一种用于数字核酸扩增的高密度阵列芯片装置.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102277294 B (45)授权公告日 2013.04.17 CN 102277294 B *CN102277294B* (21)申请号 201110220222.0 (22)申请日 2011.08.03 C12M 1/00(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 牟颖 朱强远 高一博 于丙文 金伟 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 张法高 赵杭丽 (54) 发明名称 一种用于数字核酸扩增的高密度阵列芯片装 置

2、(57) 摘要 本发明提供一种用于数字核酸扩增的集成流 路芯片装置， 由真空系统、 管路、 吸盘、 封盖层和反 应层组成， 封盖层两端设有出样口和进样口， 封盖 层与反应层之间形成通道， 反应层设有反应小室， 吸盘置于出样口上， 真空系统通过管路连接吸盘， 用胶带纸密封进出样口。本发明可在数十秒内将 微量反应样品分配进入数千个反应小室， 然后通 过在封盖层中的通道内通入矿物油， 将数千个反 应小室隔离开， 即可实现核酸单分子扩增， 对核酸 分子进行精确定量。 本发明装置设计合理， 是一种 成本低廉、 易于操作的微型化的用于数字核酸扩 增的装置。 (51)Int.Cl. 审查员 封明艳 权利要求

3、书 1 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置， 其特征在于， 由真空系统 （1） 、 管路 （2） 、 吸盘 （3） 、 封盖层 （7） 和反应层 （10） 组成， 封盖层 （7） 两端设有出样口 （5） 和进样口 （9） ， 封盖层 （7） 的反面为不规则的六边形凹面， 封盖层 （7） 与反应层 （10） 封接后形成通道 （6） ， 反应层 （10） 设有矩阵排列的高密度集成反应小室 （11） ，

4、吸盘 （3） 置于出样口 （5） 上， 真 空系统 （1） 通过管路 （2） 连接吸盘 （3） ， 进样口 （9） 和出样口 （5） 分别用进样口胶带纸 （8） 和出样口胶带纸 （4） 密封， 封盖层 （7） 与反应层 （10） 封接后构成了集成流路芯片组件 ； 反应 小室 （11） 的体积为 500 pL、 1 nL、 2 nL、 4.5 nL、 8 nL、 9 nL 或 18 nL。 2. 根据权利要求 1 所述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置， 其特征在于， 反应层 （10） 的制作材料选用玻璃、 硅、 聚甲基丙烯酸甲酯、 环氧树脂、 聚四氟乙烯、 聚苯乙烯 或聚二甲基硅氧烷，

5、反应小室 （11） 的形状选用正方形、 五边形、 菱形或圆形。 3. 根据权利要求 1 所述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置， 其特征在于， 封盖层 （7） 的制作材料选用玻璃、 耐热透明胶带、 PET 膜或氟膜， 或选用与反应层 （10） 相同 的材料。 4. 根据权利要求 1 所述的一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置， 其特征在于， 封盖层 （7） 与反应层 （10） 的封接方法式选用耐热透明胶带、 热键合、 耐热胶粘合、 热压封接 或空气等离子体处理的键合方法， 封盖层 （7） 与反应层 （10） 封接后构成了集成流路芯片组 件。 5. 根据权利要求 1 所述的一种用于数字核

6、酸扩增的集成流路芯片装置， 其特征在于， 当封盖层 （7） 选用硬质材料时， 需要在封接前打孔制作出样口 （5） 和进样口 （9） ； 当封盖层 （7） 选用软质材料时， 封接前无需打孔。 权 利 要 求 书 CN 102277294 B 2 1/8 页 3 一种用于数字核酸扩增的高密度阵列芯片装置 技术领域 0001 本发明属生命科学、 医学等多个领域检测装置， 涉及一种用于数字核酸扩增的集 成流路芯片装置及其应用。 背景技术 0002 随着科学技术的飞速发展 , 尤其是生命科学的发展， 生物医学的研究、 应用， 从 整体和细胞水平， 深入到分子水平， 对许多疾病的诊断和治疗相关研究亦逐步进

