重组系统.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201380024889.0 (22)申请日 2013.03.12 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104981542 A (43)申请公布日 2015.10.14 (30)优先权数据 12159094.7 2012.03.12 EP (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.11.12 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2013/055047 2013.03.12 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/135728 EN 2013.0

2、9.19 (83)生物保藏信息 CBS 513.88 1988.08.10 (73)专利权人 帝斯曼知识产权资产管理有限公 司 地址 荷兰海尔伦 (72)发明人 娜塔丽维森哈恩 凯瑟琳娜佩特罗内拉安东尼 娅玛丽亚科伦 伯纳德迈瑞克维克多布尔 约翰尼斯安德列什劳博斯 伊万内约翰内斯奥迪利亚亚 伦德森 (74)专利代理机构 北京东方亿思知识产权代理 有限责任公司 11258 代理人 肖善强 (51)Int.Cl. C12N 15/63(2006.01) C12N 15/90(2006.01) C12N 15/00(2006.01) C12N 5/00(2006.01) (56)对比文件 US 20

3、03199037 ,2003.10.23, CN 1617927 ,2005.05.18, CN 102296059 ,2011.12.28, Bang-Jau You et al.Gene-speciWc disruption in the Wlamentous fungus Cercospora nicotianae using a split- marker approach. Arch Microbiol .2009, 615-622. Andreas F. Kolb.Selection-marker-Free Modification of the Murine -Casein Us

4、ing a Lox2722 site. Analytical Biochemistry .2001,摘要， 261-262页. 审查员 滕文静 (54)发明名称 重组系统 (57)摘要 本发明涉及在靶位点进行重组的方法， 该方 法包括： 提供两种或更多种核酸， 它们总共包含： (a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列； (b) 两个或更多个位点特异性重组位点； 和(c)编码 识别位点特异性重组位点的重组酶的序列， 其中 所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而 产生单一核酸， 并且其中所述两种或更多种核酸 中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶 的序列； 以及使所述两种或更多种核酸相互重组

5、以及与靶位点的侧翼序列重组， 以在靶位点插入 编码有功能重组酶的连续核酸序列， 所述编码重 组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组 位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能 够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。 权利要求书2页 说明书21页 序列表32页 附图4页 CN 104981542 B 2018.10.16 CN 104981542 B 1.在靶位点进行重组以添加新的序列、 置换现存的序列和/或缺失现存的序列的方法， 该方法包括： -提供两种或更多种核酸， 它们总共包含： (a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列； (b)两个或更多个位点特异性重组位点； 和(c)编码识别所述位点特异

6、性重组位点的重组酶 的序列， 其中所述两种或更多种核酸都不包含(a)、 (b)和(c)中所描述的全部序列， 其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸， 其中所述核酸的末 端被设计为使得所述核酸以期望的方向和顺序被组装以产生所述单一核酸， 并且 其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列； 以 及 -将所述两种或更多种核酸引入宿主细胞以使重组到所述宿主细胞能够发生， 以及 -使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组， 以在靶位点插入 编码有功能重组酶的连续核酸序列和至少两个位点特异性重组位点， 所述编码重组酶的序 列的侧翼是至少两个位点

7、特异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与 靶位点的侧翼序列同源重组的序列， 其中核酸的相互重组以及与靶位点侧翼序列的重组在 真菌细胞体内进行； 其中： 所述位点特异性重组位点是lox位点并且所述重组酶是Cre； 所述 位点特异性重组位点是FRT位点并且所述重组酶是Flp； 所述重组位点是Vlox位点并且所述 重组酶是VCre； 或所述重组位点是Slox并且所述重组酶是SCre。 2.根据权利要求1的方法， 其中所述两种或更多种核酸总共包含能够与两个或更多个 靶位点的侧翼序列同源重组的序列， 以使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点侧 翼序列重组， 导致在每个靶位点插入至少两个

8、位点特异性重组位点， 其中： 编码有功能重组酶的连续核酸序列存在于位置在至少两个位点特异性重组位点之间 的至少一个靶位点， 以及 所述位点特异性重组位点的侧翼为能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列。 3.根据权利要求1或2的方法， 其中至少两种核酸中的两种各包含编码无功能的部分重 组酶的序列， 以使它们总共包含编码有功能的重组酶的核酸序列。 4.根据权利要求1的方法， 其包括表达重组酶以使位置在所述位点特异性重组位点之 间的序列被外重组。 5.根据权利要求4的方法， 其中所述重组酶的表达受诱导型启动子的控制。 6.根据权利要求1的方法， 其中所述两种或更多种核酸总共包含编码标记的序列， 以使 两

