以下方法除去氯己定 ： 用中性缓冲液洗涤由阶段 1/ 因此处理的样品， 随后 离心并回收含有因此失活的污染性细菌和没有失活的分枝杆菌的细胞团， 将所述细胞团接 种于上述分枝杆菌培养基中。 0050 以前， 将作为净化剂的氯己定的用途限于在固体培养基中净化样品， 因为氯己

40、定 导致液体培养基沉淀。此外， 已知氯己定大体上对分枝杆菌是有毒性的。然而， 本发明发 现， 培养基中卵磷脂的存在一方面使得避免或延迟液体培养基沉淀是可能的， 另一方面， 通 过应用所述洗涤阶段 2/， 氯己定的时间限制作用使得抑制随后的氯己定抗分枝杆菌的活性 是可能的。 然而， 氯己定保存其抗共生菌群的细菌的主要活性， 所述抗共生菌群的细菌在上 文中称为污染性细菌， 其生长可抑制分枝杆菌的生长。 0051 特别是， 对于已知是共生菌群的携带者的生物学样品， 如来自痰、 皮肤活检、 大便 样品的样品， 它们代表了可用于分枝杆菌分析的 95的生物学样品， 应用该初步净化阶段。 然而， 对于诸如从

41、血培养物或淋巴结活检或肺活检或骨活检获得的样品的生物学样品， 并 不需要该净化。 0052 因此， 当所述分枝杆菌培养基是分枝杆菌的液体培养基时， 上文的方法特别有利。 0053 当所述生物学样品是大便样品时， 上文的方法也特别有利。 0054 在一实施方案中， 所述培养基是上述分枝杆菌的液体培养基， 并通过定期分析培 养容器中氧浓度检测所述分枝杆菌的生长。 0055 优选地， 最多每 3 小时， 测量氧浓度， 直到到达氧浓度的阈值， 优选与对应于至少 104个细菌 /ml 的细菌生长一致。 0056 通过测量氧浓度检测细菌的这一方法是已知的， 并且自动检测的装置可商购获 得。 取决于用于自动

42、检测的装置， 分枝杆菌的最小浓度不同并且通常对应于103-104个分枝 杆菌 /ml 的浓度， 从所述最小浓度开始， 检测到显著的氧消耗和因此氧浓度的显著减低。 0057 在另一实施方案中， 所述培养基是固体培养基， 且当可在所述固体培养基上观察 到细菌菌落形式时， 用肉眼检测到所述分枝杆菌的生长。 0058 通常， 观察到细菌菌落的形成， 对应于 106个细菌 /ml 的细菌浓度。 0059 在本发明方法的优选实施方案中， 通过分子分析鉴定分枝杆菌属细菌的种类， 所 述分子分析包括分析通过质谱分析法所获得的蛋白特征谱， 并将其与用培养于相同培养条 件下的不同种类的分枝杆菌的参照菌株的样品所获

43、得的一系列蛋白特征谱进行比较。 0060 在此，“相同的培养条件” 表示， 对于分枝杆菌的一个相同种类， 在相同的培养温度 说 明 书 CN 102449137 A CN 102449160 A6/21 页 10 下， 使用相同的培养基。 0061 本发明还提供了培养和鉴定生物学样品中分枝杆菌的方法， 其特征在于将所述上 文样品培养于上述分枝杆菌液体培养基中， 并为了进行质谱分析， 根据下列阶段， 直接由培 养液分析通过双离心所获得的细菌团 ： 0062 a- 通过在 90以上， 优选在 95， 加热 1 小时， 优选同时搅拌， 灭活培养的生物学 样品悬浮液中的分枝杆菌， 其中已经检测了所述样

44、品中的细菌的生长， 和 0063 b- 以低速、 优选 500rev/min， 对所述的培养的生物学样品的上清液进行第一次离 心， 其中已经检测了所述样品中的细菌的生长， 进行所述第一次离心， 直到所述样品中所含 的血液中的红细胞发生沉淀， 和 0064 c-由阶段a-的第一次离心回收上清液， 并以高速、 优选至少10,000rev/min、 优选 约 14,000rev/min， 进行第二次离心， 进行该第二次离心， 以便获得细菌团的沉淀， 和 0065 d- 优选地， 用中性缓冲液， 如 PBS， 洗涤来自阶段 b- 的所述细菌团， 并进行化学处 理， 优选地用乙腈和三氟乙酸的混合物， 以

