杂合-淀粉酶.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102245764 A (43)申请公布日 2011.11.16 CN 102245764 A *CN102245764A* (21)申请号 200980150419.2 (22)申请日 2009.12.11 61/122,628 2008.12.15 US C12N 9/28(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/21(2006.01) (71)申请人 丹尼斯科美国公司 地址 美国加利福尼亚州 (72)发明人 SD鲍尔 A肖 (74)专利代理机构 北京市中

2、咨律师事务所 11247 代理人 胡志君 黄革生 (54) 发明名称 杂合 - 淀粉酶 (57) 摘要 提供了与野生型透阿米尔样 - 淀粉酶例如 芽孢杆菌淀粉酶整体或部分地共享保守 3D 结构 的杂合 - 淀粉酶。在该杂合体中， 透阿米尔样 - 淀粉酶的 N 端部分以来自古细菌 - 淀粉酶 的序列替换。这两个淀粉酶序列之间的序列相似 性可以小于60。 该杂合体中保留野生型3D结构 有利于获得有酶活性的淀粉酶。在一个实施方案 中， 一个或两个淀粉酶序列向 B 结构域贡献残基， 从而产生特别有利的特性。 例如， 用不结合Ca2+的 古细菌 - 淀粉酶的 B 结构域序列替换透阿米尔 样 - 淀粉酶

3、B 结构域中的 Ca2+结合位点可以产 生在 Ca2+不存在下具有充分活性的杂合体。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.06.15 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2009/067639 2009.12.11 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/074999 EN 2010.07.01 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 32 页 附图 7 页 CN 102245770 A1/2 页 2 1. 杂合淀粉酶， 其包含从 N 端至 C 端具有式 (I) 的多肽 ： A-x-y

4、-B(I)， 其中 A 是来自古细菌 - 淀粉酶的第一氨基酸序列 ； B 是来自野生型透阿米尔样 - 淀粉酶的或来自与野生型透阿米尔样 - 淀粉酶具有 至少 80序列同一性的变体的第二氨基酸序列 ； x 是第一氨基酸序列的 C 端残基 ； y 是第二氨基酸序列的 N 端残基 ； 其中第一和第二氨基酸序列一起含有约 400 至约 500 个氨基酸残基 ； 其中杂合淀粉酶中约 10至约 80之间的总氨基酸由古细菌 - 淀粉酶贡献 ； 并且 其中与野生型透阿米尔样 - 淀粉酶相比， 残基 x 和 y 在杂合淀粉酶中是结构上保守 的。 2.权利要求1所述的杂合淀粉酶， 其中与野生型透阿米尔样-淀粉酶相

5、比， 杂合淀粉 酶具有改变水平的重组表达、 溶解度、 pH 活性谱、 底物特异性或比活性。 3.权利要求1所述的杂合淀粉酶， 其中与野生型透阿米尔样-淀粉酶三维结构相比， 残基 x 和 y 中的 - 碳之间的均方根距离不多于约 4.权利要求1所述的杂合淀粉酶， 其中与野生型透阿米尔样-淀粉酶相比， 第一氨基 酸序列 A 在杂合淀粉酶中是结构上保守的。 5. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶， 其中野生型透阿米尔样 - 淀粉酶是芽孢杆菌 (Bacillus)- 淀粉酶。 6. 权利要求 5 所述的杂合淀粉酶， 其中芽孢杆菌 - 淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆 菌 (Bacillus stearotherm

6、ophilus)- 淀 粉 酶、地 衣 芽 孢 杆 菌 (B.licheniformis) - 淀粉酶、 枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)- 淀粉酶、 芽孢杆菌属物种 (Bacillus sp.) KSM-K38- 淀粉酶或盐敏芽孢杆菌 (B.halmapalus)- 淀粉酶。 7. 权利要求 6 所述的杂合淀粉酶， 其中芽孢杆菌 - 淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌 - 淀粉酶。 8. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶， 其中野生型透阿米尔样 - 淀粉酶是嗜热脂肪芽孢 杆菌 - 淀粉酶的变体， 其中淀粉结合结构域从嗜热脂肪芽孢杆菌 - 淀粉酶的羧基端移 除。 9. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶

7、， 其中古细菌 - 淀粉酶是 Ultrathin- 淀粉酶。 10. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶， 其中第一和第二氨基酸序列从共享小于约 60序 列同一性的淀粉酶衍生。 11. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶， 其中残基 x 和 y 在 B 结构域中。 12. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶， 其中第一氨基酸序列贡献 B 结构域的至少 80氨 基酸残基。 13. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶， 其中第一氨基酸序列包含 Zn2+结合位点。 14. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶， 其中野生型透阿米尔样 - 淀粉酶的 Ca2+结合位 点中的至少一个氨基酸以来自第一氨基酸序列的氨基酸残基替换。