7、入基因水 平。核酸作为生命体内最重要生物大分子之一是活细胞中最为关键的组分， 它携带着遗传 信息， 是遗传的物质基础。 虽然基因表达的最终产物是蛋白质， 但是决定蛋白质和酶结构的 却是核酸。 因此对核酸进行系统有效的检测和分析将使人们对基因有更加深刻的了解和认 识， 并使其在遗传性疾病、 肿瘤和传染病等医学领域以及法医学鉴定、 食品安全、 考古学等 领域发挥重要作用。 0003 近年来， 核酸研究已经取得了令人瞩目的成绩， 但同时也提出了更多新的挑战。 随 着医学水平的不断提高， 临床上越来越多的提倡细针穿刺活检术等微创技术进行检测和治 疗， 这虽然减少了病人的痛苦和手术并发症， 但与此同时，

8、 采集的样品量却大大减少， 这就 迫切要求发展适用于基因表达等相关研究和临床检测的微量或超微量样品检测技术。另 外， 核酸研究的难度还在于需要提高分析手段的灵敏度。从生物体细胞本身来讲， 其中的 遗传因子核酸的含量是非常低的 ； 从恶性肿瘤等与基因相关的重大疾病的诊断来看， 病变组织细胞成分复杂、 疾病早期阶段特征性 mRNA 表达水平变化小， 疾病的诊断尤其是早 期诊断需要实现高灵敏的核酸检测。目前往往采用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction， 简称 PCR) 技术在体外扩增 DNA， 直到目的 DNA 浓度足以被检测为止。 0004 聚合酶链式反应技术发明至

9、今已经三十多年了， 在这期间技术得到了不断的发 展， 1995 年美国 PE 公司率先发明的荧光定量 PCR 技术， 在普通的 PCR 反应系统中加入了一 个与目的序列互补的双荧光标记探针即分子信标， 依靠分子信标荧光信号报告 PCR 产 物， 其强弱随 PCR 扩增进程不断加强， 并与 PCR 产物的数量成正比， 经特定的荧光光谱分析 仪测得荧光强度， 可实时动态定量观察 PCR 扩增的对数期、 线性期和平台期的变化， 与标准 阳性定量梯度样品的标准曲线比较， 进而推算出待检物的起始拷贝量。但是这种方法并不 能对核酸进行计数， 仍然不是绝对测量， 无法做到单分子检测。 0005 由 Voge

10、inzler 和 Klstein 发明的数字 PCR 技术大大扩展了常规 PCR 的应用。这 项技术首先将待检测的 DNA 样品在多孔板里进行稀释， 使得平均每两个孔里只有一个 DNA 分子， 随后在优化好的 PCR 反应条件下进行 PCR 反应对单拷贝模板进行扩增。扩增产物与 荧光探针结合， 用不同的荧光对序列特异性的扩增产物进行检测。最后用贝叶斯定理型的 统计学方法对 PCR 产物进行统计分析。数字 PCR 技术可以从最低限度稀释的样品中扩增单 个的 DNA 分子， 从而将从传统 PCR 反应获得的指数型模拟信号转变为线性的数字信号 ; 能 够做到真正意义上的绝对定量测定。 2006年Ot

11、tesen等研制出可以对细菌多个基因进行精 确定量的微流控数字 PCR 芯片， 同年美国 Fluidigm 公司开发出了商品化的数字阵列 PCR 芯 说 明 书 CN 102277294 B 3 2/8 页 4 片 ， 用实时 PCR 仪进行核酸扩增和定量检测。这种数字 PCR 芯片涉及到一种基于多层软光 刻工艺制备的 PDMS 弹性微阀， 在这种结构中， 许多并行的串联着的反应小室位于上层 PDMS 中 ； 控制通道网络位于下层 PDMS 中， 由许多与上层反应小室网络相互垂直的通道组成。这 种阀在没有外力的作用下处于开放状态， 当给控制通道网络施加压力 （如气压或水压） 时， 位于上下层之

12、间的 PDMS 薄膜向上扩展， 阀处于关闭状态， 使得上层并行串联的反应小室被 阻隔成若干个独立的反应室。 0006 上述的数字 PCR 芯片已经被应用在检测血浆和肿瘤组织中的微量突变分子、 评价 等位基因的失衡和检测环境中的细菌、 病毒等多个生物科学研究领域， 并被预测为未来癌 症早期诊断的主要技术。但是， 这种基于 PDMS 弹性微阀的数字 PCR 芯片的制作涉及到多层 结构的对准、 封接， 制备过程周期长而复杂。 由于所采用的检测器件是高精密度数码CCD， 整 个商品化的芯片及配套仪器都非常昂贵， 而且操作复杂， 有的需要特殊的仪器， 价格昂贵， 难以进入普通的实验室， 更难以作为常规的