9、种或更多种核酸的重组导致在靶位点或多个靶位点插入所述标记基因编码序列， 从而其 位于至少两个能够与靶位点或多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列之间。 7.根据权利要求2的方法， 其中所述两种或更多种核酸总共包含两种或更多种不同的 编码标记的序列， 以使所述两种或更多种核酸的重组导致在各靶位点插入不同的标记基因 编码序列。 8.根据权利要求6的方法， 其中所述两种或更多种核酸的重组导致在靶位点插入所述 编码标记的序列， 从而其位置在位点特异性重组位点之间并且能够通过重组酶的表达从靶 位点被外重组。 9.根据权利要求4的方法， 其中位点特异性重组位点之间的核酸序列的外重组在体内 进行。 权利要求书

10、1/2 页 2 CN 104981542 B 2 10.根据权利要求1的方法， 其中所述真菌细胞是酵母细胞。 11.根据权利要求1的方法， 其中所述真菌细胞是丝状真菌细胞。 12.根据权利要求4的方法， 其中所述位点特异性重组位点使得重组酶表达后的外重组 在靶位点产生不被所述重组酶识别的单一突变位点特异性重组位点。 13.根据权利要求1的方法， 其中所述靶位点包含被破坏和/或部分或完全缺失的编码 序列。 14.根据权利要求10的方法， 其中所述酵母是S.cerevisiae或K.lactis。 15.根据权利要求11的方法， 其中所述丝状真菌细胞属于Aspergillus、 Penicilli

11、um、 Talaromyces或Trichoderma属的物种。 权利要求书 2/2 页 3 CN 104981542 B 3 重组系统 发明领域 0001 本发明涉及在靶位点进行重组的方法。 0002 发明背景 0003 不同的细胞类型可以用于不同的工业目的。 例如哺乳动物细胞系用于抗体生产； 真菌细胞是生产多肽和次级代谢物的优选生物； 细菌细胞优选用于小的代谢物和抗体的生 产； 植物细胞优选用于口味和风味化合物。 0004 重组技术广泛用于这样的细胞和/或使用这样的细胞的方法的生产力的最优化。 这可涉及大量的选择， 包括但是不限于过表达感兴趣的基因， 竞争途径的缺失或失活， 改变 酶的区室

12、化(compartmentalization)， 增加蛋白或代谢物分泌， 增加细胞器含量 (organelle content)等。 0005 就丝状真菌而言， 可获得的可选择标记有限使新细胞系的构建复杂化。 典型地， 靶 序列在体外被改变以产生带有插入的抗生素抗性标记的突变等位基因。 然而， 鉴于大规模 使用携带抗性基因的生产菌株将这种基因扩散到生物圈的潜在风险， 大多数国家的监管机 构反对使用抗生素抗性标记。 此外， 适用于丝状真菌的可选择标记数量有限。 因此， 可需要 除去可选择标记基因以使生产菌株可以在商业上使用和/或以使同样的标记基因可以在连 续的菌株修饰中再循环利用。 0006 发

13、明概述 0007 本发明涉及在例如靶基因组内在靶位点(target locus)或多个靶位点(target loci)进行重组的方法。 本发明所述的重组方法导致靶位点的改变， 例如在靶位点插入核酸 序列。 可实施所述的方法以使在靶位点插入新的序列并伴随从靶位点除去现存的序列。 也 就是说， 所述方法可被用于将靶位点上的序列替换为替代性序列。 所述方法可方便地在宿 主细胞体内实施。 0008 典型地， 当在体内实施时， 不对人类或动物细胞实施本发明所述的方法。 也就是 说， 典型地不以治疗方法的形式实施本发明所述的方法。 可以离体或体外方式实施本发明 所述的方法。 术语离体或体外应被理解为包括对