8、 15. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶， 其中杂合淀粉酶具有 - 淀粉酶活性， 并且其中该 权 利 要 求 书 CN 102245764 A CN 102245770 A2/2 页 3 活性不受 Ca2+浓度影响。 16. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶， 其包含 SEQ ID NO ： 1-8 任一序列中所示的氨基酸 序列。 17. 权利要求 16 所述的杂合淀粉酶， 其中淀粉酶包含 SEQ ID NOS ： 1、 2、 6、 7 或 8 任一 序列中所示的氨基酸序列。 18. 权利要求 1 所述的杂合淀粉酶， 其中杂合淀粉酶是被纯化的。 19. 核酸， 其编码权利要求 1 的杂合淀粉酶。

9、 20. 载体， 其包含权利要求 19 的核酸。 21. 宿主细胞， 其包含权利要求 19 的核酸或权利要求 20 的载体。 22. 权利要求 21 所述的宿主细胞， 其中宿主细胞是细菌或真菌。 23. 权利要求 22 所述的宿主细胞， 其中细菌是芽孢杆菌属物种 (Bacillus sp)。 24. 一种设计权利要求 19 的核酸的方法， 包括 ： (a) 在计算机执行的操作中比对古细菌 - 淀粉酶和野生型透阿米尔样 - 淀粉酶的 3D 结构 ； (b) 选择结构上保守的氨基酸残基 x 和 y ； 和 (c) 设计编码杂合淀粉酶的核酸。 25. 权利要求 24 所述的方法， 其中与野生型透阿米

10、尔 - 淀粉酶三维结构相比， 残基 x 和 y 中的 - 碳之间的均方根距离不多于约 26. 权利要求 25 所述的方法， 其中计算机执行的操作包括在计算机监视器上显示三维 结构比对结果。 权 利 要 求 书 CN 102245764 A CN 102245770 A1/32 页 4 杂合 - 淀粉酶 0001 序列表 0002 附上包含 SEQ ID NO ： 1-27 的序列表并将其通过引用的方式完整并入。 0003 优先权 0004 本申请要求 2008 年 12 月 15 日提交的由此通过引用方式并入的美国临时申请系 列号 61/122,628 的优先权。 发明领域 0005 提 供

11、了 包 含 古 细 菌 (archae)- 淀 粉 酶 序 列 和 透 阿 米 尔 样 - 淀 粉 酶 (Termamyl-like -amylase) 序列的杂合淀粉酶。与野生型透阿米尔样 - 淀粉酶相比， 该杂合淀粉酶可以具有改变的特性。 0006 发明背景 0007 具有共同功能的相关酶可以具有或可以不具有显著的序列同一性。例如， 若其氨 基酸序列与地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)- 淀粉酶共有 60或更高的同一性， 则芽 孢杆菌 (Bacillus)- 淀粉酶 (1， 4-D- 葡聚糖葡聚糖水解酶， EC 3.2.1.1) 分类为 “透 阿米尔样” 。参见 WO 96/

12、23874。可以在共享 62或更高序列同一性的淀粉酶之间产生杂 合淀粉酶。参见 Gray 等人， J.Bacteriology 166 ： 635-43(1986) ； 美国专利号 6,143,708。 例如， 已经重组表达并且结晶出含有解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 第 1-300 位残基和地衣芽孢杆菌第 301-483 位残基的嵌合淀粉酶。见 Brzozowski 等人， Biochemistry 39 ： 9099-107(2000) ； 还见WO 96/23874 ； WO 97/41213。 然而， 甚至共享小于 25序列同一性的淀粉酶如来自

13、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌的淀 粉酶却可以共享共同的催化功能和总体保守的三维立体 (3D) 折叠。 0008 许多淀粉酶的晶体结构是目前可获得的。见上文 Brzozowski 等人 (2000)。 Protein Data Bank(PDB) 例如含有至少在表 1 中所示的淀粉酶的 3D 结构。 0009 表 1 0010 说 明 书 CN 102245764 A CN 102245770 A2/32 页 5 0011 这些晶体结构的比较揭示了三维 (3D) 结构的高度保守性， 甚至在不存在明显的 序列相似性时。所报道的全部 - 淀粉酶结构共享有 (/)8

14、催化核心结构域， 为结构 域 A。 “(/)8” 指定义为保守蛋白质 3D 构象的所谓 “TIM 桶结构” 或由沿着肽主链交替 分布的 8 个 - 螺旋和 8 条平行 - 链组成的 “折叠” 。见 Lolis 等人， Biochemistry 29 ： 6609-18(1990)。B 结构域是结构域 A 的桶状链 -3 与螺旋 -3 之间的偏移 (excursion) 或延伸结构。一般为 8 链 折叠的 C 结构域形成淀粉酶的其余 C 端部分。下文更详细地 描述淀粉酶的结构域构造。 0012 本领域对提供变体 - 淀粉酶存在持续需求， 其中所述的变体 - 淀粉酶在重组 宿主细胞中正确折叠、 维