13、健康普查方法来推广。因此， 从数字 PCR 芯片技 术的大规模应用前景来看， 目前的这种制备方法及应用成本均是不利的。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种成本低廉、 易于操作的用于数字核酸扩增的集成流路芯 片装置， 它由真空系统 （真空泵） 、 管路、 吸盘、 封盖层和反应层组成， 封盖层与反应层封接后 构成了集成流路芯片组件， 封盖层两端设有出样口和进样口， 封盖层的反面为不规则的六 边形凹面， 当封盖层与反应层封接后就形成通道， 反应层设有矩阵排列的高密度集成反应 小室， 吸盘置于封盖层的出样口上， 真空系统通过管路连接吸盘。 封盖层上的进样口和出样 口分别由进样口胶带纸和出样口胶

14、带纸密封。 0008 反应层的制作材料可选玻璃、 硅、 聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 、 环氧树脂、 聚四氟乙 烯、 聚苯乙烯、 PDMS 等， 根据不同材料， 选用激光刻蚀、 化学刻蚀、 光刻、 热压、 浇铸或注塑等 方法制成反应小室， 反应小室的形状选用正方形、 五边形、 菱形或圆形。 0009 封盖层的制作材料可选用玻璃、 耐热透明胶带、 PET 膜或氟膜， 或选用与反应层相 同材料， 根据不同材料， 在封盖层的反面通过激光刻蚀、 化学刻蚀、 光刻、 热压、 浇铸及注塑 等方法制成不规则的六边形凹面， 长 10 mm， 宽 4 mm， 深 50 m、 100 m、 200 m 或 30

15、0 m， 当封盖层与反应层封接后就形成通道 6， 整体覆盖在高密度集成反应小室上。 0010 封盖层与反应层的封接， 根据材料及不同应用， 可选用耐热透明胶带、 热键合、 耐 热胶粘合、 热压封接、 空气等离子体处理等键合方法。 0011 若封盖层选用的是玻璃、 单晶硅、 PMMA 等硬质材料， 则需要预先在进出样口的位置 打孔， 制作出样口和进样口。若封盖层选用的是 PET 薄膜、 氟膜或透明胶带等软质材料， 则 封盖层无需打孔， 使用时只需在进样口和出样口的位置用针头将薄膜或胶带刺破即可。 0012 本发明的另一个目的是提供上述集成流路芯片装置在数字核酸扩增中的应用。 0013 具体通过以

16、下步骤实现 ： 0014 （1） 样品制备 ： 0015 如果核酸扩增采用荧光定量PCR方法， 则将模板DNA与Taqman探针试剂盒或SYBR Premix EXTaq 试剂盒混合 ； 0016 如果核酸扩增采用环介导等温扩增 （LAMP） ， 则将模板 DNA 与 LAMP 反应试剂及 DNA 说 明 书 CN 102277294 B 4 3/8 页 5 荧光染料 SYBR Green 混合 ； 0017 （2） 将封盖层上的出样口处的透明胶带刺破， 并将吸盘置于此口上， 然后开始抽真 空， 使真空度达到 013332.2 Pa, 这样便可利用负压进行进样和微流体分配 ； 0018 （3）

17、 根据反应层反应小室的大小， 在芯片封盖层上的进样口处加适量样品， 并将此 处的胶带刺破， 此时溶液会在负压的作用下进入反应层的反应小室区域， 待溶液充满反应 层后停止抽真空， 此时溶液会充满通道及每个反应小室 ； 0019 （4） 通过样品入口向通道导入矿物油并使其充满反应层， 这样通道内及小室与小 室之间的间隔区域的溶液将会被矿物油冲走， 留下的只是小室里滞留的溶液， 从而将不同 的小室里的溶液间隔开来， 矿物油铺在反应区的上层， 可以防止后续反应过程中溶液的蒸 发 ； 0020 （5） 用固化胶或耐热胶带将封盖层上的进样口和出样口密封 ； 0021 （6） 将集成流路芯片组件置于原位PC