14、微生物(对完整活细胞或非细胞物质二者) 实施的方法， 但排除对人类或动物实施的方法。 0009 典型地， 实施所述方法使至少部分插入在靶位点的序列随后被移除。 如果实施所 述的方法以在靶位点替换序列并随后移除插入的序列， 那么结果可以是使靶位点的序列缺 失。 0010 因此， 可实施本发明所述的方法以改变靶位点的序列。 这种改变可以是， 例如添加 新的序列、 置换现存的序列和/或缺失/去除现存的序列。 0011 典型地， 本发明在宿主细胞体内进行。 宿主细胞可以优选地是生产感兴趣的化合 物的细胞。 宿主细胞可以在应用本发明方法之前能够生产感兴趣的化合物。 在这种情况下， 本发明的方法可以用于修

15、饰靶位点以使通过宿主细胞的感兴趣的化合物的生产改变， 例如 可以增加产量。 或者， 宿主细胞可以是由于应用本发明的方法而生产感兴趣的化合物的细 胞。 说明书 1/21 页 4 CN 104981542 B 4 0012 因此根据本发明， 提供了在靶位点进行重组的方法， 该方法包括： 0013 -提供两种或更多种核酸， 它们总共包含： (a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的 序列； (b)两个或更多个位点特异性重组位点； 和(c)编码识别位点特异性重组位点的重组 酶的序列， 0014 其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸， 并且 0015 其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各

16、包含编码无功能的部分重组酶的序 列； 以及 0016 -使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组， 以在靶位点 插入编码有功能重组酶的连续核酸序列， 所述编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特 异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组 的序列。 0017 附图简述 0018 图1阐述了通过直接整合的ICL1移除以及分开的cre重组酶(split-cre recombinase)构建体的体内重组的原理。 Cre-重组酶的表达受到GAL1启动子的调控。 0019 图2阐述了pMA Cre-1和pMA Cre-2(pSUC225)的质粒图。 pMA

17、 Cre-1包含lox66位 点， GAL1启动子和失活的Cre重组酶开放阅读框5 部分， pSUC225包含Cre重组酶开放阅读框 的3 失活部分、 CYC1终止子和lox71位点。 0020 图3阐述了pSUC227的质粒图。 所述质粒包含lox66位点， kanMX标记盒， GAL1启动子 和失活的Cre重组酶开放阅读框5 部分。 0021 图4阐述了利用引物对DBC-03670和DBC-03761扩增ICL1基因的基因组位点的PCR 反应， 在野生型情况下产生3449bp PCR片段， 和在标记被lox66和lox71的重组移除的KO情 况下产生1812bp PCR片段。 0022 图

18、5阐述了质粒pEPO-US的示意图， 其包含用于失活在A.niger和E.coli质粒DNA中 的epo基因的置换盒的部分。 该置换盒包含用于靶向的epo侧翼区域， 突变loxP位点， 功能性 hygB标记盒和可诱导的cre重组酶表达盒。 更多pEPO-US的细节可以在实施例部分找到(见 下)。 0023 图6阐述了质粒EPO-DS的示意图， 其包含用于失活在A.niger和E.coli质粒DNA中 的epo基因的置换盒的部分。 该置换盒包含用于靶向的epo侧翼区域， cre重组酶表达盒， 突 变loxP位点。 更多EPO-DS的细节可以在实施例部分找到(见下)。 0024 图7阐述了5 分开

19、的CRE片段和3 分开的CRE片段的片段产生以及如何在A.niger 的转化和靶向重组中使用这些重叠的片段的可行设计的示意图。 上图表示待靶向基因的基 因组DNA组成。 中间图显示通过PCR扩增的 “5 分开的CRE” 和 “3 分开的CRE” 片段的生成。 下 图显示通过基因组中5 分开的CRE和3 分开的CRE的同源重组的A.niger转化。 0025 序列表描述 0026 SEQ ID NO： 1阐述了Cre-1合成片段的核酸序列。 0027 SEQ ID NO： 2阐述了Cre-2合成片段的核酸序列。 0028 SEQ ID NO： 3阐述了pMA Cre1完全的核酸序列。 0029

20、SEQ ID NO： 4阐述了pMA Cre2(pSUC225)完全的核酸序列。 0030 SEQ ID NO： 5阐述了pUG7-EcoRV完全的核酸序列。 说明书 2/21 页 5 CN 104981542 B 5 0031 SEQ ID NO： 6阐述了引物DBC-02738的核酸序列。 0032 SEQ ID NO： 7阐述了引物DBC-02739的核酸序列。 0033 SEQ ID NO： 8阐述了带有kanMX标记PCR片段的pCR-Blunt II-TOPO载体的核酸序 列。 0034 SEQ ID NO： 9阐述了pSUC227的核酸序列。 0035 SEQ ID NO： 10