15、持稳定性并展示高效表达， 而无需对蛋白质的氨基酸序列或 3D 结 构做出大规模改变。 0013 发明概述 0014 使用透阿米尔样 - 淀粉酶的 3D 结构作为构建新杂合 - 淀粉酶的准则。在杂 合淀粉酶中， 透阿米尔样 - 淀粉酶 N 端的一部分以来自古细菌淀粉酶的序列替换。这两 种淀粉酶共享保守的 3D 结构。另外， 所述淀粉酶之间的序列同一性可以小于 60。在一 个实施方案中， 杂合淀粉酶含有约 400 至约 500 个氨基酸残基。杂合淀粉酶中约 10和约 80之间的总氨基酸由古细菌 - 淀粉酶贡献。预测杂合酶中被替换的部分具有在结构上 说 明 书 CN 102245764 A CN 1

16、02245770 A3/32 页 6 整体或部分地与透阿米尔样淀粉酶保守的 3D 结构。在一个实施方案中， 至少古细菌淀粉酶 序列的 C 端残基 ( 残基 “x” ) 和透阿米尔样淀粉酶序列的 N 端残基 ( 残基 “y” ) 是结构上 保守的。该杂合淀粉酶可以有利地组合构成性淀粉酶序列的所希望有的特性， 如改变水平 的重组表达、 改变的溶解度， 和所希望有的性能特性， 如最适 pH 活性谱、 底物特异性、 产物 特征和比活性。 0015 由于蛋白质结构域经常被认为折叠成独立的单元， 故可能期望不得不将结构域作 为整体单元替换以在杂合酶中维持正确的折叠。然而， 通过设计杂合体以维持野生型芽孢

17、杆菌酶的保守折叠， - 淀粉酶序列不需要在结构域边界处融合。在一些实施方案中， 杂合 淀粉酶包含来自第一 - 淀粉酶的含有一部分 B 结构域的第一氨基酸序列， 其与来自芽孢 杆菌 - 淀粉酶的含有 B 结构域其余部分的第二氨基酸序列融合。以这种方式， 可以设计 具有独特特性的杂合淀粉酶， 这取决于融合在一起的 B 结构域的特定部分。 0016 例如， 某些实施方案涉及的杂合淀粉酶含有来自嗜热脂肪芽孢杆菌 - 淀粉酶 (AmyS ； 本领域也称作嗜热脂肪土芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus) 的序列， 其与来自 “Ultrathin” ( 一种在 Richa

18、rdson 等人 .， J.Biol.Chem.277 ： 26501-07(2002) 中 公开的古细菌 - 淀粉酶 (GenBankTM登录号 AAM48114) 的序列融合。在本文中公开的多 个实施方案中， 杂合体的 N 端由来自 Ultrathin 的氨基酸残基 ( 即， 第一氨基酸序列 ) 组 成， 而 C 端由来自 AmyS 的氨基酸残基 ( 即， 第二氨基酸序列 ) 组成。具体的 Ultrathin 残 基命名为 “UT n” ， 其中 n 是自 N 端起的氨基酸残基编号。例如， Ultrathin 的第 104 位残 基命名为 “UT 104” 。术语 “des-Met Ult

19、rathin”指缺 N 端甲硫氨酸残基的 Ultrathin。 Ultrathin 第 1-104 位残基与 AmyS 第 100-483 位残基之间的杂合淀粉酶例如命名为 “UT 1-104 ： AmyS100-483” 。 0017 象其他古细菌淀粉酶， Ultrathin 在 B 结构域中具有 Zn2+结合位点。相反， 芽孢杆 菌 - 淀粉酶的 B 结构域具有 Ca2+-Na+-Ca2+结合位点。含有与来自芽孢杆菌 - 淀粉酶的 剩余B结构域融合的Ultrathin Zn2+结合位点的杂合体可以具有芽孢杆菌-淀粉酶的性 能特征， 而不需要Ca2+用于酶活性。 与另一种酶如葡糖淀粉酶组合使