18、R仪或类似于原位PCR仪的热循环装置上， 即 可进行荧光定量 PCR 扩增 ； 若对核酸进行环介导等温扩增， 则可将集成流路芯片组件置于 普通的热板上， 65加热 30-60 分钟即可 ； 0022 （7） 对扩增后的产物进行荧光成像， 通过软件计数阳性反应小室数目， 进行分析。 0023 本发明的优点 ： 0024 1与 384 孔板上进行的数字 PCR 相比， 本发明利用芯片微型化的特点， 试剂、 样品 的消耗量均减少， 大大减少了实验成本 ； 除此之外， 本发明只需通过抽真空进行负压进样， 经矿物油冲洗覆盖， 在很短的时间内便可使微量液体分配至成百上千个独立的小室中， 大 大提高了实验速

19、度。充分体现了当今分析设备微型化、 便携化的发展趋势， 在高通量、 低消 耗和大规模平行处理方面具有极大的优势。另外， 由于样品和试剂的分配都在芯片内部完 成， 不与外界大气接触， 可以有效防止外界污染和交叉污染。 0025 2本发明中的集成流路芯片可根据实验的不同需要或不同的实验条件而选择不 同的材料， 种类繁多， 选择面宽， 例如玻璃、 单晶硅、 聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 、 聚四氟乙烯、 聚苯乙烯 （PS） 、 聚碳酸酯 (PC)、 环氧树脂、 聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 等， 亦可采用正压进样。 0026 3与现有的商品化数字 PCR 芯片相比， 本发明不需要微阀便可使少量液体

20、分配到 成百上千个独立的小室中， 大大减少了芯片制作和使用的复杂程度。 0027 4. 与用液滴进行的数字 PCR 反应相比， 成本更加低廉， 操作也更简单， 易于实验 自动化及产业化， 更加利于商品化， 特别是适合于发展中国家使用。 0028 5本发明结构及操作简单， 芯片只需要一个配套的真空泵， 或者使用注射器正压 进样， 无需其他的控制设备， 其应用成本比目前基于 PDMS 弹性微阀的数字 PCR 芯片大大减 少， 为数字 PCR 技术的推广与应用提供了一个良好的平台。 附图说明 0029 图 1 为本发明装置截面结构示意图。 0030 图 2 为本发明装置的集成流路芯片组件结构示意图。

21、 0031 图 3 为本发明装置的通道俯视示意图。 0032 图 4 为使用本发明装置的数字 PCR 核酸扩增结果图。 说 明 书 CN 102277294 B 5 4/8 页 6 具体实施方式 0033 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。 0034 实施例 1 用于数字核酸扩增的高密度玻璃芯片装置 0035 参见图 1-3， 一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置， 它由真空系统 1、 管路 2、 吸盘 3、 封盖层 7 和反应层 10 组成， 封盖层 7 与反应层 10 封接后构成了集成流路芯片组 件， 封盖层7两端设有进样口9和出样口5， 封盖层7的反面为不规则的六边形凹面，

22、当封盖 层 7 与反应层 10 封接后就形成通道 6， 反应层 10 设有矩阵排列的高密度集成反应小室 11， 真空系统 1 通过管路 2 连接吸盘 3， 吸盘 3 置于封盖层 7 的出样口 5 上， 使得出样口 5 通过 吸盘 3、 管路 2 与真空系统 1 相连。 0036 反应层 10 以 1 mm 厚的玻璃为材料， 采用标准的光刻、 蚀刻技术制成反应小室 11， 反应小室11为边长100 m， 200 m或300 m的正方形， 深50 m, 100 m, 200 m, 或 300 m。根据不同的宽度和刻蚀深度， 反应小室 11 的体积可为 500 pL, 1 nL, 2 nL, 4.5

23、 nL, 8 nL, 9 nL, 或 18 nL ； 反应小室 11 也可以为五边形、 菱形或圆形。 0037 封盖层 7 以 1mm 厚的玻璃为材料， 根据材料不同， 通过激光刻蚀、 化学刻蚀、 光刻、 热压、 浇铸及注塑等方法， 在封盖层 7 的反面制成形状为不规则的六边形， 长 10 mm， 宽 4 mm， 深 50 m,100 m,200 m, 或 300 m， 在进样口 9 和出样口 5 的位置， 用直径 1 mm 的钻头打通。 0038 采用空气等离子体处理键合的方法将封盖层 7 与反应层 10 封接， 此时封盖层 7 与 反应层 10 之间形成的通道 6 整个覆盖在高密度集成反应