21、阐述了ICL1基因上游的5 侧翼片段的核酸序列。 0036 SEQ ID NO： 11阐述了引物DBC-03754的核酸序列。 0037 SEQ ID NO： 12阐述了引物DBC-03755的核酸序列。 0038 SEQ ID NO： 13阐述了ICL1基因下游的3 侧翼片段的核酸序列。 0039 SEQ ID NO： 14阐述了引物DBC-03758的核酸序列。 0040 SEQ ID NO： 15阐述了引物DBC-03759的核酸序列。 0041 SEQ ID NO： 16阐述了 “Cre-1-kanMX” 片段的核酸序列。 0042 SEQ ID NO： 17阐述了引物DBC-0375

22、6的核酸序列。 0043 SEQ ID NO： 18阐述了引物DBC-03373的核酸序列。 0044 SEQ ID NO： 19阐述了Cre-2片段的核酸序列。 0045 SEQ ID NO： 20阐述了引物DBC-03374的核酸序列。 0046 SEQ ID NO： 21阐述了引物DBC-03757的核酸序列。 0047 SEQ ID NO： 22阐述了引物DBC-03760的核酸序列。 0048 SEQ ID NO： 23阐述了引物DBC-03761的核酸序列。 0049 SEQ ID NO： 24阐述了DBC-03760和DBC-03761野生型ICL1的产物的核酸序列。 0050

23、SEQ ID NO： 25阐述了DBC-03760和DBC-03761ICL1缺失和kanMX标记和Cre重组酶 外重组的产物的核酸序列。 0051 SEQ ID NO： 26阐述了引物DBC-07072和引物DBC-08586的产物的核酸序列。 0052 SEQ ID NO： 27阐述了引物DBC-08585和引物DBC-04415的产物的核酸序列。 0053 SEQ ID NO： 28阐述了引物DBC-07072的核酸序列。 0054 SEQ ID NO： 29阐述了引物DBC-08586的核酸序列。 0055 SEQ ID NO： 30阐述了引物DBC-08585的核酸序列。 0056

24、SEQ ID NO： 31阐述了引物DBC-04415的核酸序列。 0057 发明详述 0058 在本说明书和所附权利要求书通篇中， 词语 “包括” 、“包含” 和 “具有” 应被解释为 包括性的。 也就是说， 在上下文允许时， 这些词语旨在表达可能包括未明确指出的其他要素 或整体。 0059 不使用数量词时表示一个或多于一个(即一个或至少一个)的客体。 例如，“要素” 可表示一个要素或多于一个要素。 0060 根据本发明所述的方法被用于在靶位点实施重组。 重组指的是核酸的分子被打断 然后被连上不同核酸分子的过程。 本发明的重组过程典型地涉及人工和有目的地重组不同 核酸分子(其可来自于相同或不

25、同生物体)以创造重组的核酸。 0061 术语 “重组” 的意思是， 例如核酸序列是通过人工组合两种否则分开的序列区段 (例如通过化学合成或通过用基因工程技术处理分离的核酸)得到的。 说明书 3/21 页 6 CN 104981542 B 6 0062 本发明所述的方法依赖于同源重组和位点特异性重组的结合。 0063 “同源重组” 指的是具有包含相似核苷酸序列的对应位点的核苷酸序列(即同源序 列)之间的反应， 通过所述反应分子能够相互作用(重组)以形成新的、 重组的核酸序列。 相 似核苷酸序列的位点在本文中被分别称为 “同源序列” 。 典型地， 同源重组的频率随着同源 序列的长度的增加而增加。

26、因此， 虽然同源重组能够在不完全相同的两种核酸序列之间发 生， 但随着两种序列之间的差异的增加， 重组频率(或效率)下降。 可使用将被结合的两种分 子的每一种上的一种同源序列以实现重组， 从而产生 “单交换” 的重组产物。 或者， 两种同源 序列可被放置将被重组的两种分子的每一种上。 供体上的两种同源序列和靶标上的两种同 源序列之间的重组产生 “双交换” 的重组产物。 0064 如果供体分子上的同源序列的侧翼是将被操作的序列(例如感兴趣的序列)， 那么 与靶分子的双交换重组将产生这样的重组的产物， 其中感兴趣的序列置换本来位于靶分子 上的同源序列之间的DNA序列。 0065 “位点特异性重组”