20、用时， 这种杂合淀粉酶 可能特别有用， 其中所述的另一种酶具有不同于野生型芽孢杆菌 - 淀粉酶的钙需求。例 如， 该杂合淀粉酶可以用来例如在与葡糖淀粉酶相同的反应容器中糖化淀粉， 其中 Ca2+浓 度可以针对该葡糖淀粉酶的性能进行优化。 0018 因此， 本公开提供杂合淀粉酶， 其包含从氨基端至羧基端具有式 (I) 的多肽 ： 0019 A-x-y-B(I)， 0020 其中 A 是来自古细菌 - 淀粉酶的第一氨基酸序列， B 是来自野生型透阿米尔样 - 淀粉酶或其变体的第二氨基酸序列， x 是第一氨基酸序列的 C 端残基， 并且 y 是第二氨 基酸序列的 N 端残基。透阿米尔样 - 淀粉酶变

21、体可以与野生型透阿米尔样 - 淀粉酶具 有至少约80、 约85、 约90、 约95、 或约99序列同一性。 第一和第二氨基酸序列一 起可以含有约 400、 约 410、 约 420、 约 430、 约 440、 约 450、 约 460、 约 470、 约 480、 约 490 或约 500 个氨基酸残基。该杂合淀粉酶中约 10、 约 20、 约 30、 约 40、 约 50、 约 60、 约 70或约 80的氨基酸可以由古细菌 - 淀粉酶贡献。与野生型透阿米尔样 - 淀粉酶 相比， 残基 x 和 y 在杂合淀粉酶中均是结构上保守的。该杂合淀粉酶可以包含 SEQ ID NO ： 1-8 任一者

22、中所示的氨基酸序列。在又一个方面， 该杂合淀粉酶可以被纯化。 说 明 书 CN 102245764 A CN 102245770 A4/32 页 7 0021 在一个方面， 与野生型透阿米尔-淀粉酶3D结构相比， 残基x和y中的-碳之 间的均方根距离不多于约约约约或约在另一个方面， 与野生型透阿米尔样-淀粉酶相比， 第一氨基酸序列A在杂合淀粉酶中是结构上保守的。 野生型透阿米尔样 - 淀粉酶可以是芽孢杆菌 - 淀粉酶。该芽孢杆菌 - 淀粉酶可以是 嗜热脂肪芽孢杆菌 - 淀粉酶、 地衣芽孢杆菌 - 淀粉酶、 枯草芽孢杆菌 - 淀粉酶、 芽孢 杆菌属物种 KSM-K38- 淀粉酶或盐敏芽孢杆菌 -

23、 淀粉酶。透阿米尔样 - 淀粉酶变体 可以通过去掉亲本酶的 C 端从嗜热脂肪芽孢杆菌 - 淀粉酶衍生。古细菌 - 淀粉酶可以 是 Ultrathin- 淀粉酶。杂合淀粉酶的第一和第二氨基酸序列从可以共享小于约 60、 约 55、 约 50、 约 45、 约 40、 约 35或约 30序列同一性的淀粉酶衍生。也构思了 在其第一氨基酸序列内部包含Zn2+结合位点的杂合淀粉酶。 该杂合淀粉酶可以使得野生型 透阿米尔样-淀粉酶的Ca2+结合位点的至少一个氨基酸置换为来自第一氨基酸序列的氨 基酸残基。 0022 在又一个方面， 残基 x 和 y 处于 B 结构域中。第一氨基酸序列可以贡献 B 结构域 的

24、至少约 80、 约 85、 约 90、 约 95或约 98氨基酸残基。 0023 另一方面构思了与野生型透阿米尔样 - 淀粉酶相比， 具有改变水平的重组表 达、 溶解度、 pH 活性谱、 底物特异性或比活性的杂合淀粉酶。该杂合淀粉酶可以具有不受 Ca2+浓度影响的 - 淀粉酶活性。 0024 也构思了编码如现在公开的杂合淀粉酶的核酸。又一个方面是包含该核酸的载 体。又一个方面构思了含有该核酸或载体的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌或真菌。在又 一个方面， 细菌可以是芽孢杆菌属物种。 0025 又一个方面构思了设计编码杂合酶的核酸的方法。该方法包括 ： 在计算机执行的 操作中比对古细菌 - 淀粉酶和

25、野生型透阿米尔样 - 淀粉酶的 3D 结构， 选择结构上保守 的氨基酸残基 x 和 y， 并且设计编码该杂合酶的核酸。计算机执行的操作可以包括在计算 机监视器上显示 3D 结构比对结果。与野生型透阿米尔 - 淀粉酶 3D 结构相比， 残基 x 和 y 中的 - 碳之间的均方根距离不多于约约约约或约 0026 附图简述 0027 并入附图在本说明书中， 并且它们构成本说明书的一部分并说明多个实施方案。 0028 图 1 描述了成熟形式 ( 即缺少信号序列 ) 的嗜热脂肪芽孢杆菌 - 淀粉酶 ( “MatAmyS” ： SEQ ID NO ： 10) 和成熟形式的 des-Met Ultrathi