24、小室 11 上。封接成功后分别用进 样口胶带纸 8 和出样口胶带纸 4 将封盖层 7 上的进样口 9 和出样口 5 密封以备用。 0039 使用时， 真空系统 1 通过抽真空， 将置于进样口 9 处的样品溶液抽入通道 6 及反应 层 10 的各个反应小室 11， 当样品充满通道 6 及反应小室 11 后， 停止抽真空。 0040 然后向通道6导入矿物油并使其充满通道6， 此时通道6内， 及反应小室11与反应 小室 11 之间的间隔区域的溶液将会被矿物油冲走， 留下的只是反应小室 11 里滞留的样品 溶液， 从而将不同的小室里的溶液间隔开来， 即将样品分隔到几千个纳升级的小室中， 矿物 油铺在反

25、应小室 11 的上层， 可以防止后续反应过程中溶液的蒸发。 0041 实施例 2 用于数字核酸扩增的高密度单晶硅芯片装置 0042 该装置结构同实施例 1。 0043 反应层 10 以厚 500 m 的抛光的单晶硅片为材料， 采用光刻、 化学湿法刻蚀制成 反应小室 11， 反应小室 11 为边长 100 m, 200 m 或 300 m 的正方形， 深 50 m, 100 m, 200 m, 300 m。 根据不同的宽度和刻蚀深度， 反应小室11的体积可为500 pL, 1 nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL, 9 nL, 18 nL ； 反应小室 11 也可以为五边形、 菱形、 圆

26、形或其它 多边形。 0044 封盖层 7 根据应用不同， 可选用玻璃或透明的 PMMA 平板。采用标准的光刻、 蚀刻 技术在封盖层 7 反面制成不规则的六边形凹面， 长 10 mm， 宽 4 mm， 深 50 m、 100 m、 200 m 或 300 m， 当封盖层 7 与反应层 10 封接后就形成通道 6， 此时整个通道 6 是覆盖在高 密度集成反应小室 11 上。 0045 如果封盖层7选用的是PMMA平板等硬质材料， 封接前需要在相应的位置钻好出样 口 5 与进样口 9， 然后再进行封接， 封接成功后分别用进样口胶带纸 8 和出样口胶带纸 4 将 说 明 书 CN 102277294

27、B 6 5/8 页 7 封盖层 7 上的进样口 9 和出样口 5 密封以备用。 0046 但如果封盖层 7 选用的是 PET 膜、 氟膜等软质材料， 则无需预先打孔， 在使用时只 需在与出样口 9 和进样口 5 相应位置用针头刺破即可。 0047 使用时， 真空系统1通过抽真空， 将置于进样口9处的样品抽入通道6及反应层10 的各个反应小室 11， 当样品充满通道 6 及反应小室 11 后， 停止抽真空。 0048 向通道 6 导入矿物油并使其充满通道 6， 此时通道 6 内及反应小室 11 之间的间隔 区域的溶液将会被矿物油冲走， 留下的只是反应小室 11 里滞留的溶液， 从而将不同的反应

28、小室 11 里的溶液间隔开来， 将样品分隔到几千个纳升级的小室中， 矿物油铺在反应小室 11 的上层， 可以防止后续反应过程中溶液的蒸发。 0049 实施例 3 数字化环介导等温扩增 （Digital-Loop Mediated Isothermal Amplification， Digital-LAMP） 0050 采用实施例 1 的装置进样， 并进行后续的数字核酸环介导等温扩增。 0051 具体步骤 ： 0052 1、 通道结构同实施例 1， 用喷墨打印机将设计的结构打印至菲林胶片， 作为光刻的 掩膜。 0053 2、 反应层10以1mm厚的玻璃为材料， 采用标准的光刻、 蚀刻技术制成反应