27、 (也被称为保守的位点特异性重组)是核酸链的交换发生在仅 具有有限程度的序列同源性的区段之间的一类重组。 位点特异性重组酶识别和结合短DNA 序列(位点)， 在此处切割DNA骨架、 交换参与的两种DNA螺旋并重新连接DNA链， 从而使核酸 区段重新排列。 在一些位点特异性重组系统中， 仅仅具有重组酶连同重组位点就足以执行 所有这些反应； 在另一些系统中， 可能还需要一些辅助蛋白和辅助位点。 0066 所述方法可被用于在靶位点实施重组以导致靶位点的修饰。 因此， 本发明可被用 于添加、 缺失或以另外的方式改变靶位点。 靶位点可以是编码序列或非编码序列。 可利用本 发明所述的方法以使这种编码或非编

28、码序列可被破坏和/或部分或完全缺失和/或置换。 因 此， 本发明所述的方法可被用于置换靶位点的序列， 例如用编码标记的序列。 0067 典型地， 在宿主细胞(例如微生物的细胞)体内实施本发明。 优选地， 宿主细胞可产 生感兴趣的化合物。 所述宿主细胞可以在应用本发明所述的方法之前能够产生感兴趣的化 合物。 在这种情况下， 本发明所述的方法可被用于修饰靶位点以使所述宿主细胞的感兴趣 的化合物的生产改变， 例如可以增加产量。 或者， 所述宿主细胞可以由于应用本发明所述的 方法而产生感兴趣的化合物。 0068 因此， 本发明可被用于， 例如最优化宿主细胞的生产力和/或使用它们的工艺。 或 者， 本发

29、明可被用以， 例如引入新的核酸以使宿主细胞能够产生感兴趣的新化合物。 本发明 可被连续使用以引入多个新的核酸序列至宿主细胞， 从而引入全新的通路代谢通路。 0069 靶位点可以是待修饰的任何核酸序列。 典型地， 靶位点可以是基因组(生物体的完 整遗传物质)内的序列， 例如染色体上的位点。 这种染色体可以是线型或环形的染色体。 然 而， 靶位点可以在染色体外， 例如质粒、 微型染色体或人工染色体上的位点。 靶位点可以位 于质粒、 噬菌体或任何其它能够在体外或在宿主细胞中复制或者被复制的核酸序列。 0070 本发明的方法可以在体外， 离体或体内进行。 0071 本发明的方法包括： 0072 -提供

30、两种或更多种核酸， 它们总共包含： (a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的 序列； (b)两个或更多个位点特异性重组位点； 和(c)编码识别位点特异性重组位点的重组 酶的序列， 0073 其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸， 并且 说明书 4/21 页 7 CN 104981542 B 7 0074 其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序 列； 以及 0075 -使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组， 以在靶位点 插入编码有功能重组酶的连续核酸序列， 所述编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特 异性重组位点以及所述位点特异性

31、重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组 的序列。 0076 本发明中， 两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序 列。 也就是说， 编码重组酶的序列在两种或更多种核酸中的至少两种之间分开。 因此， 该方 法可被称为分开重组酶法(split-recombinase approach)。 可以在体内实施位点特异性重 组位点之间的核酸序列的外重组。 0077 本发明所述的方法中， 体内重组可以在任何合适的宿主细胞中进行， 例如在原核 细胞或真核细胞中进行。 0078 在本发明的方法中， 在体内实施核酸的相互重组以及与靶位点的重组。 0079 本发明所述的方法中， 提供两种

32、或更多种核酸。 所述的两种或更多种核酸总共提 供： (a)能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列； (b)两个或更多个位点特异性重组位点； 和(c)编码识别位点特异性重组位点的重组酶的序列。 0080 这并不意味着两种或更多种核酸中的每一种都包含(a)、 (b)和(c)中所描述的序 列。 而是， 两种或更多种核酸被总合在一起成为组时， 这些核酸必须包含(a)、 (b)和(c)中所 描述的序列。 因此， 一种核酸可包含(a)、 (b)和(c)中所描述的一种或更多种序列， 第二种核 酸可包含(a)、 (b)和(c)中所描述的另一些序列。 典型地， 两种或更多种核酸中的每一种都 将包含(a)、 (b)