26、n 淀粉酶 ( “MatUltrathin” ： SEQ ID NO ： 9) 之间的氨基酸序列比对和共有序列。 0029 图2描述了使用比色淀粉酶测试法(Magle Life Sciences)时多种 淀粉酶的相对活性。底物由带有化学连接的水溶性蓝色染料的水不溶性淀粉微球组成。淀 粉酶水解该淀粉， 从而释放通过 620nm 处吸收的变化所测量的蓝色染料。在 pH 7( 分图 A) 和 pH 10( 分图 B) 上检测培养上清液样品的稀释物系列。将任意单位的吸光度作为淀粉酶 试样的稀释的函数作图。分析了以下杂合淀粉酶 ： 0030 杂合体 A ： UT 1-104 ： AmyS 100-483

27、(SEQ ID NO ： 1) ； 0031 杂合体 B ： UT 1-113 ： AmyS 109-483(SEQ ID NO ： 2) ； 0032 杂合体 C ： UT 1-128 ： AmyS 140-483(SEQ ID NO ： 3) ； 0033 杂合体 D ： UT 1-145 ： AmyS 161-483(SEQ ID NO ： 4) ； 说 明 书 CN 102245764 A CN 102245770 A5/32 页 8 0034 杂合体 E ： UT 1-163 ： AmyS 203-483(SEQ ID NO ： 5) ； 0035 杂合体 F ： UT 1-175

28、： AmyS 215-483(SEQ ID NO ： 6) ； 0036 杂合体 G ： UT 1-191 ： AmyS 228-483(SEQ ID NO ： 7) ； 和 0037 杂合体 H ： UT 1-209 ： AmyS 246-483(SEQ ID NO ： 8)。 0038 图 3 描述了 des-Met Ultrathin 淀粉酶 (SEQ ID NO ： 9) 的氨基酸序列。粗体、 加下划线的氨基酸残基表示图 2 中所示的杂合体中 Ultrathin 部分的多个 C 端残基。将 UltrathinS 中的 “交换 (cross-over) 位置” 以粗体并加下划线显示。 0

29、039 图 4 描述了具有去掉淀粉结合结构域的 C 端截短的 AmyS 变体的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 11)。粗体、 加下划线的氨基酸残基表示图 2 中所示的杂合体中 AmyS 部分的 N 端残 基。将 AmyS 中的 “交换位置” 以粗体并加下划线显示。 0040 图 5A 描述了 AmyS 的两个立体视图， B- 结构域为黑体。B- 结构域后的圆球代表结 合的 Na+和 Ca2+的原子。 0041 图 5B 描述了 UT 1-104 ： AmyS 100-483 的两个立体视图， 残基 UT 1-104 为黑体。 B- 结构域后的圆球代表结合的 Na+和 Ca2+的原子。 0

30、042 图 5C 描述了 UT 1-209 ： AmyS 246-483 的两个立体视图， 残基 UT1-209 为黑体。 B- 结构域后的圆球代表结合的 Na+和 Ca2+的原子。 0043 发明详述 0044 提供了与野生型透阿米尔样 - 淀粉酶例如芽孢杆菌淀粉酶整体或部分地共享 保守 3D 结构的杂合 - 淀粉酶。在该杂合体中， 透阿米尔样 - 淀粉酶的 N 端部分用来自 古细菌 - 淀粉酶的序列替换。这两个淀粉酶之间的序列相似性可以小于 60。该杂合 体中保留野生型 3D 结构有利于获得有酶活性的淀粉酶。在一个实施方案中， 一个或两个淀 粉酶序列向 B 结构域贡献残基， 从而产生特别有

31、利的特性。例如， 用不结合 Ca2+的古细菌 - 淀粉酶的 B 结构域序列替换透阿米尔样 - 淀粉酶 B 结构域中的 Ca2+结合位点可以产 生在 Ca2+不存在下具有充分活性的杂合体。 0045 1. 定义和缩写 0046 根据这份详细的描述， 以下缩写和定义适用。应当指出如本文中所用， 单数形式 “一个” 、“一种” 和 “该” 包括复数称谓， 除非上下文另外清楚地指出并非如此。因此， 例如， 对 “一种酶” 的提及包括多种此类酶， 并且对 “该制剂” 的提及包括对本领域技术人员已知 的一种或多种制剂和其等同物的提及等。 0047 除非另外定义， 本文中所用的全部技术及科学术语具有与本领域