29、小室11， 反应小室 11 为边长 100 m, 200 m 或 300 m 的正方形， 深 50 m, 100 m 或 200 m ； 根据不同的宽度和刻蚀深度， 反应小室11的体积可为500 pL, 1 nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL, 9 nL 或 18nL ； 反应小室 11 也可以为五边形、 菱形或圆形。 0054 3、 封盖层 7 以 1 mm 厚的玻璃为材料， 采用标准的光刻、 蚀刻技术制成。盖层 7 反 面的形状同实施例 1， 不规则的六边形的长 10 mm， 宽 4 mm， 深 50 m, 100 m, 200 m 或 300 m。 0055 4、 将芯片反应层

30、 10 与封盖层 7 经等离子体处理封接。 0056 芯片反应层 10 还可与钻好孔的 PMMA 等聚合物平板制作的封盖层 7 用胶水或热压 封接， 封接完后用透明胶带将打孔处封闭待用。 0057 5、 采用商业化的E. coli 16s rRNA作为反应模板考察芯片性能 ： 将模板DNA稀释 到适当的浓度并与适量的 LAMP 反应试剂及 DNA 荧光染料 SYBR Green 混合 ： 0058 （1） 将 500 ng/L 的E. coli 16s rRNA 溶液稀释为 5 pg/L、 0.5 pg/L、 0.05 pg/L、 0.005 pg/L， 作为 DNA 模板各取 1L 进行 P

31、CR 反应。 0059 （2） 按照50L体系配制LAMP反应混合物 ：E. coli 16s rRNA模板1L， 引物FIP (40 M) 2 L， 引物 BIP (40 M) 2 L， 引物 F3 (5 M) 2 L， 引物 B3 (5 M) 2 L， dNTP (2.5 mM each) 8 L， MgSO4 (50 mM) 6 L, betaine (5 M) 10 L， Bst 酶 2 L， Bstbuffer 5 L， SYBR Green 2 L， ddH2O 8 L。LAMP 引物如下 ： 0060 F3: 5 GATGTGCCCAGATGGGATT3 0061 B3: 5 G

32、GCCTTCTTCATACACGCG3 0062 FIP: 5 TGGTCATCCTCTCAGACCAGCTTTTTGCTAGTAGGTGGGGTAACGG3 0063 BIP: 5 TGGAACTGAGACACGCTCCAGATTTTATGGCTGCATCAGGCTTG3 0064 6、 将芯片封盖层 7 上对应于出样口 5 处的透明胶带 4 刺破， 并将吸盘 3 置于出样 口 5 上， 然后开始抽真空， 使真空度达 013332.2 Pa。 说 明 书 CN 102277294 B 7 6/8 页 8 0065 7、 在芯片封盖层 7 上对应于进样口 9 处加 50L 的反应混合物， 并将

33、此处的胶带 8 刺破， 此时溶液会在负压的作用下进入通道 6 及反应层 10 的各个反应小室 11， 当样品充 满通道 6 及各个反应小室 11 后， 停止抽真空。 0066 8、 通过进样口9向反应层10导入矿物油并使其充满通道6， 此时反应小室11之间 的间隔区域及反应小室 11 上层的溶液将会被矿物油冲走， 留下的只是反应小室 11 里滞留 的溶液， 从而将不同的小室里的溶液间隔开来， 矿物油铺在反应层的上层， 可以防止后续反 应过程中溶液的蒸发。 0067 9、 用固化胶或耐热透明胶将胶带的刺破处密封。 0068 10、 将芯片组件置于热板上， 芯片与原位 PCR 仪之间添加矿物油，

34、或者传热脂， 增 加热传导性， 65加热 30 min， 以对核酸进行环介导等温扩增。由于 SYBR Green 荧光染 料只与双链 DNA 小沟结合， 当它与 DNA 双链结合时， 发出较原先强 8001000 倍的荧光， 因 此， 发生扩增反应的反应小室 11 将呈现绿色荧光， 阴性将无颜色变化。因此， 如果有核酸分 子被分配到某个独立的反应小室 11， 该小室在反应后将产生绿色的荧光 ； 如果核酸的浓度 足够低， 使每个反应小室 11 最多能分到一个核酸分子， 那么， 通过对阳性反应小室的计数 就可以对起始的核酸模板量进行精确定量。 0069 11、 对扩增后的产物进行荧光成像后， 用软