33、和(c)中所描述的至少一种序列。 然而， 也可以提供不包含(a)、 (b)或(c)中 所描述的至少一种序列的额外核酸。 0081 图1展示了所述方法的一种方式， 其中使用4种核酸， 但技术人员将很容易想到更 多的方式。 所述方法中使用的核酸的数目可以是2、 3、 4、 5、 6或更多。 0082 典型地， 编码重组酶的序列在两种核酸序列之间分开(这两种核酸序列中的每一 种都编码无功能的部分重组酶， 但当二者被重组时将编码有功能重组酶)。 然而， 编码重组 酶的序列可被分开为3种、 4种或更多种核酸序列。 0083 当编码重组酶的序列在两种核酸序列之间分开时， 典型地这两种序列中的每一种 都还可

34、以包含位点特异性重组位点。 图1中展示了这种方法。 或者， 位点特异性重组位点可 由能够与包含编码重组酶的序列的核酸序列重组的额外核酸序列提供。 0084 在本发明所述的方法中， 两种或更多种核酸能够相互同源重组以产生单一核酸。 由于能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列的存在， 核酸在靶位点作为单一连续序列整 合。 此外， 两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列。 0085 因此， 在本发明的方法中， 两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列 重组。 以这种方式， 编码有功能重组酶的连续核酸序列可与至少两个位点特异性重组位点 一起被插入至靶位点。 这种有功能的编码

35、编码的的序列典型地被插入在靶位点以使其侧翼 是至少两个位点特异性重组位点。 当重组酶表达时， 位于位点特异性重组位点之间的序列 可被外重组(out-recombined)。 如果重组酶序列位于位点特异性重组位点之间， 那么它将 被外重组。 然而， 如果重组酶序列位于位点特异性重组位点之外， 那么其将被保留在靶位 说明书 5/21 页 8 CN 104981542 B 8 点。 0086 当重组发生后， 位点特异性重组位点和重组酶序列的侧翼将会是能够与靶位点的 侧翼序列同源重组的序列。 0087 可实施本发明所述的方法以同时靶向多于1个(例如2、 3、 4、 5或更多个)靶位点。 在 这种方法中

36、， 所述两种或更多种核酸总共包含能够与两个或更多个靶位点的侧翼序列同源 重组的序列。 以这种方式， 所述两种或更多种核酸相互重组并与靶位点的侧翼序列重组， 从 而导致每个靶位点处插入至少两个位点特异性重组位点。 所提供的两个位点特异核酸使得 编码有功能重组酶的连续核酸序列被插入在至少一个靶位点， 任选地位于至少两个位点特 异性重组位点之间。 其它靶位点不必须地包含编码有功能重组酶的序列， 但每个靶位点将 包含至少两个位点特异性重组位点(可被重组酶靶向)。 也可实施本发明所述的方法以在所 有或一些靶位点插入编码重组酶的序列。 0088 再次， 在每个靶位点， 所述位点特异性重组位点以及任何编码重

37、组酶的序列的侧 翼都将是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。 0089 本发明的方法中， 所述两种或更多种核酸能够相互重组以产生单一核酸。 由于能 够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列的存在， 核酸在靶位点作为单一连续序列被整合。 0090 更详细地， 本发明所提供的两种或更多种核酸总共包含能够同源重组针对靶位点 的两个或更多个同源重组位点的序列。 典型地当所述方法靶向单一的靶位点时， 所述两种 或更多种核酸将提供两种这样的序列。 这些序列被提供以使包含至少两种或更多种核酸的 连续核酸序列(当被相互重组时)通过与靶序列侧翼的基本同源的序列重组而被插入在靶 位点。 0091 为了通过双交换事件实