32、普通技术人员通 常所理解的相同意义。下文提供以下术语。 0048 1.1. 定义 0049 如本文中所用，“古细菌” 指与原核生物和真核生物明显不同的一个界的单细胞生 物。古细菌包括嗜热菌、 嗜盐菌和产甲烷菌。 0050 淀粉酶是切割淀粉中 -D-(1 4)O- 糖苷键的羟化酶并且包括葡糖淀粉酶和 - 淀粉酶以及 - 淀粉酶。然而， 为本公开的目的，“淀粉酶” 指 - 淀粉酶， 除非另外指 出并非如此。- 淀粉酶 (EC 3.2.1.1 ； -D-(1 4)- 葡聚糖葡聚糖水解酶 ) 定义为以随 机方式切割淀粉分子内部-D-(14)O-糖苷键的内切作用酶。 相反， 外切作用解淀粉酶， 如 -

33、淀粉酶 (EC 3.2.1.2 ； -D-(1 4)- 葡聚糖麦芽糖水解酶 ) 和一些产物特异性淀 说 明 书 CN 102245764 A CN 102245770 A6/32 页 9 粉酶如生麦芽糖 - 淀粉酶 (EC3.2.1.133) 从底物的非还原性末端切割淀粉分子。- 淀 粉酶、 - 葡糖苷酶 (EC3.2.1.20 ； -D- 葡糖苷葡萄糖水解酶 )、 葡糖淀粉酶 (EC 3.2.1.3 ； -D-(1 4)- 葡聚糖葡萄糖水解酶 ) 和产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的麦 芽低聚糖。 0051 “透阿米尔样” - 淀粉酶与野生型地衣芽孢杆菌 - 淀粉酶具有至少约 60序列

34、 同一性。 0052 “野生型” 酶指天然存在的酶。 “野生型透阿米尔样 - 淀粉酶” 因而指与野生型 地衣芽孢杆菌 - 淀粉酶具有至少约 60序列同一性的天然存在的 - 淀粉酶。 0053 通过使用在美国国家医学图书馆国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information(NCBI)of the National Library of Medicine) 的网站可获 得的 BLAST 程序， 以默认比对值比对两个序列并比较它们来确定 “序列同一性百分数” 。 0054 “变体” 或 “多个变体” 可以指多肽或核酸。出于本公开的目的，

35、“变体” 包括含有 来自两种不同亲本淀粉酶的氨基酸序列的杂合蛋白。术语 “变体” 可以与术语 “突变体” 可 互换地使用。与野生型序列相比， 变体分别包括在氨基酸或核苷酸序列中的一个或多个位 置处插入、 替换、 颠换、 截短和 / 或倒位。短语 “变体多肽” 和 “变体酶” 因此意指蛋白质， 其 具有来自野生型蛋白氨基酸序列的已经被修饰的氨基酸序列。 变体多肽包括与亲本酶具有 某个百分数例如至少约 80、 85、 90、 95或 99序列同一性的多肽。与野生型序列相 比， 变体可以具有 1、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20 或 30 个或在 1-30 范围内任意整数值的氨基酸置

36、换、 添加或缺失。变体可以表达为含有异源多肽的融合蛋白。例如， 变体可以包含另一种蛋 白质的信号肽或设计旨在辅助鉴定或纯化所表达融合蛋白的序列， 如 His 标签序列。 0055 术语 “融合蛋白” 指通过本领域已知的任意手段接合起来的两个或多个多肽。这 些手段包括化学合成法或通过重组工程剪接编码性核酸。 0056 如本文中所用， 术语 “杂合蛋白” 是特殊形式的融合蛋白。如同融合蛋白， 来自第 一蛋白质 ( 古细菌 - 淀粉酶 ) 的氨基酸序列与来自第二蛋白质 ( 透阿米尔样 - 淀粉 酶 ) 的氨基酸序列融合或接合以形成杂合蛋白。在本公开的杂合 - 淀粉酶中， 来自古细 菌 - 淀粉酶的第

37、一氨基酸序列替换透阿米尔样 - 淀粉酶的一部分， 同时保留透阿米尔 样 - 淀粉酶的所替换部分的全部或部分 3D 结构。衍生杂合淀粉酶的古细菌 - 淀粉酶 和 / 或透阿米尔样 - 淀粉酶可以是野生型淀粉酶的 “变体” 。 0057 “- 碳” 指多肽链中的主链碳， 是与羰基碳结合的碳。 0058 如本文中所用， 第一3D结构或折叠或其部分在比对结构从而-碳的均方根距离 (RMSD) 不多于约时与第二 3D 结构或其部分是 “在结构上保守的” 。还见 Orengo 等人， Protein Eng.6 ： 485-500(1993)。 0059 如本文中所用， 术语 “片段” 指多核苷酸序列或多