35、件对阳性孔数进行计数及分析。 0070 实施例 4 数字化聚合酶链式反应 （Digital-PCR） 0071 本实施例采用实施例 2 的装置进样， 并进行后续的数字化聚合酶链式反应。 0072 具体步骤 ： 0073 1、 通道结构同实施例 1， 用喷墨打印机将设计的结构打印至菲林胶片， 作为光刻的 掩膜。 0074 2、 反应层 10 以厚 500 m 的抛光的单晶硅片为材料， 采用光刻、 化学湿法刻蚀制 成。单晶硅具有良好的热传导性， 适于对温度控制要求非常高的 PCR 反应。反应小室 11 为 边长 100 m， 200 m 或 300 m 的正方形， 深 50 m, 100 m, 2

36、00 m 或 300 m。 根据不同的宽度和刻蚀深度， 反应小室 11 的体积可为 500 pL, 1 nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL, 9 nL 或 18 nL ； 反应小室 11 也可以为五边形、 菱形、 圆形或其它多边形。 0075 3、 封盖层 7 以 1 mm 厚的玻璃为材料。 0076 4、 将反应层 10 与封盖层 7 经等离子体处理封接。 0077 5、 采用商业化的 -actin cDNA 作为反应模板考察芯片性能 ： 将模板 DNA 稀释到 适当的浓度并与适量的荧光定量 PCR 反应试剂混合 ： 0078 （1） 将500 ng/L的-actin cDNA溶液

37、稀释为5 pg/L、 0.5 pg/L、 0.05 pg/ L、 0.005 pg/L， 作为 DNA 模板各取 1 L 进行 PCR 反应 ； 0079 （2） 使用TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems,)试剂盒 进行 PCR 扩增反应， 按照 10 L 体积配制反应液， TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, PN 4369016) 5 L， PCR Forward Primer (900 nM) 1 L， PCR Revers Primer (900

38、 nM) 1 L, Probe (250 nM) 1 L, ddH2O 1 L， DNA模板1 L。 反应条件 ： 50 2 min, 95 10 min预变性， 95 15 sec， 60 1 min， 共40个循环。 所 用 -actin cDNA 的引物序列如下 ： 0080 Actin F（上游引物） : 5 ACCGAGCGCGGCTACAG3 说 明 书 CN 102277294 B 8 7/8 页 9 0081 Actin R（下游引物） : 5 CTTAATGTCACGCACGATTTCC3 0082 Actin-probe (5 3 ): FAM+TTCACCACCACGGC

39、CGAGC+TAMRA 0083 （3） PCR的扩增反应及检测还可以采用SYBR PremixEX Taq试剂来完成。 使用SYBR PremixEX Taq试剂盒进行PCR扩增反应， 按照50 L体积配制反应液， SYBR PremixEX Taq (2) 25 L， PCR Forward Primer (10 M) 1 L， PCR Revers Primer (10) 1 l, ddH2O 21 L， DNA 模板 2.0 L。反应条件 ： 95 30 sec 预变性， 95 5 sec， 60 30 sec， 共 40 个循环。所用 -actin cDNA 的引物序列如下 ： 00

40、84 Actin F（上游引物） : 5 ACCGAGCGCGGCTACAG3 0085 Actin R（下游引物） : 5 CTTAATGTCACGCACGATTTCC3 。 0086 6、 将封盖层 7 上对应于出样口 5 处的透明胶带 4 刺破， 并将吸盘 3 置于出样口 5 上， 然后开始抽真空， 使真空度达 013332.2 Pa。 0087 7、 在封盖层 7 上对应于进样口 9 处加上 50L 的反应混合物， 并将此处的胶带 8 刺破， 此时溶液会在负压的作用下进入通道 6 及反应层 10 的各个反应小室 11， 当样品充满 通道 6 及反应层 10 的各个反应小室 11 后，

41、停止抽真空， 此时溶液会充满每个小室及小室与 小室之间的间隔。 0088 8、 通过进样口9向反应层10导入矿物油并使其充满通道6， 这样反应小室11之间 的间隔区域及反应小室 11 上层的溶液将会被矿物油冲走， 留下的只是反应小室 11 里滞留 的溶液， 从而将各个反应小室 11 里的溶液间隔开来， 矿物油铺在反应层的上层， 可以防止 后续反应过程中溶液的蒸发。 0089 9、 用固化胶或耐热透明胶将胶带的刺破处密封。 0090 10、 将芯片组件置于原位 PCR 仪上， 芯片与原位 PCR 仪之间添加矿物油， 或者传热 脂， 增加热传导性， 再根据不同的反应试剂设定不同的反应条件。 009