38、现同源重组， 需要这些侧翼序列存在于通过所述两种或更 多种核酸的重组得到的连续序列的两侧/端且需要与靶位点两侧的序列基本同源， 这对技 术人员而言是显而易见的。 因此， 能够同源重组的序列典型地被提供以使它们位于通过所 述两种或更多种核酸的重组得到的核酸序列的 “5 ” 和 “3 ” 末端。 0092 此外， 根据本发明所提供的至少两种核酸能够相互重组。 因此， 核酸的末端被方便 地设计以使相互重组能够发生且核酸将以期望的方向和顺序被组装。 因此， 所提供的核酸 的末端序列将与想要与之重组的核酸的末端序列基本同源。 0093 本发明所使用的术语 “基本同源” 的意思是： 第一核酸序列与想要与之

39、重组的第二 核酸序列在不多于约3kb， 优选地不多于约2kb， 更优选地不多于约1kb， 甚至更优选地不多 于约0.5kb， 甚至更优选地不多于约0.2kb， 甚至更优选地不多于约0.1kb， 如不多于约 0.05kb， 例如不多于约0.03kb的区域中的同一性程度为至少约70， 至少约80， 优选地至 少约90。 因此， 所需的同一性程度可取决于基本同源序列的长度。 同源序列越短， 同源性 百分比可越高。 0094 在本发明中， 所述两种或更多种核酸总共包含两个或更多个位点特异性重组位 点。 这些位点特异性重组位点被由两种或更多种核酸总共编码的重组酶识别。 关键的是， 提 供所述两种或更多种

40、核酸以使至少两种核酸各包含编码无功能的部分重组酶编码序列。 当 重组两种或更多种核酸时， 这产生编码有功能重组酶的连续序列。 0095 所述位点特异性重组位点和重组酶被选择以使重组酶可以靶向位点特异性重组 位点， 导致位于重组位点之间的序列被外重组(out-recombination)。 说明书 6/21 页 9 CN 104981542 B 9 0096 术语 “重组酶” 或 “位点特异性重组酶” 或其类似物指的是识别和结合至短核酸位 点或 “位点特异性重组位点” (即重组酶识别位点)并催化与这些位点相关的核酸重组的酶 或重组酶。 这些酶包括重组酶、 转座酶和整合酶。 0097 “位点特异性

41、重组位点” 或其类似物指的是短核酸位点或序列(即重组酶识别位 点) ， 其被序列或位点特异性重组酶识别并在位点特异性重组事件过程中变成交换 (crossover)区域。 序列特异性重组酶靶位点的实例包括但不限于lox位点、 att位点、 dif位 点和frt位点。 0098 本文中使用的术语 “lox位点” 指的是一种核苷酸序列， 其中噬菌体P1的cre基因的 产物(Cre重组酶)能够在该序列上催化位点特异性重组事件。 本领域已知多种lox位点， 包 括天然存在的loxP、 loxB、 loxL和loxR以及大量突变的或变体lox位点， 例如lox66、 lox71、 loxP511、 lox

42、P514、 lox86、 lox117、 loxC2、 loxP2、 loxP3和lox P23。 0099 本文中使用的术语 “frt位点” 指的是一种核苷酸序列， 其中酵母2微米质粒的FLP 基因的产物(FLP重组酶)能够在该序列上催化位点特异性重组。 0100 位点特异性重组位点可使重组酶表达后的外重组在靶位点产生不被重组酶识别 的单个突变位点特异性重组位点。 特别地， 所述lox位点可以是lox66和lox71(Albert， H.， Dale， E.C.， Lee， E.， &Ow， D.W.(1995).Site-specific integration of DNA into w

43、ild- type and mutant lox sites placed in the plant genome.Plant Journal， 7(4)， 649- 659)。 0101 除了重组酶、 位点特异性重组位点和能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列之 外， 可以进行这样的方法： 其中两种或更多种核酸总共包含编码标记的序列， 以使两种或更 多种核酸的重组导致所述标记编码基因序列被插入在靶位点。 这种编码标记的序列可位于 至少两种能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列之间。 0102 典型地， 可实施所述方法以使编码标记的序列位于两个或更多个位点特异性重组 位点之间。 以这种方式， 标记

44、基因可通过重组酶的表达被外重组。 0103 以这种方式， 可以使用相同的标记以重复模式实施所述方法多于一个重组循环。 可进一步将这种方法与突变位点特异性重组位点的使用相结合， 其中一旦标记被外重组， 所述位点就不能被重组酶靶向。 0104 在本发明的方法中， 两种或更多种核酸总共可包含两种或更多种不同的标记编码 序列以使所述两种或更多种核酸的重组导致不同的标记基因编码序列被插入在各靶位点。 可提供能够与两个或更多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列以实施这种方法。 进一步， 可以使用一种标记靶向至少两个靶位点并使用不同的标记靶向一个或更多个其它靶位点。 0105 在本发明所述的方法中， 靶位点可包