38、肽序列， 其小于全长并且是包含 两个或多个氨基酸或核酸残基 ( 例如， 5、 10、 15、 20、 30 或 50 个残基 ) 的序列。 0060 如本文中所用， 术语 “表达” 指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括 转录和翻译。 0061 “分离的” 意指该序列至少基本上不含与所述序列天然相关并存在于自然界中的 至少一种其他组分， 例如， 基因组序列。 0062 “纯化” 意指该物质处于相对纯的状态， 例如， 至少约90纯度， 至少约95纯度或 说 明 书 CN 102245764 A CN 102245770 A7/32 页 10 至少约 98纯度。 0063 “热稳定的” 意

39、指该酶在暴露于升高的温度后仍保留活性。酶的热稳定性由其半寿 期 (t1/2) 度量， 其中一半的酶活性在半寿期期间丧失。在定义的条件下通过测量残余淀粉 酶活性计算半寿期值。为测定酶的半寿期， 将样品加热至测试温度 1-10 分钟， 并且使用用 于该酶活性的标准测定法测量活性。 0064 如本文中所用，“氨基酸序列” 同义于术语 “多肽” 和 / 或术语 “蛋白质” 。在一些 情况下， 术语 “氨基酸序列” 同义于术语 “肽” ； 在一些情况下， 术语 “氨基酸序列” 同义于术 语 “酶” 。 0065 如本文中所用，“核苷酸序列” 或 “核酸序列” 指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和 其变体、 同

40、源物、 片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因组的、 合成的或重组来源的并且可 以是双链或单链， 无论代表有义或反义链。如本文中所用， 术语 “核苷酸序列” 包括基因组 DNA、 cDNA、 合成的 DNA 和 RNA。 0066 “同源物” 意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有某种程度序列同一性的 实体。 “同源序列” 包括与另一个序列具有某个百分比例如至少约 80、 85、 90、 95或 99的序列同一性的多核苷酸或多肽。一般而言， 同源物将包含与主题氨基酸序列相同的 活性部位残基。 虽然同源物可以具有与野生型酶不同的酶特性， 但是同源物也保留酶活性。 0067 如本文中所用，“杂交”

41、包括一条核酸链通过碱基配对作用与互补链结合的过程， 以及如聚合酶链反应 (PCR) 技术中那样所实施的扩增过程。变体核酸可以作为单链或双链 DNA 或 RNA、 RNA/DNA 异双链体或 RNA/DNA 共聚物存在。如本文中所用，“共聚物” 指同时包 含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的单条核酸链。 变体核酸可以进行密码子优化以进一步增 加表达。 0068 如本文中所用， 通过体外化学或酶促合成产生 “合成的化合物” 。 它包括， 但不限于 采用宿主生物如酵母细胞宿主或所选其他表达宿主的最佳密码子选择的情况下所产生的 变体核酸。 0069 如本文中所用，“转化细胞” 包括已经利用重组DNA技术转化

42、的细胞， 包括细菌细胞 和真菌细胞。转化一般通过一个或多个核苷酸序列插入细胞中发生。插入的核苷酸序列可 以是异源核苷酸序列， 即， 是对待转化细胞而言并非天然的序列， 如融合蛋白。 0070 如本文中所用，“有效连接” 意指所述组件处于允许它们以其意图方式发挥功能的 关系。 例如， 与编码序列有效连接的调节序列以这样的方式连接， 从而在与该调控序列相容 的条件下实现编码序列的表达。 0071 如本文中所用，“生物活性的” 指与天然存在序列具有相似的结构、 调节功能或生 物化学功能的序列， 尽管不必需是相同的程度。 0072 如本文中所用， 术语 “淀粉” 指由植物 ( 如谷物 ) 的复杂多糖碳

43、水化合物组成的任 何物质， 所述的复杂多糖碳水化合物由具有式 (C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉组成， 其中 X 可以是任意数字。 0073 1.2. 缩写 0074 除非另外说明， 使用以下缩写 ： 0075 说 明 书 CN 102245764 A CN 102245770 A8/32 页 11 0076 说 明 书 CN 102245764 A CN 102245770 A9/32 页 12 0077 2. 工程化具有保守 3D 结构的融合蛋白 0078 当融合不相似的氨基酸序列以产生杂合酶时， 特别当这两个序列在某结构域的中 央接合时， 结构域结构可能被破坏。结构域结构的破坏转而

44、可以导致更低的活性和 / 或蛋 白质折叠困难， 从而导致所表达的融合蛋白的产量损失。通过在来自第一蛋白质的氨基酸 序列与来自芽孢杆菌蛋白质的氨基酸序列之间选择适宜的融合位点解决这个该问题。即， 这两个序列在这两个淀粉酶序列的 3D 结构保守的位点处融合。以这种方式， 当这两个序列 在杂合酶中接合时， 发生最小的 3D 结构改变。另外， 这种方法促进构建有活性的杂合体， 即 便所述淀粉酶共享小于 60序列同一性时。 0079 两种蛋白质的结构比对结果可以用来确定全部或部分的 3D 结构是否在两种蛋白 质之间是保守的。为此目的， 第一蛋白质的 3D 结构可以叠加到第二蛋白质的 3D 结构上或 与之