42、1 11、 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针， 它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计 为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。 荧光基团连接在探针的 5 末端， 而淬 灭剂则在 3 末端。 当完整的探针与目标序列配对时， 荧光基团发射的荧光因与 3 端的淬 灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时， 聚合酶的 5 外切酶活性将探针进行酶切， 使得 荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加， 释放出来的荧光基团不断积累。因此荧 光强度与扩增产物的数量呈正比关系。实验中使用的是 FAM 标记的探针， 当其水解时， 发绿 色荧光， 因此， 发生扩增反应的小室 9 将呈现绿色荧光， 阴性将无颜

43、色变化。因此， 如果有核 酸分子被分配到某个独立的反应小室 11， 该小室在反应后将产生绿色的荧光 ； 如果核酸的 浓度足够低， 使每个反应小室 11 最多能分到一个核酸分子， 那么， 通过对阳性反应小室 11 的计数就可以对起始的核酸模板量进行精确定量。 0092 12、 SYBR Green 荧光染料只与双链 DNA 小沟结合， 当它与 DNA 双链结合时， 发出 较原先强8001000倍的荧光， 因此， 发生扩增反应的小室9将呈现绿色荧光， 阴性将无颜色 变化。如果有核酸分子被分配到某个独立的反应小室 11， 该小室在反应后将产生绿色的荧 光 ； 如果核酸的浓度足够低， 使每个反应小室

44、11 最多能分到一个核酸分子， 那么， 通过对阳 性反应小室的计数就可以对起始的核酸模板量进行精确定量。 0093 13、 对扩增后的产物进行荧光成像后， 用软件对阳性反应小室进行计数及分析。 参 见图 4， 用浓度为 0.1ng/L 的 -actin cDNA 作为核酸模板进行的数字 PCR 扩增结果图。 说 明 书 CN 102277294 B 9 8/8 页 10 根据数字 PCR 反应的原理， 图 4 中的亮点为阳性反应， 表示检测到一个核酸分子 ； 非亮点为 阴性反应， 表示该反应小室未检测到目标核酸分子。通过对整个芯片反应阵列中的阳性亮 点进行计数， 可知该浓度的 -actin c

45、DNA 所包含的目标核酸分子数为 83 个拷贝。由此通 过单分子计数的方法， 可对核酸的分子拷贝数进行精确定量。 说 明 书 CN 102277294 B 10 1/2 页 11 浙江大学 一种用于数字核酸扩增的高密度阵列芯片装置及应用 7 1 19 DNA 人工序列 根据 E.coli 16s rRNA 序列设计的 LAMP F3 序列 1 gatgtgccca gatgggatt 19 2 19 DNA 人工序列 根据 E.coli 16s rRNA 序列设计的 LAMP B3 序列 2 ggccttcttc atacacgcg 19 3 46 DNA 人工序列 根据 E.coli 16s

46、 rRNA 序列设计的 LAMP FIP 序列 3 tggtcatcct ctcagaccag ctttttgcta gtaggtgggg taacgg 46 4 44 DNA 人工序列 根据 E.coli 16s rRNA 序列设计的 LAMP BIP 序列 4 序 列 表 CN 102277294 B 11 2/2 页 12 tggaactgag acacgctcca gattttatgg ctgcatcagg cttg 44 5 17 DNA 人工序列 根据 -actin cDNA 序列设计的 PCR 检测上游引物序列 5 accgagcgcg gctacag 17 6 22 DNA 人工序列 根据 -actin cDNA 序列设计的 PCR 检测下游引物序列 6 cttaatgtca cgcacgattt cc 22 7 19 DNA 人工序列 根据 -actin cDNA 序列设计的 PCR 检测探针序列 7 Fam-ttcaccacca cggccgagc-Tamra 19 序 列 表 CN 102277294 B 12 1/2 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102277294 B 13 2/2 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 102277294 B 14