45、含被破坏和/或部分或全部缺失的编码序列。 典型地， 所述方法在靶位点增加新序列； 这种新序列典型地将置换靶位点的序列。 0106 如上所述， 当在宿主细胞体内实施重组时， 置换序列可以例如赋予可选择的表型。 在这种情况下， 所述置换序列包含选择标记。 优选地， 实施这种方法以使标记可通过重组酶 的表达被外重组。 0107 置换序列还可以是靶序列的经修饰形式， 例如以改变对感兴趣的序列的调控或表 达与原始基因产物相比性质改变的经修饰的基因产物。 0108 置换序列还可以组成已存在于宿主细胞基因组中的感兴趣的序列的额外拷贝， 以 说明书 7/21 页 10 CN 104981542 B 10 扩增

46、所述感兴趣的序列。 0109 置换序列可以相对于宿主细胞是同源的或异源的序列。 其可以从任何合适的来源 获得或者可通过订制合成制备。 0110 靶序列可以是任何感兴趣的序列。 例如， 靶序列可以是利用失活或修饰该序列而 被研究其功能的序列。 靶序列还可以是这样的序列， 其失活、 修饰或过表达是期望的以赋予 宿主细胞期望的表型。 典型地， 本发明所述的方法将导致靶位点的一些核酸序列被移除。 然 而， 本发明所述的方法可被用于在靶位点插入序列而不从靶位点丢失任何序列。 0111 在本公开的上下文中， 术语 “核酸” 、“核酸序列” 、“多核苷酸” 、“多核苷酸序列” 、 “核酸片断” 、“分离的核

47、酸片段” 在本文中可被交换使用。 0112 这些术语包括核苷酸序列及其类似物。 核酸可以是可为单链或双链的DNA或RNA的 聚合物， 任选地， 其含有合成的、 非天然的或改变的核苷酸碱基。 0113 DNA聚合物形式的核酸可包括cDNA、 基因组DNA、 合成DNA的一种或更多种区段， 或 其混合物中。 0114 术语 “分离的核酸” 和其类似物指的是大体上不含其它核酸序列(例如但不限于其 它染色体的和染色体外的DNA和/或RNA)的核酸。 可从分离的核酸天然存在的宿主细胞中将 其纯化。 0115 可使用技术人员已知的常规核酸纯化方法获得分离的核酸。 该术语还包括重组的 核酸和化学合成的核酸。

48、 典型地， 可利用本领域已知的任何扩增方法(例如PCR、 RT-PCR等) 产生适用于本发明的两种或更多种核酸中的每一种。 本文中使用的术语 “扩增” 或 “扩增反 应” 指的是用于增加核酸中靶序列拷贝的任何体外方法。 有时候， 扩增指的是靶核酸的 “指 数” 增加。 然而， 本文中使用的 “扩增” 还可以指选择的核酸靶序列的数目线性增加， 但典型 地不同于一次、 单引物延伸步骤。 0116 典型地， 两种或更多种核酸被引入宿主细胞以使重组事件可发生。 可使用本领域 技术人员公知的多种技术将所述的两种或更多种核酸引入宿主细胞。 被用于引入异源的核 酸至多种生物体的方法的非限制性实例包括： 转化

49、、 转染、 转导、 电穿孔、 超声介导的转化、 粒子轰击等。 在某些情况下， 加入载体分子能够增加典型地被认为很难通过常规方法转化 的细胞对DNA的摄取。 技术人员易于得知转化的常规方法。 0117 用于产生两种或更多种核酸以及之后将它们引入宿主细胞的程序是本领域技术 人员公知的。 (参见， 例如Sambrook&Russell， Molecular Cloning： A Laboratory Manual， 第三版， CSHL Press， Cold Spring Harbor， NY， 2001； 和Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology， Wiley InterScience， NY， 1995)。 0118 此外， 标准的分子生物学技术(例如DNA分离、 凝胶电泳、 核酸的酶促限制性修饰、 Southern分析、 细胞的转化等)是技术人员已知的且被例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning： a laboratory manual， Cold Spri