45、比对。这种叠加或比对可以在整个蛋白质结构或二级结构元件范围内进行。例如， 可 说 明 书 CN 102245764 A CN 102245770 A10/32 页 13 以比对二级结构元件， 如 - 桶中的中央 - 链。叠加或比对结构的方法是本领域已知的。 在一个实施方案中， 用计算机执行的操作， 如 Chemical Computing Group 提供的分子运行 环境 (Molecular Operating Environment) 比对算法， 实行比对。在另一个实施方案中， 比 对的结果显示在计算机监视器或显示系统上。 0080 当比对两个结构时， 可以确定这两个结构的 - 碳链的比对

46、程度。选择结构上保 守的氨基酸。为本公开的目的， 第一 3D 结构或折叠在结构中 - 碳的 RMSD 不多于约 时是对第二 3D 结构 “在结构上保守” 。结构保守性可以延伸遍及至少两个或多个氨基酸残 基并且可以包括杂合淀粉酶中古细菌 - 淀粉酶贡献的整个部分。在一个实施方案中， 结 构保守的程度足够高， 以致 - 碳的 RMSD 不多于约 0081 杂合淀粉酶从 N 端至 C 端具有式 (I) 中所示的通式结构 ： 0082 A-x-y-B(I)， 0083 其中 A 是来自古细菌 - 淀粉酶的第一氨基酸序列， B 是来自野生型透阿米尔样 - 淀粉酶或其变体的第二氨基酸序列， x 是第一氨基

47、酸序列的 C 端残基， 并且 y 是第二氨 基酸序列的 N 端残基。在一个实施方案中， 至少残基 x 和 y 是对野生型透阿米尔样 - 淀 粉酶在结构上保守的。即， 残基 x 和 y 中 - 碳的 RMSD 不多于约在另一个实施方案 中， 残基 x 和 y 中 - 碳的 RMSD 不多于约 0084 与式 (I) 中 x 相对应的代表性氨基酸残基显示为图 3 中所述的粗体、 加下划线的 氨基酸残基。与式 (I) 中 y 相对应的代表性氨基酸残基显示为图 4 中所述的粗体、 加下划 线的氨基酸残基。残基 x 和 y 出现在 “交换位置 (cross-over positions)” 处。接合两种

48、 淀粉酶的序列以形成该杂合体的过程可以通过本领域已知的任意方法进行。例如， 氨基酸 序列可以通过氨基酸在多肽序列末端处的化学缀合作用接合。备选地， 编码性核酸可以重 组工程化设计以在表达宿主细胞中编码杂合蛋白。重组工程化的方法是本领域熟知的。例 如可以在目前可获得的任意实验手册如Sambrook等人， MOLECULAR： A LABORATORY MANUAL， 第3版， 冷 泉港实验室出版社， 冷泉港， 纽约 (Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， New York)(2001) 中找到适宜的方法。 0085 3.

49、 芽孢杆菌淀粉酶的结构域结构 0086 芽孢杆菌 - 淀粉酶由 3 个球状结构域 A、 B 和 C 构成。充分讨论见 WO 96/23874。 所述结构域可以定义为 ： 结构域 A 是第 1-103 和第 206-395 位残基， 结构域 B 是第 104-205 位残基， 并且结构域 C 是第 396-483 位残基， 编号参照地衣芽孢杆菌 - 淀粉酶。芽孢杆菌 - 淀粉酶是拉伸的分子， 最长轴是约垂直这个轴的最宽点是大约并且跨中央 A 结构域。地衣芽孢杆菌 - 淀粉酶的活性部位残基是 D323、 D231 和 E261。 0087 3.1. 结构域 A 0088 结构域 A 是最大的结构域并且含有活性部位， 其包含一簇在该酶表面的深裂口中 的 3 个氨基酸残基。全部已知 - 淀粉酶结构的结构域 A 均具有相同的总体折叠， 即， 具有 8 条中央 - 链和 8 个侧翼 - 螺旋的 (/)8桶。- 链 1 的 C 末端通过名为环 1 的一 个环与螺旋 1 连接， 并且其他环存在相同的模式。这些环显示尺寸上的某些变异， 并且一些 环可以是相当舒展的。 0089 (/)8桶中的 8 条中央 - 链在多种已知 - 淀粉酶结构中充分地叠加， 并且 该结构的这个部分， 包括位于-链C末端处的活性部位的密切环境， 在不同淀粉酶之间显