45、便从细菌中分离蛋白， 从而使得它们可以通过质 谱分析法分析， 以及 0066 e- 回收来自阶段 d- 的细菌蛋白团， 并将其存放在质谱分析板上。 0067 阶段 a- 的灭活方法经证明， 与阶段 e- 中获得质量良好的质谱相容。 0068 通过质谱分析法直接从液体培养基的样品鉴定的这一方法由于其快速性而特别 有利， 因为在现有技术中， 质谱分析法仅用于分析直接从固体培养基采集的细菌菌株。因 此， 如果是培养于液体培养基的临床样品， 在通过质谱分析法鉴定之前， 再接种细菌并随后 将其培养于固体培养基上， 取决于分枝杆菌的类型， 这另外花费 3-8 周的时间， 特别是对于 结核分枝杆菌复合群的细

46、菌而言， 在所述固体培养基上培养 6-8 周。 0069 根据本发明， 可以直接由获得自液体培养基的细菌团进行质谱分析。 0070 总之， 考虑到上文的加热阶段和离心阶段 a- 至 e- 的时间， 通过培养， 在检测所述 细菌的生长后约 1.5h， 通过质谱分析法获得蛋白分析谱是可能的， 所述蛋白分析谱， 如上 述， 在结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的情况下， 可以在不多于 15 天甚至 10 天内获得。 0071 本发明还涉及快速确定分枝杆菌特别是结核分枝杆菌对抗生素的敏感性的表型 的方法。 0072 结核的治疗基于组合了5种抗生素的综合化学疗法， 所述5种抗生素为利福平、 异 烟肼、 乙胺丁

47、醇以及吡嗪酰胺， 它们与链霉素一起称为一线抗结核药物。在全世界， 已经出 现了抗利福平和抗异烟肼的称为 “多药物抗性的” 的结核杆菌菌株 (MDR-TB)， 和抗性广泛的 菌株 (XDR-TB)， 所述抗性广泛的菌株 (XDR-TB) 是还对二线抗结核药物 ( 氟喹诺酮、 氨基糖 苷、 卷曲霉素)有抗性的MDR-TB菌株Gagneux S.Clin Infect Dis.2009 ； 15 ： S1 ： 66-68。 在法国， 它们的流行程度据估计为 15。术语 “原发性抗性” 指分离自从未接受抗结核治疗 的患者的抗性菌株， 术语 “继发性抗性” 指， 分离自在分离菌株之前已经由抗结核治疗获利

48、 的患者的抗性菌株 Schluger NW， Up-to-date 2009。 0073 结核分枝杆菌复合群的抗性菌株造成了治疗难题， 因为它们需要给予二线抗结核 药物， 所述二线抗结核药物具有以下缺陷 ： 0074 (1) 它们不及第一线抗结核抗生素有效， 0075 (2) 与第一线抗结核抗生素相反， 它们必须以胃肠外的方式给予， 说 明 书 CN 102449137 A CN 102449160 A7/21 页 11 0076 (3) 它们比第一线抗结核抗生素更具毒性。 0077 因为结核的预后与有效抗生素的给药有关， 因此绝对需要以可能最短的延迟确定 菌株对抗结核药物的敏感性(抗菌谱)。

49、 检测靶基因中突变存在的基因分型方法， 基于并非 广泛可用的技术和专门技能 Woods GL， Warren NG， Inderlind CB.Susceptibility test methods ： Mycobacteria， Nocardia， and other actinomycetes in ： Annual of Clinical Microbiology， 9th edition(Nurray PR， Baren EJ， Jorgensen JH， Bry NL， Psaller MA.American Society for Microbiology， 2007， page 1223-1247。对于除了利福平以外 的抗生素， 靶基因的突变和抗性表型之间的统计关联非常低。这是为何对表型试验有这类 兴趣的原因。在液体培养基中， 后者可以是自动化的 ； 但是， 该技术仅允许每种菌株试验一 种或两种浓度的抗生素， 并且对结核分枝杆菌的抗性和污染性菌株间的混乱耐受 Anthony RM et al.Int J Tuberc Lung Dis.2009 ； 13 ： 1051-1053。 因此， 优选在固体培养基中进行 该试验， 从而允许区分污染性菌落。这些试验基于， 在存在已知浓度的抗生素的情况下， 相 对于无抗生素而生长的对照，